基因組DNA的提取

1、核酸的提取技術(shù)主要技術(shù)nDNA分子的分離和鑒定n切割技術(shù)n載體DNA分離、鑒定n宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞、酵母、真核細(xì)胞nDNA導(dǎo)入技術(shù)：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)n重組子鑒定：酶切、PCR技術(shù)n表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及活性測(cè)定目的基因 載體DNA(限制性內(nèi)切酶切開)宿主細(xì)胞重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞繁殖陽性克隆株表 達(dá)基因克隆示意圖目的基因載體DNA+dGTP+dCTPPolyGPolyC3333一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理1、核酸的分類、核酸的分類l DNA DNA 主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNADNA，如線粒體如線粒體DNADNA（mtDNAmtDNA），葉綠體）

2、，葉綠體DNADNA（cpDNAcpDNA），質(zhì)粒），質(zhì)粒DNADNA。l RNARNA 存在于細(xì)胞質(zhì)中，如存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含噬菌體，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。l分離純化核酸總的原則：分離純化核酸總的原則： 應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性； 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。l核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求： 核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制

3、作用的有機(jī)溶劑和過高核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；濃度的金屬離子； 其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。2、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理l核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng): : 盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程。盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程。 減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。 減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫 防止核酸的生物降解。防止核酸的生物降解。 3、

4、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理l核酸制備的步驟：核酸制備的步驟：I. I.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備II.II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中l(wèi)核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和抑制劑 降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。 對(duì)于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機(jī)械張力拉斷則更重要。 對(duì)于RNA，因分子較小

5、，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。4、核酸制備的一般方法和原理、核酸制備的一般方法和原理一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理l核酸酶的抑制和抑制劑 DNase抑制 加入少量金屬離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。 去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。l核酸酶的抑制和抑制劑 RNase抑制 操作要帶手套。 所有器皿要嚴(yán)格消毒， 試劑處理 低溫操作 在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。 l核酸制備中常用的去垢劑核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核

6、酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來； 3對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用。如：如：SDSSDS、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、4-4-氨基水楊酸鈉、萘氨基水楊酸鈉、萘-1.5-1.5-二磺酸鈉、二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉三異丙基萘磺酸鈉l核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑 蛋白質(zhì)變性劑的作用：蛋白質(zhì)變性劑的作用： 1. 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。成蛋白污染。 2.2.使蛋白質(zhì)變

7、性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 3.3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNaseRNase活性和破裂細(xì)胞的作用?；钚院推屏鸭?xì)胞的作用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、0.1%DEPC-0.1%DEPC-焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 l核酸制備中常用的酶核酸制備中常用的酶 DNaseDNase RNase RNase 蛋白酶蛋白酶K K 溶菌酶溶菌酶 l核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程1 1）破碎細(xì)胞）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用） 微生物微生物：溶菌酶、：溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。 高等植物

8、高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。：搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。 動(dòng)物動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器破碎。：液氮處理后用勻漿器破碎。 細(xì)胞器細(xì)胞器DNADNA：首先純化細(xì)胞器。：首先純化細(xì)胞器。 以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑l核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程2 2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)）破碎抽提核酸除去雜質(zhì) 1 1首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與 其它成分分離其它成分分離 2 2使核

9、酸與蛋白質(zhì)分離使核酸與蛋白質(zhì)分離 3 3除去脂類除去脂類 4 4多糖的除去多糖的除去l核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程 3 3）核酸的純化）核酸的純化 根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染染, ,并除去提取過程中的系列試劑并除去提取過程中的系列試劑( (鹽、有機(jī)溶劑鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。 4 4）核酸樣品的保存）核酸樣品的保存核酸保存的主要條件是核酸保存的主要條件是溫度溫度和和介質(zhì)介質(zhì) 溫度溫度： 44（55）最佳和最簡(jiǎn)單）最佳和最簡(jiǎn)單 -70-70是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存是長(zhǎng)期保

10、存的良好溫度，為一次性保存 -20-20保存保存 保存介質(zhì)保存介質(zhì)： TETE緩沖溶液緩沖溶液( (最常用最常用) ) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0二、材料、設(shè)備及試劑二、材料、設(shè)備及試劑 菌種菌種 ：DBT降解菌設(shè)備設(shè)備 ：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)， 臺(tái)式高速離心機(jī)， 渦旋振蕩器試劑：試劑：LB液體培養(yǎng)基 、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5M NaCl 、T

11、ris-飽和酚、氯仿、RNA酶A 、無水乙醇 1、1.5ml菌液（每組兩管）4 12000rpm離心30sec，棄去上清，倒置試管于吸水紙上吸干。2、每管加入400l裂解液，用移液槍槍頭反復(fù)抽吸輔助裂解，37 水浴30min。3、每管加入132l的5M NaCl溶液，顛倒試管，充分混勻后，13000rpm離心15min。用粗口的槍頭（用剪刀剪去1ml槍頭的尖端）小心取出上清液轉(zhuǎn)倒兩支新的eppendorf管中。4、加入等體積的飽和苯酚，充分混勻后，12000rpm離心3min，離心后的水層如混濁則說明仍含有蛋白質(zhì)，則需將上清液轉(zhuǎn)入新的試管，重復(fù)上述步驟直到水層透明，水層和酚層之間不再白色沉淀物

12、為止（約2次）。三、操作步驟三、操作步驟5、將上層清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管，加等體積的氯仿，混勻后13000rpm離心3min，除去苯酚。6、小心吸出上清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管，用預(yù)冷的兩倍體積的無水乙醇沉淀，放置20冰箱30min，然后13000rpm離心15min，可見白色絲狀沉淀物。7、小心吸出液體，棄上清液，用預(yù)冷的400l 70乙醇洗滌2次，室溫干燥后，用50lTE （含20g/ml的Rnase）溶解DNA，20冰箱放置備用。 最好使用新鮮材料，低溫保最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融存的樣品材料不要反復(fù)凍融 提取血液基因組提取血液基因組DNADNA時(shí)，

13、要時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞） 組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)造成否則會(huì)造成DNADNA降解降解 含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量含量較少，提取前先富集較少，提取前先富集 材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNADNA量量少，純度低少，純度低 針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶K K細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠 高溫

14、溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩 采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DNADNA時(shí)，應(yīng)提時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系供相應(yīng)的緩沖體系 采用有機(jī)（酚采用有機(jī)（酚/ /氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔動(dòng)作要輕柔 離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間 針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法應(yīng)的去雜質(zhì)的方法 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀會(huì)更充分 沉淀時(shí)加入沉淀時(shí)加入1/101/1

15、0體積的體積的NaAcNaAc（pH5.2pH5.2，3M3M），有利），有利于充分沉淀于充分沉淀 沉淀后應(yīng)用沉淀后應(yīng)用7070的乙醇洗滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干晾干DNADNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥），讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TETE緩沖液溶解緩沖液溶解TETE中的中的EDTAEDTA能螯和能螯和MgMg2+2+或或MnMn2+2+離子，抑制離子，抑制DNaseDNasepHpH值為值為8.08.0，可防止，可防止DNADNA發(fā)生酸解發(fā)生酸解 DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)多糖、多酚類雜質(zhì)DNA

16、DNA在溶解前，有在溶解前，有酒精殘留，酒精抑酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)制后續(xù)酶解反應(yīng)DNADNA中殘留有金屬中殘留有金屬離子離子重新純化重新純化DNADNA，去，去除蛋白、多糖、多酚除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)等雜質(zhì)重新沉淀重新沉淀DNADNA，讓，讓酒精充分揮發(fā)酒精充分揮發(fā)增加增加7070乙醇洗滌乙醇洗滌的次數(shù)（的次數(shù)（2-32-3次）次）q問題一：?jiǎn)栴}一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。 原原因因?qū)?duì)策策材料不新鮮或反復(fù)凍材料不新鮮或反復(fù)凍融融未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶的活性提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇烈，烈

17、，DNADNA被機(jī)械打斷被機(jī)械打斷外源核酸酶污染外源核酸酶污染反復(fù)凍融反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的的DNADNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌溫滅菌將將DNADNA分裝保存于緩沖液中，避免分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融反復(fù)凍融q問題二：?jiǎn)栴}二：DNADNA降解降解對(duì)對(duì)策策 原原因因?qū)嶒?yàn)材料不佳或量少實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗滌時(shí)洗滌