DNA酶切及凝膠電泳

1、DAN酶切及凝膠電泳酶切及凝膠電泳DNA限制性內(nèi)切酶的酶切分析限制性核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子特定的核甘酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類DNA水解酶，是體外剪切基因片段的重要工具，常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。限制性核算內(nèi)切酶的相關(guān)知識：1. 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象2. 核酸限制性內(nèi)切酶的類型及基本特性3. 同裂酶和同尾酶4. 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素1. 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是提高自身的防御能力。限制酶限制外源

2、DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞自身的DNA不受影響，因?yàn)檫@種細(xì)胞還合成了一種修飾酶，對自身的DNA進(jìn)行了修飾，限制性酶對修飾過的DNA不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。2.核酸限制性內(nèi)切酶的類型及基本特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：型、型、型。型型：限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。這類酶如：EcoB 、EcoK等。型型：限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。這類限制酶識別的專一核苷酸順序常見的是4至

3、6個(gè)核苷酸，其識別順序是一個(gè)回文對稱順序回文對稱順序，即有一個(gè)中心對稱軸。型酶的切割有兩種方式，分別生成平頭末端、粘性末端。平頭末端平頭末端：在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端，這種末端可以通過DNA連接酶連接起來。例如EcoRV的識別位置是：5GATATC33CTA TAG5粘性末端粘性末端：是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，其斷裂的磷酸二酯鍵和氫鍵可通過DNA連接酶連接起來。例如：EcoRI的識別順序5GAA TT_C33C_TT AAG5型型：限制性內(nèi)切酶有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序，在識別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對的固定位置上切割雙鏈，切割

4、后產(chǎn)生的一定長度D N A 片 段 ， 具 有 各 種 單 鏈 末 端 。 結(jié)論：結(jié)論：型限制性內(nèi)切酶的特性使它在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，是重組DNA的基礎(chǔ)。3.同裂酶和同尾酶同裂酶同裂酶：有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，其差別只在于當(dāng)識別順序中有甲基化的核苷酸甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。這些有相同切點(diǎn)的酶稱為同裂酶。同尾酶同尾酶：有時(shí)兩種酶切割順序不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶，可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)可能會產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。4.影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素a.

5、 DNA的純化b. DNA的甲基化程度c. 酶切消化反應(yīng)的溫度d. DNA的分子結(jié)構(gòu)e. 溶液中離子濃度及種類f. 緩沖液的PH值用途用于DNA基因組物理圖譜的組建；基因的定位和基因分離；DNA分子堿基序列分析；比較相關(guān)的DNA分子和遺傳工程。電泳概述帶電質(zhì)點(diǎn)在電場中向與其相反的電極進(jìn)行泳動的現(xiàn)象，稱為電泳或離子泳?；驹砘驹恚航惶嫒芤褐械牡鞍踪|(zhì)、肽都具有可解離的基團(tuán)，在溶液中形成帶正電荷或帶負(fù)電荷或咪唑基的質(zhì)點(diǎn)。在酸性溶液中，由于 H+濃度較大，它能抑制蛋白質(zhì)分子中的羥基解離出 H+，使更多的-NH2接受 H+形成-NH2+，因此，在酸性溶液中，蛋白質(zhì)帶有較多的正電荷，在外加電場中，向

6、負(fù)極移動；反之，在堿性溶液中，氫氧根離子中和羥基中的氫離子，蛋白質(zhì)帶有較多的負(fù)電荷，在外電場作用下，向正極移動。分類分類：按照分離原理的不同，可分為：區(qū)帶電泳、移界電泳、等速電泳、等電聚焦電泳應(yīng)用應(yīng)用：生物學(xué)上的可移動大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)及核酸等，具有可以電離的基團(tuán)，在具有一定pH值的溶液中，能夠形成帶電荷的陽離子和陰離子，通過電泳方法可以將處于同一體系的不同組分分開。凝膠電泳技術(shù) 凝膠電泳是以各種具有網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)的凝膠為支持物的電泳技術(shù)。同時(shí)，凝膠電泳具有電泳和分子篩的雙重作用，有很高的分辨能力。凝膠電泳的支持介質(zhì)一般有以下幾種：（1）淀粉凝膠（2）瓊脂糖凝膠，適用于分離大分子核；

7、（3）聚丙烯酰胺凝膠，普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。 凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)(1) 樣品不易擴(kuò)散(2) 制備簡單，時(shí)間短；(3) 將分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，提高分辨能力； (4) 需要合成用的原料純凈，制成的多聚物的再現(xiàn)性高，因此樣品分離的重復(fù)性也比較高； (5) 可以隨意控制凝膠濃度，按需要可制作不同孔徑的凝膠；(6) 一定濃度范圍內(nèi)透明性好，機(jī)械輕度好，有彈性；(7) 鏈上具有不活潑的酰胺基，沒有帶電的其他離子基，所以電泳時(shí)不會產(chǎn)生電滲；(8) 用途廣泛，可以對核酸、蛋白質(zhì)等生物高分子進(jìn)行分離、定量、定性、分子量的測定；(9) 需要樣品量少，1-100g 已經(jīng)足夠。瓊脂糖凝膠電泳

8、 瓊脂電泳是用瓊脂糖或優(yōu)質(zhì)瓊脂粉作支持物的一種電泳方法。該法主要用于研究核酸等大分子物質(zhì)，是分子生物學(xué)中不可缺少的研究手段之一。用瓊脂糖膠分離雙鏈 DNA時(shí)，其遷移率大小，主要與樣品的相對分子質(zhì)量有關(guān)，而與核酸的一級結(jié)構(gòu)一級堿基的組成無關(guān)。利用瓊脂糖電泳分離和分析蛋白質(zhì)和核酸的基本原理是電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)及分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)。 以瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)為例，待測 DNA 片段與已知濃度的DNA片段同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)結(jié)合的溴化乙錠熒光強(qiáng)度，分析其含量： 1. 原理原理溴化乙錠(EB)在紫外線照射下能夠發(fā)射熒光。當(dāng) DNA 樣品在含有適量 EB 的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳時(shí)，其中插入到 DNA 分子中的

9、EB 與之形成熒光混合物，使 DNA 發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍。熒光強(qiáng)度與 DNA 含量成正比關(guān)系。為了能夠比較出待測樣品的濃度，只需把已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為瓊脂糖凝膠電泳的對照。用肉眼可以檢測到0.010.1mg DNA，薄層分析掃描儀可以檢測到 510ng DNA。2.儀器紫外投射反射分析儀，電泳槽，電泳儀。圖1 電泳槽圖2 電泳儀電源3.試劑試劑(1) 6*上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，40%（W/V）蔗糖水溶液； (2) 50*TAE電泳緩沖液：Trish 堿 242g，冰乙酸 57.1ml，0.5mol/L EDTA100ml，加水溶解后定量 1000ml； (3) 5mg/ml EB（

10、溴化乙錠）：0.5g EB，100ml 雙蒸水。4.操作步驟操作步驟(1) 稱取 1g 瓊脂糖凝膠干粉，加 100ml 1*TAE 電泳緩沖液，加熱使瓊脂糖熔化均勻，取出后室溫冷卻至 5060；（制作凝膠液） (2) 將膠倒入制膠槽中，并插入樣品梳，待充分凝固后拔出樣品梳；（插梳子） (3) 將凝膠板放入電泳槽中，加入 1*TAE 電泳緩沖液，使液面略高于凝膠 1*TAE電泳緩沖液；（加電泳緩沖液） (4) 5l DNA 樣品加 1l 6*凝膠加樣緩沖液，攪拌均勻后全部加入凝膠板的樣品孔中；在另一加樣孔中加 5l 已知片段大小的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)溶液；（上樣）(5) 打開電源開關(guān)，電壓 100V，電泳約