實(shí)驗(yàn)三 病原細(xì)菌的鑒定與藥物敏感性(大)

1、1實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 病原細(xì)菌的分離、鑒定與毒力分析病原細(xì)菌的分離、鑒定與毒力分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康? 1掌握無(wú)菌操作條件下致病菌的分離方法與程序；掌握無(wú)菌操作條件下致病菌的分離方法與程序；2 2了解細(xì)菌鑒定的方法，熟悉細(xì)菌常用的生理生化反應(yīng)及原理。了解細(xì)菌鑒定的方法，熟悉細(xì)菌常用的生理生化反應(yīng)及原理。2二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 1. 平板劃線法分離病原細(xì)菌；平板劃線法分離病原細(xì)菌；2 2病原細(xì)菌的形態(tài)與生理生化鑒定；病原細(xì)菌的形態(tài)與生理生化鑒定；3 3病原細(xì)菌的人工感染（課外選作實(shí)驗(yàn)）。病原細(xì)菌的人工感染（課外選作實(shí)驗(yàn)）。3三、主要儀器及試材三、主要儀器及試材顯微鏡，解剖鏡，解剖用具，包

2、括解剖盤(pán)、解剖刀、解剖針、大小手術(shù)剪、顯微鏡，解剖鏡，解剖用具，包括解剖盤(pán)、解剖刀、解剖針、大小手術(shù)剪、大小鑷子，培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、紗布等。大小鑷子，培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、紗布等。蒸餾水、魚(yú)用生理鹽水，蒸餾水、魚(yú)用生理鹽水，70%70%的乙醇、的乙醇、BHIBHI培養(yǎng)基、生化管等。培養(yǎng)基、生化管等。人工感染嗜水氣單胞菌的魚(yú)，未知病原菌感染的魚(yú)人工感染嗜水氣單胞菌的魚(yú)，未知病原菌感染的魚(yú)（剪掉部分背鰭或腹鰭（剪掉部分背鰭或腹鰭作為標(biāo)記作為標(biāo)記) )。4四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（一）（一） 病原細(xì)菌的分離病原細(xì)菌的分離1 1無(wú)菌操作打開(kāi)病魚(yú)的腹腔：無(wú)菌操作打開(kāi)病魚(yú)的腹腔：2 2

3、細(xì)菌劃線接種：細(xì)菌劃線接種：3 3培養(yǎng)與觀察：培養(yǎng)與觀察：（二）病原細(xì)菌的革蘭氏染色（二）病原細(xì)菌的革蘭氏染色分別取嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和個(gè)人分離的未知菌株進(jìn)行分別取嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和個(gè)人分離的未知菌株進(jìn)行革蘭氏染色，記錄結(jié)果。革蘭氏染色，記錄結(jié)果。5四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（三）病原細(xì)菌的生理生化鑒定（三）病原細(xì)菌的生理生化鑒定分別測(cè)定分別測(cè)定分離菌分離菌和和嗜水氣單胞菌嗜水氣單胞菌的的1212種生化指標(biāo)：氧化酶，吲哚實(shí)驗(yàn)，種生化指標(biāo)：氧化酶，吲哚實(shí)驗(yàn)，VPVP，H H2 2S S，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，精氨酸雙水解酶性，七葉苷，賴氨酸脫羧酶，山梨醇，

4、蔗糖，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，精氨酸雙水解酶性，七葉苷，賴氨酸脫羧酶，山梨醇，蔗糖，纖維二糖，明膠。纖維二糖，明膠。取生化管于距離內(nèi)容物上方取生化管于距離內(nèi)容物上方2cm2cm處用砂輪割開(kāi)，迅速于酒精燈火焰消毒，處用砂輪割開(kāi)，迅速于酒精燈火焰消毒，然后接種菌株，以然后接種菌株，以封口膜封口膜或液體石蠟封口，置或液體石蠟封口，置3535孵育，依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。孵育，依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。6四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（四）病原細(xì)菌的毒力分析（四）病原細(xì)菌的毒力分析1 1實(shí)驗(yàn)魚(yú)：實(shí)驗(yàn)魚(yú)：實(shí)驗(yàn)環(huán)境下暫養(yǎng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境下暫養(yǎng)7-107-10天。每組不少于天。每組不少于5050條條，設(shè)不少于，設(shè)不少于3 3個(gè)平行重復(fù)。

5、個(gè)平行重復(fù)。2 2菌懸液制備：菌懸液制備：液體培養(yǎng)基增殖，用無(wú)菌生理鹽水懸浮。經(jīng)計(jì)數(shù)后采用等對(duì)數(shù)間距設(shè)計(jì)約液體培養(yǎng)基增殖，用無(wú)菌生理鹽水懸浮。經(jīng)計(jì)數(shù)后采用等對(duì)數(shù)間距設(shè)計(jì)約5 5個(gè)感染劑量個(gè)感染劑量進(jìn)行感染試驗(yàn)。對(duì)照組以無(wú)菌生理鹽水。進(jìn)行感染試驗(yàn)。對(duì)照組以無(wú)菌生理鹽水。3 3注射方法：注射方法：感染前實(shí)驗(yàn)魚(yú)用感染前實(shí)驗(yàn)魚(yú)用MS-222MS-222麻醉，用濕毛巾裹住魚(yú)體頭部。麻醉，用濕毛巾裹住魚(yú)體頭部。（1 1）腹腔注射：腹鰭基部無(wú)鱗片處。）腹腔注射：腹鰭基部無(wú)鱗片處。（2 2）肌肉注射：背鰭前端與側(cè)線之間的中部區(qū)域。）肌肉注射：背鰭前端與側(cè)線之間的中部區(qū)域。7四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

6、（四）藥物敏感性實(shí)驗(yàn)（四）藥物敏感性實(shí)驗(yàn)（一）紙片擴(kuò)散法（一）紙片擴(kuò)散法 1.1.原理：原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的濃度梯度遞減的濃度梯度，細(xì)菌的生長(zhǎng)被抑，細(xì)菌的生長(zhǎng)被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，即抑菌圈愈大，藥制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，即抑菌圈愈大，藥物敏感性越強(qiáng)。物敏感性越強(qiáng)。8四、實(shí)驗(yàn)

7、方法與步驟四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟2.2.實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 1 1）倒平板）倒平板 2 2）菌懸液制備：）菌懸液制備：挑取斜面中菌苔于少量生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將菌液濃度調(diào)到挑取斜面中菌苔于少量生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將菌液濃度調(diào)到1 1* *107 107 cfu/mLcfu/mL。以玻璃刮鏟將。以玻璃刮鏟將0.1mL0.1mL細(xì)菌懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面；細(xì)菌懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面； 3 3）貼片：）貼片：將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片

8、。為了能準(zhǔn)確觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了能準(zhǔn)確觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上（在平皿中均勻貼四片）；分布于平皿培養(yǎng)基上（在平皿中均勻貼四片）； 4 4）培養(yǎng)：）培養(yǎng)：2828溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)24 h24 h，記錄結(jié)果；，記錄結(jié)果；9四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟結(jié)果觀察：抑菌圈直徑大小與藥物濃度、細(xì)菌濃度有直接關(guān)系，觀察抑菌圈的有無(wú)。若有抑菌結(jié)果觀察：抑菌圈直徑大小與藥物濃度、細(xì)菌濃度有直接關(guān)系，觀察抑菌圈的有無(wú)。若有抑菌圈，則測(cè)量抑菌圈直徑；若無(wú)抑菌圈，則說(shuō)明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。圈，則測(cè)量抑菌圈直徑；若無(wú)抑菌圈，則

9、說(shuō)明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。 抑菌圈直徑抑菌圈直徑15mm 15mm 高度敏感高度敏感 抑菌圈直徑抑菌圈直徑10-15mm 10-15mm 中度敏感中度敏感 抑菌圈直徑抑菌圈直徑10mm 10mm 低度敏感低度敏感 無(wú)抑菌圈無(wú)抑菌圈 不敏感或耐藥不敏感或耐藥氟：氟：7575g/mLg/mL；恩：；恩：5 5 g/mL g/mL 磺：磺：300300g/mLg/mL；青：；青：10IU/mL10IU/mL10磺磺氟氟靑靑嗯嗯12四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（二）肉湯試管稀釋法（二）肉湯試管稀釋法 1.1.原理：原理：以肉湯液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后接入待檢菌，定量測(cè)定以肉湯液

10、體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后接入待檢菌，定量測(cè)定抗菌藥物對(duì)被測(cè)菌的最低抑菌濃度（抗菌藥物對(duì)被測(cè)菌的最低抑菌濃度（MICMIC）。）。 2.2.實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 1 1）菌液準(zhǔn)備：）菌液準(zhǔn)備：挑取金黃色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將挑取金黃色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將菌液濃度調(diào)到菌液濃度調(diào)到1 1* *107cfu/mL107cfu/mL備用；備用；13四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟2 2）抗菌藥物稀釋（硫酸慶大霉素注射液）：）抗菌藥物稀釋（硫酸慶大霉素注射液）：配制藥物原液濃度為配制藥物原液濃度為8 8萬(wàn)萬(wàn)IU/mLIU/mL（8

11、0mg/mL80mg/mL），），0.45 0.45 m m濾器除菌。濾器除菌。 準(zhǔn)備準(zhǔn)備1111支支2 mL2 mL無(wú)菌無(wú)菌EPEP管編號(hào)管編號(hào)010010排好，在排好，在0 0號(hào)管和號(hào)管和1 1號(hào)管中加號(hào)管中加1.8 mL1.8 mL無(wú)菌生理鹽水，無(wú)菌生理鹽水，210210號(hào)管加號(hào)管加1 mL1 mL； 吸取吸取0.2 mL0.2 mL藥原液加入第一支藥原液加入第一支EPEP管中混勻，從第一支試管中吸取管中混勻，從第一支試管中吸取0.2 mL0.2 mL加入第二支加入第二支EPEP管混勻，然后吸管混勻，然后吸取取1 mL1 mL加入第三支混勻加入第三支混勻以此類推，直到第十一支；以此類推，

12、直到第十一支； 取取1212支滅過(guò)菌的玻璃試管編號(hào)支滅過(guò)菌的玻璃試管編號(hào)1-121-12排好，各加入排好，各加入1.8mL1.8mL滅過(guò)菌的培養(yǎng)液，然后從編號(hào)相對(duì)應(yīng)的滅過(guò)菌的培養(yǎng)液，然后從編號(hào)相對(duì)應(yīng)的EPEP管中管中吸取稀釋過(guò)的藥液再做吸取稀釋過(guò)的藥液再做1010倍比稀釋。倍比稀釋。14四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟3 3）接種：）接種：每只試管中加入每只試管中加入0.1ml0.1ml的菌液；的菌液； 4 4）培養(yǎng)：）培養(yǎng)：置置3737溫箱，培養(yǎng)溫箱，培養(yǎng)24h24h；5 5）結(jié)果觀察：）結(jié)果觀察：肉眼觀察，以不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該藥對(duì)測(cè)試菌的肉眼觀察，以不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)

13、的最低藥物濃度為該藥對(duì)測(cè)試菌的MICMIC。根據(jù)結(jié)果換算出最小抑菌濃度（根據(jù)結(jié)果換算出最小抑菌濃度（g/mLg/mL）。）。8000 800 400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78無(wú)菌生理鹽水無(wú)菌生理鹽水1.8mL0.2mL抗生素抗生素8萬(wàn)萬(wàn)/mL 下排培養(yǎng)液每管下排培養(yǎng)液每管1.8mL對(duì)應(yīng)加對(duì)應(yīng)加0.2mL 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.6 0.3 0.15 00.816五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 分離、接種時(shí)嚴(yán)格按照無(wú)菌操作要求進(jìn)行。分離、接種時(shí)嚴(yán)格按照無(wú)菌操作要求進(jìn)行。 革蘭氏染色過(guò)程中涂片務(wù)求均勻，切忌過(guò)厚，染色過(guò)

14、程中不可使染液干涸。革蘭氏染色過(guò)程中涂片務(wù)求均勻，切忌過(guò)厚，染色過(guò)程中不可使染液干涸。 藥敏實(shí)驗(yàn)，在貼片時(shí)用無(wú)菌鑷子輕輕觸壓藥物紙片，使之與培養(yǎng)基充分接觸，貼片藥敏實(shí)驗(yàn)，在貼片時(shí)用無(wú)菌鑷子輕輕觸壓藥物紙片，使之與培養(yǎng)基充分接觸，貼片后不能再更改紙片位置；鑷取藥物紙片時(shí)一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切后不能再更改紙片位置；鑷取藥物紙片時(shí)一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切勿鑷起重新放置，以防不同抗生素交叉影響。勿鑷起重新放置，以防不同抗生素交叉影響。17六、實(shí)驗(yàn)安排六、實(shí)驗(yàn)安排1-41-4節(jié)節(jié)(1)(1)配培養(yǎng)基（固體、液體分裝），包培養(yǎng)皿（配培養(yǎng)基（固體、液體分裝），包培養(yǎng)皿（1010包），配制生理鹽水，滅菌（包），配制生理鹽水，滅菌（4 4瓶）；瓶）；(2)(2)完成細(xì)菌染色、觀察和生化指標(biāo)測(cè)定；完成細(xì)菌染色、觀察和生化指標(biāo)測(cè)定；4-84-8節(jié)節(jié)(1)(1)倒平板接種貼紙；倒平板接種貼紙；(2)(2)藥液稀釋接種；（藥液稀釋接種；（3 3）第二天早上看結(jié)果。）第二天早上看結(jié)果。18七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告（一）七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告（一）1 1記錄菌落特征、細(xì)菌形態(tài)、染色結(jié)果和生理生化結(jié)果（記錄菌落特征、細(xì)菌形態(tài)、染色結(jié)果和生理生化結(jié)果（3030分）。分）。2 2，據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征和生化指標(biāo)初步鑒定分離自患病魚(yú)的細(xì)菌種類（，據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征和生化指標(biāo)初步鑒定分離自患病魚(yú)的細(xì)菌種類（2020分