基因芯片潘麗華2014808100

1、基因芯片技術(shù)及其應(yīng)用基因芯片技術(shù)及其應(yīng)用潘麗華20148081001. 1. 什么是基因芯片什么是基因芯片 生物芯片，將大量生物識別分子按預(yù)先設(shè)置的排列生物芯片，將大量生物識別分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體（如硅片、玻片及高聚物載體等）固定于一種載體（如硅片、玻片及高聚物載體等）表面，利用生物分子的特意性親和反應(yīng)，如核酸雜表面，利用生物分子的特意性親和反應(yīng)，如核酸雜交反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)等來分析各種生物分子存在交反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)等來分析各種生物分子存在的量的一種技術(shù)。的量的一種技術(shù)?；蛐酒ɑ蛐酒╣ene chipgene chip），又稱），又稱DNADNA微陣列微陣列（micro

2、arraymicroarray），是由大量），是由大量DNADNA或寡核苷酸探針密或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過雜交檢測信息。過雜交檢測信息。五十年代五十年代DNA分子結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制模型的建立分子結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制模型的建立六十年代基因編碼的確定六十年代基因編碼的確定七十年代限定性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和七十年代限定性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和DNA重組技術(shù)的建立重組技術(shù)的建立八十年代八十年代PCR的發(fā)明的發(fā)明九十年代人類基因組計(jì)劃的實(shí)施九十年代人類基因組計(jì)劃的實(shí)施 2.基因芯片的誕生基因芯片的誕生 生物科學(xué)正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學(xué)。生物

3、科學(xué)正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學(xué)。我們正由結(jié)構(gòu)基因組時(shí)代邁入功能基因組時(shí)代。隨我們正由結(jié)構(gòu)基因組時(shí)代邁入功能基因組時(shí)代。隨著這個(gè)功能基因組學(xué)問題的提出（后基因組時(shí)代，著這個(gè)功能基因組學(xué)問題的提出（后基因組時(shí)代，蛋白組學(xué)），涌現(xiàn)出許多功能強(qiáng)大的研究方法和研蛋白組學(xué)），涌現(xiàn)出許多功能強(qiáng)大的研究方法和研究工具，最突出的就是細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳究工具，最突出的就是細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應(yīng)的質(zhì)譜法測蛋白分子量）和基）（及相應(yīng)的質(zhì)譜法測蛋白分子量）和基因芯片（因芯片（Genechip）技術(shù)）技術(shù) 分子生物學(xué)的發(fā)展推動(dòng)了基因的研究分子生物學(xué)的發(fā)展推動(dòng)了基因的研究美國繼開展人類基因組計(jì)

4、劃以后，于美國繼開展人類基因組計(jì)劃以后，于19981998年正式啟動(dòng)基因芯片年正式啟動(dòng)基因芯片計(jì)劃，美國國立衛(wèi)生部、能源部、商業(yè)部、司法部、國防部、計(jì)劃，美國國立衛(wèi)生部、能源部、商業(yè)部、司法部、國防部、中央情報(bào)局等均參與了此項(xiàng)目。中央情報(bào)局等均參與了此項(xiàng)目。同時(shí)斯坦福大學(xué)、麻省理工學(xué)院及部分國立實(shí)驗(yàn)室如同時(shí)斯坦福大學(xué)、麻省理工學(xué)院及部分國立實(shí)驗(yàn)室如Argonne Argonne OakridgeOakridge也參與了該項(xiàng)目的研究和開發(fā)。也參與了該項(xiàng)目的研究和開發(fā)。英國劍橋大學(xué)、歐亞公司正在從事該領(lǐng)域的研究。英國劍橋大學(xué)、歐亞公司正在從事該領(lǐng)域的研究。世界大型制藥公司尤其對基因芯片技術(shù)用于基因

5、多態(tài)性、疾病世界大型制藥公司尤其對基因芯片技術(shù)用于基因多態(tài)性、疾病相關(guān)性、基因藥物開發(fā)和合成或天然藥物篩選等領(lǐng)域感興趣，相關(guān)性、基因藥物開發(fā)和合成或天然藥物篩選等領(lǐng)域感興趣，都已建立了或正在建立自己的芯片設(shè)備和技術(shù)。都已建立了或正在建立自己的芯片設(shè)備和技術(shù)。目前全世界有幾百家基因芯片公司，有多種生物芯片問世，而目前全世界有幾百家基因芯片公司，有多種生物芯片問世，而且這些芯片的特點(diǎn)較以前密度更高，檢測方法更精確，特異性且這些芯片的特點(diǎn)較以前密度更高，檢測方法更精確，特異性更強(qiáng)的特點(diǎn)。而主要仍以少數(shù)幾家公司為主，如更強(qiáng)的特點(diǎn)。而主要仍以少數(shù)幾家公司為主，如AffymetrixAffymetrix、

6、BraxBrax、HysepHysep等。等。國內(nèi)目前主要如清華大學(xué)（程京）、中科院生命科學(xué)院、上海國內(nèi)目前主要如清華大學(xué)（程京）、中科院生命科學(xué)院、上海復(fù)旦大學(xué)、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、南京東南大學(xué)、西安等四十復(fù)旦大學(xué)、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、南京東南大學(xué)、西安等四十余家公司，而且可能還有一大批公司相繼成立。余家公司，而且可能還有一大批公司相繼成立。 基因芯片是信息時(shí)代的產(chǎn)物基因芯片是信息時(shí)代的產(chǎn)物生命科學(xué)、生命科學(xué)、 物理學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、微電子技術(shù)計(jì)算機(jī)科學(xué)、微電子技術(shù)光電技術(shù)、光電技術(shù)、 材料科學(xué)材料科學(xué) 等現(xiàn)代高科技等現(xiàn)代高科技3.3.基因芯片的分類基因芯片的分類根據(jù)探針的類型和長度，

7、基因芯片可分為兩類。根據(jù)探針的類型和長度，基因芯片可分為兩類。其中一類是較長的其中一類是較長的DNADNA探針（探針（ 100mer100mer）芯片）芯片這類芯片的探針往往是這類芯片的探針往往是PCRPCR的產(chǎn)物，通過點(diǎn)樣方的產(chǎn)物，通過點(diǎn)樣方法將探針固定在芯片上，主要用于法將探針固定在芯片上，主要用于RNARNA的表達(dá)分的表達(dá)分析。析。另一類是短的寡核苷酸探針芯片另一類是短的寡核苷酸探針芯片其探針長度為其探針長度為25 mer25 mer左右，一般通過在片（原位）左右，一般通過在片（原位）合成方法得到，這類芯片既可用于合成方法得到，這類芯片既可用于RNARNA的表達(dá)監(jiān)的表達(dá)監(jiān)控，也可以用于核

8、酸序列分析。控，也可以用于核酸序列分析。元件型微陣列芯片元件型微陣列芯片生物電子芯片生物電子芯片凝膠元件微陣列芯片凝膠元件微陣列芯片藥物控釋芯片藥物控釋芯片 通道型微陣列芯片通道型微陣列芯片毛細(xì)管電泳芯片毛細(xì)管電泳芯片 PCR擴(kuò)增芯片擴(kuò)增芯片集成集成DNA分析芯片分析芯片毛細(xì)管電層析芯片毛細(xì)管電層析芯片生物傳感芯片生物傳感芯片光學(xué)纖維陣列芯片光學(xué)纖維陣列芯片白光干涉譜傳感芯片白光干涉譜傳感芯片一般基因芯片按其材質(zhì)和功能，基本可分為以下幾類一般基因芯片按其材質(zhì)和功能，基本可分為以下幾類6400點(diǎn)的基因芯片點(diǎn)的基因芯片 （面積（面積 12X14 mm)核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)是基因芯片應(yīng)用的基礎(chǔ)。

9、是基因芯片應(yīng)用的基礎(chǔ)。4. 4. 基因芯片的原理基因芯片的原理基因芯片的基本原理基因芯片的基本原理任何線狀的單鏈任何線狀的單鏈DNADNA或或RNARNA序列均可被分解為一個(gè)序列序列均可被分解為一個(gè)序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（subsequencesubsequence）。例如可把寡核苷酸序列）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATGTTAGCTCATATG分解成分解成5 5個(gè)個(gè)8 nt8 nt亞序列：亞序列： 原理原理 - - 通過雜交檢測信息通過雜交檢測信息一組寡核苷酸探針一組寡核苷酸探針TATGCAATCTAGCGTTAGATA

10、CGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組由雜交位置確定的一組核酸探針序列核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補(bǔ)序列重組的互補(bǔ)序列靶序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC ATACGTTA原位合成原位合成直接點(diǎn)樣直接點(diǎn)樣原位光蝕刻合成原位光蝕刻合成原位噴印合成原位噴印合成 分子印章法分子印章法針式點(diǎn)樣針式點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣光導(dǎo)原位合成法光導(dǎo)原位合成法 基因芯片的基因芯片的制作方式制作方式1 1、原位光蝕刻合成、原位光蝕刻合成 寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由寡聚核苷

11、酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由Affymetrix公司開發(fā)的，采用的技術(shù)公司開發(fā)的，采用的技術(shù)原理原理是在合成堿基單體的是在合成堿基單體的5羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)5端保護(hù)的核苷酸端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使單體連接上去，這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含n個(gè)個(gè)核苷酸的寡

12、聚核苷酸，通過核苷酸的寡聚核苷酸，通過4n個(gè)化學(xué)步驟能合成出個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過32個(gè)個(gè)化學(xué)步驟，化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能合成個(gè)小時(shí)可能合成65,536個(gè)探針。個(gè)探針。 2 2、光導(dǎo)原位合成法、光導(dǎo)原位合成法點(diǎn)樣法點(diǎn)樣法 點(diǎn)樣法是將合成好的探針、點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組或基因組DNA通過特定通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。以是寡核酸。 采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的采用人工點(diǎn)樣的方法將

13、寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。芯片可置于緩沖液中保存。 用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很小，約為小，約為5nl。大規(guī)模。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法，與其寡核苷芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。酸微芯片相比。DNA芯片的

14、潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢和芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物。 基因芯片的應(yīng)用基因芯片的應(yīng)用1. 基因功能分析研究基因功能分析研究2. 檢測與疾病相關(guān)的基因檢測與疾病相關(guān)的基因, 進(jìn)而用于疾病診斷進(jìn)而用于疾病診斷3. 藥物篩選藥物篩選, 4. 檢測基因突變檢測基因突變5. 其他其他(環(huán)境化學(xué)毒物的篩選環(huán)境化學(xué)毒物的篩選 體質(zhì)醫(yī)學(xué)的研究 )基因功能分析研究基因功能分析研究 將成千上萬個(gè)我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片將成千上萬個(gè)我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片上，對來源于

15、不同個(gè)體不同組織不同細(xì)胞周期不同發(fā)育階段不上，對來源于不同個(gè)體不同組織不同細(xì)胞周期不同發(fā)育階段不同分化階段不同病變不同刺激（包括不同誘導(dǎo)不同治療手段）同分化階段不同病變不同刺激（包括不同誘導(dǎo)不同治療手段）下細(xì)胞內(nèi)的下細(xì)胞內(nèi)的mRNAmRNA或逆轉(zhuǎn)錄所得的或逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNAcDNA進(jìn)行檢測，從而對這些基進(jìn)行檢測，從而對這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性組織特異性發(fā)育階段特異性分化階段特異因表達(dá)的個(gè)體特異性組織特異性發(fā)育階段特異性分化階段特異性。進(jìn)行綜合評定與判斷，極大加快這些基因功能的確立。性。進(jìn)行綜合評定與判斷，極大加快這些基因功能的確立。檢測與疾病相關(guān)的基因檢測與疾病相關(guān)的基因, , 進(jìn)而用于疾病

16、診進(jìn)而用于疾病診斷斷目前主要涉及：目前主要涉及：癌癥、癌癥、心血管疾病、心血管疾病、血液病、血液病、遺傳性疾病、遺傳性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、部分感染性疾病、部分感染性疾病、免疫反應(yīng)相關(guān)性疾病免疫反應(yīng)相關(guān)性疾病毒物引起的損傷等。毒物引起的損傷等。藥物篩選藥物篩選 在基因功能研究基礎(chǔ)上，特別是確立了與某些疾病相關(guān)基因在基因功能研究基礎(chǔ)上，特別是確立了與某些疾病相關(guān)基因的表達(dá)變化情況后，就可針對疾病發(fā)生機(jī)理進(jìn)行藥物篩選工作。的表達(dá)變化情況后，就可針對疾病發(fā)生機(jī)理進(jìn)行藥物篩選工作。將這些基因特異性片段固定在芯片上，研究病變組織和正常組只將這些基因特異性片段固定在芯片上，研究病變組織和正常組

17、只在某些藥物刺激下這些基因表達(dá)的變化，可快速判斷藥物作用的在某些藥物刺激下這些基因表達(dá)的變化，可快速判斷藥物作用的效果，并進(jìn)行高通量篩選（效果，并進(jìn)行高通量篩選（high throughout screeninghigh throughout screening），可），可使新藥開發(fā)獲得技術(shù)上的突破。使新藥開發(fā)獲得技術(shù)上的突破。Evanse and RellingScience , 286 (5439): 487, Oct 15,1999基因芯片的發(fā)展方向基因芯片的發(fā)展方向進(jìn)一步提高探針陣列的集成度，如有多家公司的芯進(jìn)一步提高探針陣列的集成度，如有多家公司的芯片陣列的集成度已達(dá)片陣列的集成度已

18、達(dá)1.01.0105105左右，這樣基因數(shù)量左右，這樣基因數(shù)量在在1.01.0105105以下的生物體（大多數(shù)生物體）的基因以下的生物體（大多數(shù)生物體）的基因表達(dá)情況只用一塊芯片即可包括。表達(dá)情況只用一塊芯片即可包括。 提高檢測的靈敏度和特異性。如檢測系統(tǒng)的優(yōu)化提高檢測的靈敏度和特異性。如檢測系統(tǒng)的優(yōu)化組合和采用高靈敏度的熒光標(biāo)志。多重檢測以提高組合和采用高靈敏度的熒光標(biāo)志。多重檢測以提高特異性，減少假陽性。特異性，減少假陽性。 高自動(dòng)化、方法趨于標(biāo)準(zhǔn)化、簡單化，成本降低。高自動(dòng)化、方法趨于標(biāo)準(zhǔn)化、簡單化，成本降低。價(jià)格高昂是目前推廣應(yīng)用的主要障礙之一，但隨著價(jià)格高昂是目前推廣應(yīng)用的主要障礙之一，但隨著技術(shù)的革新，基因芯片的價(jià)格將會(huì)大大降低。技術(shù)的革新，基因芯片的價(jià)格將會(huì)大大降低。高穩(wěn)定性。寡核苷酸探針、高穩(wěn)定性。寡核苷酸探針、RNARNA均不穩(wěn)定，易受破壞。均不穩(wěn)定，易受破壞。而肽核酸（而肽核酸（PNAPNA）有望取代普通）有望取代普通RNA/DNARNA/DNA探針，可以探針，可以確保探針的高穩(wěn)定性。確保探針的高穩(wěn)定性。研制新的應(yīng)用芯片，如研制新的應(yīng)用芯片，如19991999年美國環(huán)保局年美國環(huán)保局(EPA)(EPA)組織專組織專家研討會(huì)，討論了毒理學(xué)芯片的發(fā)展策略。近來多種新家研討會(huì)，討論了毒理學(xué)芯片的發(fā)展策略。近來多種