第十部分化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) ppt課件

1、第十章第十章 化學(xué)發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫光免疫 分析技術(shù)分析技術(shù)第十章第十章 化學(xué)發(fā)光免疫化學(xué)發(fā)光免疫 分析技術(shù)分析技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 慨慨 述述一、化學(xué)發(fā)光一、化學(xué)發(fā)光二、化學(xué)發(fā)光效率二、化學(xué)發(fā)光效率第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)志技術(shù)化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)志技術(shù)一、化學(xué)發(fā)光劑一、化學(xué)發(fā)光劑二、發(fā)光劑的標(biāo)志技術(shù)二、發(fā)光劑的標(biāo)志技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析四、臨床運(yùn)用四、臨床運(yùn)用思索題思索題小結(jié)小結(jié)發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析: :是將發(fā)光分析和免疫

2、反響相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)志免疫分析技術(shù)。是將發(fā)光分析和免疫反響相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)志免疫分析技術(shù)。 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述放射免疫放射免疫技術(shù)技術(shù)酶免疫技酶免疫技術(shù)術(shù)發(fā)光免疫發(fā)光免疫技術(shù)技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)志技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)志技術(shù) 發(fā)光發(fā)光: :是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)較低能級(jí)躍遷到激發(fā)態(tài)較高能級(jí)，然后再前往到基態(tài)，并釋放光子是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)較低能級(jí)躍遷到激發(fā)態(tài)較高能級(jí)，然后再前往到基態(tài)，并釋放光子的過程。的過程。根據(jù)構(gòu)成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為根據(jù)構(gòu)成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為: :光

3、照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。 光照發(fā)光光照發(fā)光photoluminescencephotoluminescence是指發(fā)光劑熒是指發(fā)光劑熒光素經(jīng)短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到光素經(jīng)短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出較長波長的可見光激發(fā)態(tài)，在其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出較長波長的可見光熒光。熒光。 生物發(fā)光bioluminescence是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光景象，如螢火蟲的發(fā)光，反響底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的方式釋放出來。 化學(xué)發(fā)光ch

4、emiluminescence是指伴隨化學(xué)反響過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射景象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反響時(shí)，吸收了反響過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反響的產(chǎn)物分子或反響的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的方式釋放出能量，這一景象稱為化學(xué)發(fā)光。一、化學(xué)發(fā)光一、化學(xué)發(fā)光 一些化學(xué)反響能釋放足夠一些化學(xué)反響能釋放足夠的能量把參與反響的物質(zhì)激的能量把參與反響的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，假設(shè)被激發(fā)的是一個(gè)反響產(chǎn)物假設(shè)被激發(fā)的是一個(gè)反響產(chǎn)物分子，那么這種反響過程叫直分子，那么這種反響過程叫直接化學(xué)發(fā)光。反響過程可簡單地描畫如下：接化學(xué)發(fā)光。反響過

5、程可簡單地描畫如下： A十十B C* C* C h其中其中為光子，為光子，C*表示表示C處于單線激發(fā)態(tài)。處于單線激發(fā)態(tài)。 假設(shè)激發(fā)能傳送到另一個(gè)未參與化學(xué)反響假設(shè)激發(fā)能傳送到另一個(gè)未參與化學(xué)反響的分子的分子D D上，使上，使D D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，這種過分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，這種過程叫間接化學(xué)發(fā)光。反響過程可表示如下：程叫間接化學(xué)發(fā)光。反響過程可表示如下： A A十十B CB C* * C C* *十十D CD C十十D D* * D D* * D D十十hh 化學(xué)發(fā)光效率決議于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率CE和激發(fā)態(tài)分子的

6、發(fā)射效率EM?；瘜W(xué)發(fā)光反響的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質(zhì)的性質(zhì)所決議，每一個(gè)發(fā)光反響都具有其特征性的化學(xué)發(fā)光光譜和不同的化學(xué)發(fā)光效率。二、化學(xué)發(fā)光效率二、化學(xué)發(fā)光效率第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)志技術(shù)化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)志技術(shù) 在化學(xué)發(fā)光反響中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的方式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。 一、化學(xué)發(fā)光劑一、化學(xué)發(fā)光劑能作為化學(xué)發(fā)光劑的條件：能作為化學(xué)發(fā)光劑的條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高；發(fā)光的量子產(chǎn)率高；它的物理它的物理- -化學(xué)特性要與被標(biāo)志或測定的化學(xué)特性要與被標(biāo)志或測定的 物質(zhì)相匹配；物質(zhì)相匹配；能與抗原或抗體構(gòu)成穩(wěn)定的偶結(jié)合合物；能與抗原

7、或抗體構(gòu)成穩(wěn)定的偶結(jié)合合物； 其化學(xué)發(fā)光常是氧化反響的結(jié)果；其化學(xué)發(fā)光常是氧化反響的結(jié)果；在所運(yùn)用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性。在所運(yùn)用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性。 直接化學(xué)發(fā)光劑直接化學(xué)發(fā)光劑 直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反響，它們在化學(xué)構(gòu)造上有產(chǎn)生發(fā)光的特有直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反響，它們在化學(xué)構(gòu)造上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)志抗原或抗體?；鶊F(tuán)，可直接標(biāo)志抗原或抗體。 1. 吖啶酯吖啶酯 在堿性條件下被在堿性條件下被H2O2氧化氧化時(shí)時(shí),發(fā)出波長為發(fā)出波長為470nm的光，具有很高的的光，具有很高的發(fā)光效率

8、，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮甲基吖啶酮是該發(fā)光反響體系的發(fā)光體。是該發(fā)光反響體系的發(fā)光體。 2 2三聯(lián)吡啶釕三聯(lián)吡啶釕 三聯(lián)吡啶釕三聯(lián)吡啶釕 RU(bpy)32+RU(bpy)32+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺TPATPA在陽電極外表可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化在陽電極外表可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反響。反響。 三聯(lián)吡啶釕三聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光劑反響原理電化學(xué)發(fā)光劑反響原理 酶促反響發(fā)光劑：酶促反響發(fā)光劑： 是利用標(biāo)志酶的催化作用，使發(fā)光劑底是利用標(biāo)志酶的催化作用，使發(fā)光劑底 物發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑物發(fā)光，這一類需酶催

9、化后發(fā)光的發(fā)光劑 稱為酶促反響發(fā)光劑。稱為酶促反響發(fā)光劑。 1 1魯米諾及其衍生物魯米諾及其衍生物 2 2AMPPDAMPPD1 1魯米諾魯米諾魯米諾發(fā)光原理魯米諾發(fā)光原理魯米諾加強(qiáng)發(fā)光反響原理魯米諾加強(qiáng)發(fā)光反響原理 2AMPPD3-(2-螺旋金剛烷螺旋金剛烷)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-磷酰氧基磷酰氧基)苯苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷二氧雜環(huán)丁烷1. 1. 碳二亞胺碳二亞胺EDCEDC縮合法縮合法 二、發(fā)光劑的標(biāo)志技術(shù)二、發(fā)光劑的標(biāo)志技術(shù)2. 2. 過碘酸鈉氧化法過碘酸鈉氧化法 3 3重氮鹽偶聯(lián)法重氮鹽偶聯(lián)法 4. N-4. N-羥基琥珀酰亞胺活化法羥基琥珀酰亞胺活化法 1發(fā)光劑的選擇 2被

10、標(biāo)志蛋白質(zhì)的性質(zhì) 3標(biāo)志方法的選擇 4原料比 5標(biāo)志率 6溫度 7純化與保管 影響標(biāo)志的要素影響標(biāo)志的要素第三節(jié)第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 用吖啶酯直接標(biāo)志抗體用吖啶酯直接標(biāo)志抗體(抗原抗原)，與待測標(biāo)本中相，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原應(yīng)的抗原(抗體抗體)發(fā)生免疫反響后，構(gòu)成固相包被抗發(fā)生免疫反響后，構(gòu)成固相包被抗體體-待測抗原待測抗原-吖啶酯標(biāo)志抗體復(fù)合物，這時(shí)只需參吖啶酯標(biāo)志抗體復(fù)合物，這時(shí)只需參與氧化劑與氧化劑H2O2和和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需求催化劑的情況下分解、發(fā)光酯在不需求催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接納、記

11、錄單位時(shí)間內(nèi)所由集光器和光電倍增管接納、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從規(guī)范曲線上計(jì)算出待測抗原的含量。正比，可從規(guī)范曲線上計(jì)算出待測抗原的含量。一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光發(fā)光磁微粒磁微粒被測抗原被測抗原+抗體抗體+帶丫啶酯帶丫啶酯標(biāo)志物抗標(biāo)志物抗體體沖洗后沖洗后1 1參與參與H2O2H2O2pH10pH10pH10直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理磁微粒方式圖磁微粒方式圖Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y

12、Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特點(diǎn)特點(diǎn)抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分別的易分別磁微粒技術(shù)磁微粒技術(shù) 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析chemiluminescence enzyme chemiluminescence enzyme immunoassayimmunoassay，CLEIACLEIA是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反響的酶如是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反響的酶如辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶HRPHRP或堿性磷酸酶或堿性磷酸酶(ALP)(ALP)來標(biāo)志抗原或抗體，來標(biāo)志抗原或抗體，在與待測標(biāo)本中相

13、應(yīng)的抗原在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反響后，構(gòu)成固相發(fā)生免疫反響后，構(gòu)成固相包被抗體包被抗體- -待測抗原待測抗原- -酶標(biāo)志抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，參與底物酶標(biāo)志抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，參與底物( (發(fā)光劑發(fā)光劑) )，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接納，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接納，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處置系統(tǒng)，計(jì)算出測定物的濃度。至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處置系統(tǒng)，計(jì)算出測定物的濃度。二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶該分析

14、系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶HRP標(biāo)標(biāo)志抗體志抗體(或抗原或抗原)，在與反響體系中的待測標(biāo)，在與反響體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反響后，構(gòu)成固相包本和固相載體發(fā)生免疫反響后，構(gòu)成固相包被抗體被抗體-待測抗原待測抗原-酶酶HRP標(biāo)志抗體復(fù)合標(biāo)志抗體復(fù)合物，這時(shí)參與魯米諾發(fā)光劑、物，這時(shí)參與魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)和化學(xué)發(fā)光加強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。發(fā)光加強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 辣根過氧化物酶標(biāo)志的化學(xué)發(fā)光免疫分析辣根過氧化物酶標(biāo)志的化學(xué)發(fā)光免疫分析辣根過氧化物酶標(biāo)志化學(xué)發(fā)光免疫分析表示圖辣根過氧化物酶標(biāo)志化學(xué)發(fā)光免疫分析表示圖 該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標(biāo)志抗體標(biāo)志抗體(或抗原

15、或抗原)，在與反響體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生在與反響體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反響后，構(gòu)成固相包被抗體免疫反響后，構(gòu)成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶酶標(biāo)志抗體復(fù)合物，這時(shí)參與標(biāo)志抗體復(fù)合物，這時(shí)參與AMPPD發(fā)光劑，發(fā)光劑，堿性磷酸酶使堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。 堿性磷酸酶標(biāo)志的化學(xué)發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標(biāo)志的化學(xué)發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標(biāo)志化學(xué)發(fā)光免疫分析表示圖堿性磷酸酶標(biāo)志化學(xué)發(fā)光免疫分析表示圖 分配樣品分配樣品,磁顆粒磁顆粒和試劑和試劑孵育孵育使反響物使反響物結(jié)合結(jié)合在磁場中在磁場中清洗去除清洗去除未結(jié)合物質(zhì)未結(jié)合物質(zhì)參與參與底物底物

16、產(chǎn)生產(chǎn)生信號(hào)信號(hào)孵育孵育,促使信號(hào)促使信號(hào)的產(chǎn)生的產(chǎn)生信號(hào)信號(hào)檢測檢測電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析electrochemiluminescence immunoassayelectrochemiluminescence immunoassay， ECLIAECLIA是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)志是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)志 抗體抗體( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)為電子供體，為電子供體， 在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光 反響，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程。反響，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程。 三、電化學(xué)發(fā)光

17、免疫分析三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體包被抗體( (抗原抗原) )，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)志抗體，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)志抗體( (抗原抗原) )，在，在反響體系內(nèi)待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗原反響體系內(nèi)待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗原 ( (抗體抗體) )發(fā)生免疫發(fā)生免疫反響后，構(gòu)成磁性微粒包被抗體反響后，構(gòu)成磁性微粒包被抗體- -待測抗原待測抗原- -三聯(lián)吡啶三聯(lián)吡啶釕標(biāo)志抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，釕標(biāo)志抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引人同時(shí)引人TPATPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極外表時(shí)，緩沖液。當(dāng)磁性微粒

18、流經(jīng)電極外表時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)志被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)志抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反響，使三聯(lián)吡啶釕和電化學(xué)發(fā)光反響，使三聯(lián)吡啶釕和TPATPA在電極外表進(jìn)在電極外表進(jìn)展電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測抗原展電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測抗原的濃度成正比。的濃度成正比。電化學(xué)發(fā)光免疫分析表示圖電化學(xué)發(fā)光免疫分析表示圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定表示圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定表示圖標(biāo)志磁顆粒在電場中發(fā)光任務(wù)表示圖標(biāo)志磁顆粒在電場中發(fā)光任務(wù)表示圖 1. 1.甲狀腺激素甲

19、狀腺激素 2 2生殖激素生殖激素 3 3垂體激素和皮質(zhì)激素垂體激素和皮質(zhì)激素 4 4貧血因子貧血因子 5 5腫瘤標(biāo)志物腫瘤標(biāo)志物 6 6感染性疾病感染性疾病 7 7糖尿病糖尿病 胰島素、血清胰島素、血清C-C-肽、血漿胰高糖素等。肽、血漿胰高糖素等。 8 8心臟標(biāo)志物心臟標(biāo)志物 9 9病毒標(biāo)志物病毒標(biāo)志物 1010過敏性疾病過敏性疾病 1111治療藥物監(jiān)測治療藥物監(jiān)測 四、臨床運(yùn)用四、臨床運(yùn)用1 1什么是發(fā)光免疫分析？什么是化學(xué)發(fā)光免疫分析？什么是發(fā)光免疫分析？什么是化學(xué)發(fā)光免疫分析？2 2化學(xué)發(fā)光與熒光的區(qū)別？化學(xué)發(fā)光反響的條件？化學(xué)發(fā)光與熒光的區(qū)別？化學(xué)發(fā)光反響的條件？3 3什么叫化學(xué)發(fā)光劑？化學(xué)發(fā)光劑必需具備那些條件？