萌發(fā)麥苗淀粉酶活力的測定_實驗報告

1、班級：植物142 學號：1401080229 姓名：劉國強實驗七：萌發(fā)麥種的淀粉酶活力的測定1、 研究背景及目的酶是由生物體內(nèi)活細胞產(chǎn)生的一種生物催化劑。大多數(shù)由蛋白質組成（少數(shù)為RNA）。能在機體中十分溫和的條件下，高效率地催化各種生物化學反應，促進生物體的新陳代謝。生命活動中的消化、吸收、呼吸、運動和生殖都是酶促反應過程。酶是細胞賴以生存的基礎。細胞新陳代謝包括的所有化學反應幾乎都是在酶的催化下進行的。因此，對酶的研究是十分重要的。通過對酶活性的測定，可以更好地了解生物體的代謝過程。2、 實驗原理淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，可以分成-淀粉酶，-淀粉酶等。-淀粉酶既作用于直鏈淀粉，亦作

2、用于支鏈淀粉，無差別地隨機切斷糖鏈內(nèi)部的-1，4-鏈。-淀粉酶與-淀粉酶的不同點在于從非還原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷-1，4-葡聚糖鏈。 根據(jù)其催化產(chǎn)物的特點和現(xiàn)有測定方法規(guī)定酶活力單位為：每分鐘每克鮮重麥種所催化產(chǎn)生的麥芽糖毫克數(shù)。3,5二硝基水楊酸法是一種對還原糖定量測定的方法。還原糖和堿性二硝基水楊酸試劑一起共熱，產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)，棕紅色物質顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。因此，我們可以測定樣品中還原糖以及總糖的量。麥芽糖是還原性糖，可用該方法對其含量進行測定。本實驗分為兩部分，一是通過純化-淀粉酶活力完成-淀粉酶的活力測定，二是不進行任何純化處理測定

3、總酶活力。 三、儀器試劑1、儀器設備：低溫冷凍離心機（Eppendorf 5804R）恒溫水浴鍋（ ）分光光度計（ ）托盤天平（JYT-1，原常熟市金羊天平儀器廠）2.試劑：（1）1%淀粉溶液，稱取1g可溶性淀粉，加入80ml左右蒸餾水，在電爐上加熱溶解，等冷卻后，定容到100ml。（2） pH5.6的檸檬緩沖液：A液（稱取檸檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（稱取檸檬酸鈉29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混勻即為pH5.5檸檬酸緩沖液；（3）3，5-二硝基水楊酸溶液（稱取3，5-二硝基水楊酸1.00克，溶于20ml 1M氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再

4、加入30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100ml，蓋緊瓶塞，勿使二氧化碳進入）；（4）麥芽糖標準液（稱取0.100克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，小心移入100ml容量瓶中，用蒸餾水定容到100ml）；（5）0.4M NaOH；3、 實驗材料：萌發(fā)的小麥種子。四、實驗步驟1.酶液的制備（蒸餾水浸提）：稱取2克萌發(fā)的小麥種子（芽長一厘米左右），置于研缽中加少量石英砂，蒸餾水作為勻漿液，研磨成勻漿，轉移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分鐘，用蒸餾水定容到刻度，混勻后3500轉/分離心20分鐘，取出上清液備用（初始酶液）。2.淀粉酶活性的測定：（1）.取試管4支，注明兩支為對照管，

5、兩支為測定管。（2）.于每個管中各加入酶提取液1毫升，在70恒溫水浴中（水浴溫度的變化不應超過±0.5）準確加熱15分鐘，取出后迅速在水浴中徹底冷卻。(3).在試管中各加入1ml pH5.6檸檬酸緩沖液。4).將測定管和對照管置于40（±0.5）恒溫水浴中準確保溫15分鐘后，向兩支對照管中各加入4ml 0.4MNaOH，再向各管分別加入40下預熱的淀粉溶液2ml，搖勻，立即放入40水浴中準確保溫5分鐘后，向兩支測定管分別迅速加入4ml 0.4NaOH，然后準備下步糖的測定。3.-淀粉酶及-淀粉酶總活性的測定：取酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度?；炀?，

6、取4支試管，2支為對照管，2支為測定管，各加入稀釋后酶液1ml及pH5.6檸檬酸緩沖液1ml，以下步驟重復淀粉酶測定的第(4)步的操作。4.麥芽糖的測定：（1）.標準曲線的制作取15ml具塞刻度試管7支，編號，按表1操作試劑 管號1234567麥芽糖標準液00.10.30.50.70.91.0蒸餾水1.00.90.70.50.30.10 表1.麥芽糖標準管的制備搖勻后再加入3,5-二硝基水楊酸1毫升，搖勻，在沸水浴中準確保溫5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋到15毫升，混均勻后用分光光度計在520nm波長下進行比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標以麥芽糖含量為橫坐標繪制標準曲線。（2）.樣品的測定取

7、以上各管中酶作用后的溶液及對照管中的溶液各1毫升，分別放入15毫升具塞刻度管中，在加入1毫升，3,5-二硝基水楊酸試劑混勻，置于沸水浴中準確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至15毫升，混勻，用分光光度計在520nm波長下進行比色，記錄消光值，根據(jù)標準曲線，進行結果計算。5.結果計算-淀粉酶活性（毫克麥芽糖·克-1鮮重·分鐘-1）=（A-A）*樣品稀釋總體積/樣品重(g)*5（-+-）淀粉酶總活性（毫克麥芽糖·克-1鮮重·分鐘-1）= (B-B)* 樣品稀釋總體積/樣品重(g)*5A -淀粉酶測定管中的麥芽糖濃度A -淀粉酶對照管中的麥芽糖濃度B -及-

8、淀粉酶總活性測定管中的麥芽糖濃度B -及-淀粉酶總活性對照管中的麥芽糖濃度五、數(shù)據(jù)整理與計算麥芽糖標準曲線：管號1234567麥芽糖標準液濃度×15(mg/ml)00.10.30.50.70.91.0OD520淀粉酶活力測定液：管號89101112131415項目-對照管-測定管+-對照管+-測定管OD520OD520均值麥芽糖濃度（mg/ml）結果計算：六、結果分析七、參考文獻1百度百科-淀粉酶百科名片 2<-淀粉酶的性質> 八、 思考題1、酶活力測定實驗的總體設計思路是什麼？實驗設計的關鍵你認為是什麼？為什么？答：酶活力的測定其總體思路就是在最適條件下測定酶促反應的初

9、速度（底物消耗小于5%）。據(jù)此具體實驗設計是底物過量的情況（一般S10KM），于酶的最適pH、溫度等條件下測定某種酶作用產(chǎn)物的生成速度以表征酶的催化能力。所以本實驗在保證以上要求下，以麥芽糖的生成量來表征淀粉酶的活力，并嚴格定義了酶活單位。在這個總體思路的指導下，我們首先必須關注的是：材料自身、原本就存在的被測定產(chǎn)物的含量！具體到本實驗即是麥芽中自身已經(jīng)存在的麥芽糖。這部分酶作用產(chǎn)物是必須要精確刨除的，否則我們實驗的最終定量便無法準確。而這就是“對照管”要完成的任務。所以，所有的酶活力測定實驗中都有所謂“對照管”的設計，其作用就是刨除所有非指定酶促反應測定時間段內(nèi)的待測產(chǎn)物！以保證最終結果的可

10、信準確。這是酶活力測定中最關鍵的設計。2、本實驗最易產(chǎn)生對結果有較大誤差影響的操作是哪些步驟？為什么？怎樣的操作策略可以盡量減少誤差？答：浸提步驟。70溫度或15min時間控制不嚴格不準確則可能導致淀粉酶未完全鈍化使測得活性偏大。應嚴格控制溫度和時間。70水浴后需要立即冰浴，否則淀粉酶復性使測得淀粉酶活性結果偏大。向測定管中加入NaOH時應迅速，否則酶與底物繼續(xù)反應使結果偏大。3、-淀粉酶活性測定時70水浴為何要嚴格保溫15分鐘？保溫后為何要立即于冰浴中驟冷？答：由于-淀粉酶不耐熱，在70下處理一定時間可以鈍化，嚴格保溫15分鐘可以達到理想的鈍化效果，時間過長，-淀粉酶活性也會受到影響；時間不

11、足，-淀粉酶鈍化不完全。保溫后立即驟冷是為了通過劇烈的溫變改變b-淀粉酶的結構以防止在隨后的反應中復性，這樣就保證了在隨后的40溫浴的酶促反應中，-淀粉酶不會再參與催化反應。此外我認為冰浴使酶迅速降溫，便于嚴格控制高溫處理時間的長短。4、pH5.6檸檬酸緩沖液的作用？各管于40水浴準確保溫15分鐘的作用？答：酶實驗體系的pH值變化或變化過大，會使酶活性下降甚至完全失活。加入pH5.6的緩沖液調至酶促反應的最適pH，同時穩(wěn)定溶液的pH不至于在反應過程中大幅波動。 40水浴準確保溫15分鐘為調整酶促反應的最適溫度5、眾多測定淀粉酶活力的實驗設計中一般均采取鈍化b-淀粉酶的活力而測a-淀粉酶和測總酶

12、活力的策略，為何不采取鈍化a-淀粉酶活力去測b-淀粉酶活力呢？這種設計思路說明什么？答：淀粉酶與淀粉酶的催化特性是有差異的。淀粉酶主要作用于直鏈淀粉的-1，4-糖苷鍵，而且僅從淀粉分子外圍的非還原性末端開始，切斷至-1,6-鍵的前面反應就停止了；而淀粉酶則無差別地作用于直鏈淀粉與支鏈淀粉的-1，4-糖苷鍵，所以淀粉酶需要淀粉酶淀粉支鏈的-1，4-糖苷鍵后才能完全體現(xiàn)其催化能力。 此外我認為在實驗中溫度比酸度更易控制，鈍化淀粉酶難度遠遠高于淀粉酶，而且若提高酸度鈍化淀粉酶，則回調最適pH時淀粉酶也有可能由于復性恢復活力。這種設計思路說明在測定酶的比活力時要綜合考慮各種可能出現(xiàn)的酶的性質以及它們之間的聯(lián)系，也要考慮到實驗操作的可行性。6、本實驗中所設置的對照管的作用？它與比色法測定物質含量實驗中設置的空白管有何異同？本實驗可否用對照管調分光光度計的100%T？為什么？答：消除非酶促反應（如淀粉酸性環(huán)境下加熱水解）和非測定時間內(nèi)的酶促反應引起的麥芽糖的生成帶來的誤差。兩種都是為了消除非測定部分對光的吸收，空白組是為了消除溶液中溶劑等其它組分對光的吸收，而對照管是為了消除非測量所需反應所得的多余溶質對光的吸收。不可，因為標準曲線的確定是在空白的基礎上的，得到的是OD值與麥芽糖含量的關系7、我們所測定得到的總酶活力減去所測定得到的a-淀粉酶活力是否就