醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概 述免疫學(xué)是一門既古老又嶄新的學(xué)科，涉及醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域，并與理工農(nóng)各學(xué)科相互滲透。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是生命科學(xué)的前沿學(xué)科，也是醫(yī)學(xué)生的主干必修課程之一。目前免疫學(xué)的研究已經(jīng)進(jìn)入了一個嶄新的時代。現(xiàn)代免疫學(xué)的研究和應(yīng)用涉及到生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域。它與分子生物學(xué)一樣是生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床工作不可缺的工具。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是一門實(shí)踐性、應(yīng)用性很強(qiáng)的學(xué)科，教學(xué)過程分為理論教學(xué)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)。實(shí)驗(yàn)教學(xué)作為免疫學(xué)教學(xué)的重要環(huán)節(jié)，直接影響大人才的培養(yǎng)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，特別是在培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)態(tài)度、實(shí)踐技能、創(chuàng)新能力方面，具有重要的地位。一醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的開設(shè)，目的在于不僅使學(xué)生驗(yàn)證部分理

2、論知識和加深對課堂講授內(nèi)容的理解，更重要的是在掌握系統(tǒng)理論知識的基礎(chǔ)上，學(xué)習(xí)和掌握免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)和技能，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析和解決問題的能力，以及嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度和創(chuàng)新精神，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。1基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生系統(tǒng)學(xué)習(xí)和掌握常用的經(jīng)典免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，使學(xué)生理解和鞏固所學(xué)的理論知識，掌握相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技能。2綜合性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及本課程的綜合知識或相關(guān)課程知識的實(shí)驗(yàn)，往往由多種實(shí)驗(yàn)手段、技術(shù)和層次的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容所組成。通過綜合性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步訓(xùn)練學(xué)生對所學(xué)知識和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的綜合運(yùn)用能力、獨(dú)立工作能力和對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析能力。3設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)是在完成基礎(chǔ)性試驗(yàn)和綜合

3、性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，給定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、要求和所提供的?shí)驗(yàn)條件，由學(xué)生自行查閱資料，自選題目、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，并在老師指導(dǎo)下，進(jìn)行試驗(yàn)，最后以論文形式寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。目的在于激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新性思維，培養(yǎng)學(xué)生的科研能力，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。二醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1學(xué)生在上實(shí)驗(yàn)課前，應(yīng)對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行預(yù)習(xí)，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒁?，了解?shí)驗(yàn)原理和操作步驟，熟悉所要使用的儀器、藥品的性質(zhì)和注意事項(xiàng)，預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2注意保持科學(xué)實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)肅性、嚴(yán)格性和嚴(yán)密性。實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真地觀察教師的演示，嚴(yán)肅認(rèn)真地按規(guī)定步驟進(jìn)行操作。3仔細(xì)、耐心地觀察實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，及時、真實(shí)客觀地記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并積極思考，認(rèn)真分析，得出

4、結(jié)論。4積極參與小組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，樹立團(tuán)隊(duì)精神，并發(fā)揮自己的聰明才智，創(chuàng)造性地開展科學(xué)實(shí)驗(yàn)。5實(shí)驗(yàn)所用的儀器、器材和試劑須按照要求擺放，嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行操作，保證實(shí)驗(yàn)過程順利進(jìn)行，并取得預(yù)期結(jié)果。6要愛護(hù)公共財(cái)物，節(jié)約試劑材料，不得將實(shí)驗(yàn)室任何物品私自帶走。如將儀器、器材損壞，應(yīng)及時報(bào)告教師，并登記備案。7實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保持安靜，遵守紀(jì)律，不得高聲談笑、隨便走動、玩弄動物。8實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止吸煙、進(jìn)食、飲水、用嘴習(xí)習(xí)管及濕潤標(biāo)簽，不準(zhǔn)隨地吐痰。9如有傳染性材料、有毒材料流灑與桌面、地面或衣服上，或發(fā)現(xiàn)割破皮膚、被動物咬傷等意外時，要及時報(bào)告教師，做好妥善處理。10實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)清理實(shí)驗(yàn)用品，物歸原處。

5、實(shí)驗(yàn)廢棄物應(yīng)放入或倒入指定的地方或容器內(nèi)。服從衛(wèi)生值日安排，認(rèn)真負(fù)責(zé)地做好清潔衛(wèi)生。11離開實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)洗手，注意關(guān)好水、電、門、窗等。12認(rèn)真填寫實(shí)驗(yàn)記錄，按時提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。第一章基礎(chǔ)性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 免疫血清的制備免疫血清是機(jī)體受到抗原物質(zhì)刺激后的血清，含有特異性免疫球蛋白?？芍苯討?yīng)用于病原的診斷或感染性疾病的緊急預(yù)防和治療；也可通過純化血清中的免疫球蛋白來制作多種與免疫相關(guān)或不相關(guān)疾病的診斷和治療制劑。免疫血清又稱抗血清或抗體，而從抗血清中純化的免疫球蛋白則只能稱為抗體。在傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法中，尤其是作細(xì)菌的血清學(xué)鑒定時，抗血清即能滿足要求，無需純化，因?yàn)榧兓倪^程將造成免疫球蛋白的丟失。但在

6、現(xiàn)代免疫學(xué)方法中，由于免疫標(biāo)記和反應(yīng)精確度的需要，必須純化抗血清的有效成分，即獲得免疫球蛋白甚至是某一類或亞類的免疫球蛋白。 抗體的制備大致包括三個階段，即抗原的制備與純化、動物免疫和血清分離純化與鑒定?？乖侵苽淇贵w的先決條件，要制備高質(zhì)量的抗體，必須首先獲得特異性高的抗原性物質(zhì)?？贵w制備的方案視抗原的性質(zhì)不同而異。【目的要求】本實(shí)驗(yàn)制備抗人全血清和傷寒沙門菌O抗體,要求掌握免疫血清制備的原理及其方法步驟?！緦?shí)驗(yàn)原理】 用抗原刺激機(jī)體可以使機(jī)體產(chǎn)生抗體，抗原與抗體是一對概念，抗原的純度和活性，影響著其免疫動物后獲得的抗體的特異性和滴度。根據(jù)抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律，視抗原的性質(zhì)選擇不同的途徑免疫動

7、物，經(jīng)初次、再次免疫的過程，使得動物血清中產(chǎn)生足量的特異性抗體，繼而分離血清并純化免疫球蛋白，得到免疫血清或抗體。 【器材試劑】1.抗原與免疫對象 細(xì)菌菌種(傷寒沙門菌O901)、混合人全血清、健康家兔。2.福氏佐劑 福氏不完全佐劑：稱取羊毛脂5g，逐滴加入石蠟油20ml（羊毛脂:石蠟油可為1:11:4），高壓滅菌后4保存?zhèn)溆?。福氏完全佐劑：于不完全佐劑中加入卡介?20mg/ml，研缽中研磨乳化后即為完全佐劑，冰箱保存?zhèn)溆谩?.生理鹽水、麥?zhǔn)媳葷峁?、甘油、防腐劑?.02疊氮鈉或0.01硫柳汞）等。4.剪刀、鑷子、注射器、研缽、試管等器材和冰箱、離心機(jī)等儀器 ?！痉椒ú襟E】1.傷寒沙門菌O

8、抗體的制備 傷寒沙門菌O 抗原的制備：經(jīng)革蘭染色作細(xì)菌純度鑒定的傷寒沙門菌O901，密集劃線接種于普通瓊脂平板（若需大量制備，可接種于用柯氏瓶制備的瓊脂培養(yǎng)基），37培養(yǎng)2448h后，用生理鹽水將細(xì)菌菌苔洗于清潔、無菌的三角燒瓶中，置60水浴或隔水煮沸1h以破壞細(xì)菌的鞭毛，用濾紙過濾（大量制備時）或移入離心管4000r/min離心1020min（少量時）。將濾過的菌液接種少量于瓊脂平板進(jìn)行無菌試驗(yàn)（37，24h），確定無菌后用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至109個/ml，此為細(xì)菌O抗原，置4保存?zhèn)溆?。若制備鞭毛抗原，則可用含有5石炭酸（苯酚）的生理鹽水洗下瓊脂平板上的菌苔，37溫育48h后作無菌試驗(yàn)，

9、濾過后用生理鹽水配成一定濃度。 傷寒沙門菌O 抗原免疫方案：用于免疫動物的菌液濃度視菌種的不同而異，傷寒沙門菌、志賀痢疾菌等腸道桿菌，免疫濃度多為109個/ml左右。細(xì)菌性抗原的免疫方案大致相同，見表11表11 傷寒沙門菌O抗原的免疫方案免疫日期（天）免疫途徑抗原免疫劑量（ml）1多點(diǎn)皮內(nèi)傷寒沙門O抗原1.06靜脈傷寒沙門O抗原0.511靜脈傷寒沙門O抗原0.516靜脈傷寒沙門O抗原1.019靜脈傷寒沙門O抗原2.0 試血：末次免疫7d后即可試血，耳靜脈或心臟采血，分離血清與傷寒沙門菌O抗原作試管凝集試驗(yàn)，凝集效價（滴度）在1:16003200之間時即可放血，若效價較低可繼續(xù)加強(qiáng)免疫。 放血：

10、勁動脈放血（也可心臟采血），以最大限度的獲得血清。2.抗人全血清的制備 抗原-福氏完全佐劑：取混合人全血清，用生理鹽水作1:4稀釋。將稀釋血清按與完全佐劑1:1體積的比例混合，制成油包水狀態(tài)。具體方法如下：1)研磨法：取完全佐劑置于無菌研缽中，然后逐滴加入稀釋混合人血清，邊加邊研磨，直至滴一滴至水中不散開為止，此即完全乳化的油包水狀態(tài)。若系不完全佐劑，則像加入人全血清那樣，按220mg/ml的量加入卡介苗。2)注射器法：即用兩個注射器對接，使佐劑與抗原往返推拉，以至乳化。另外，也可將佐劑置磁力攪拌器上，邊攪拌，邊滴加抗原并繼續(xù)攪拌，使其完全乳化。 抗原-福氏完全佐劑免疫動物：取健康家兔，用剪刀

11、減去家兔雙后足足掌的毛，碘酒和酒精棉球消毒。每只足掌注射抗原-福氏完全佐劑0.5ml ,每只家兔注射量1ml。兩周后，再于腘窩淋巴結(jié)內(nèi)注射抗原-福氏完全佐劑，每側(cè)注射量仍為0.5ml 。 無佐劑的人血清加強(qiáng)免疫：上述免疫一周后，耳靜脈注射人血清（1:2稀釋）0.5ml 左右以加強(qiáng)免疫,如此重復(fù)12次，并于最后一次注射一周后采血。 試血：采血方法同傷寒沙門菌O抗血清制備。試血時，環(huán)狀沉淀測定的抗體效價達(dá)到1:5000，雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)效價達(dá)到1:16以上即可放血收集血清。如效價不夠，可追加免疫。 抗血清采集：頸動脈放血或心臟采血獲得的兔血，置37促進(jìn)血塊收縮，并用毛細(xì)吸管吸取血清，經(jīng)3000r

12、/min離心去除殘留的紅細(xì)胞。3.抗血清的鑒定 獲得的免疫血清需要進(jìn)行特異性檢測、親和力測定和效價滴定。針對顆粒性抗原的免疫血清效價，可通過凝集或溶細(xì)胞試驗(yàn)（如溶血素效價滴定）檢測。可溶性抗原相應(yīng)抗體的效價和純度多選用環(huán)狀沉淀、瓊脂擴(kuò)散和免疫電泳的方法檢測。酶免疫測定、放射免疫分析及平衡透析等方法，可用于抗體的特異性和親和力測定?？寡彖b定的方法詳見后述相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。4抗血清的純化 更加精細(xì)的免疫試驗(yàn)需要從抗血清中提取免疫球蛋白，此過程稱為抗血清的純化。純化的步驟為：50%飽和硫酸銨鹽析以沉淀血清球蛋白，應(yīng)用透析或分子篩法除鹽。除鹽后的球蛋白過陰離子交換柱（DEAE-纖維素），根據(jù)不同類別免疫球蛋

13、白的等電點(diǎn)，選用不同pH和離子強(qiáng)度的緩沖液分別洗脫之；高滲或風(fēng)于法濃縮免疫球蛋白，若使用冷凍干燥器則可獲得干燥制品。5抗血清的保存 抗體的保存以濃度2030mg/ml為宜，加入萬分之一的硫柳汞或千分之一的疊氮鈉防腐，并加入等量的中性甘油，分裝小瓶，20以下保存，數(shù)月至數(shù)年內(nèi)抗體效價無明顯改變?！窘Y(jié)果分析】抗原免疫動物后獲得的抗血清，效價可用上述相應(yīng)試驗(yàn)判斷；其特異性則可通過雙擴(kuò)，免疫電泳或交叉凝集試驗(yàn)進(jìn)行考察。各試驗(yàn)結(jié)果的觀察和判斷參見響應(yīng)單元。此外，抗血清的外觀應(yīng)該為澄清，力求無溶血。無血液有型成分殘留和無細(xì)菌等微生物污染?！咀⒁馐马?xiàng)】1、動物的選擇 免疫血清的制備多選用家兔為免疫對象，若系

14、大量制備或二抗種屬特異性的需要，也可選用羊或馬。應(yīng)用的動物必須健康，且以雄性為佳。為了避免個體差異，每種抗原最好免疫3只以上動物。2抗原的準(zhǔn)備 全血清抗愿應(yīng)該選擇3人以上混合血清，以避免個體差異性；血清應(yīng)新鮮，以保持血清中各成分的活性。在細(xì)菌性抗原制備過程中，應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，保證其純度和避免對實(shí)驗(yàn)者的感染。3佐劑的準(zhǔn)備與使用 佐劑應(yīng)用于可溶性抗原的免疫，顆粒性抗原的免疫無需佐劑。佐劑與抗原混合研磨時，應(yīng)充分乳化，否則難以達(dá)到預(yù)期的免疫效果。在使用佐劑-抗原時，若難以吸入注射器，則可將連同裝有佐劑的容器置熱水上加熱，并選用較粗的注射針頭。注射完畢后，剩余佐劑-抗原置4保存。4免疫程序并非固定不變

15、，一般而言，不與佐劑一同免疫的抗原，免疫間隔時間較短，可每隔23天免疫一次。由于佐劑具有緩釋作用，于佐劑一起免疫的抗原可隔12周。無論有無佐劑，最后一次免疫一周后采取血清。加強(qiáng)免疫的劑量一般為首次劑量的1/52/5。如需制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫；若欲得到高效價的抗血清，則宜采用大劑量抗原長程免疫。由于免疫期限及間隔時間較長，要注意脫敏，尤其在進(jìn)行靜脈免疫時。脫敏的原則是少量多次注射抗原，例如，在靜脈注入抗原前，先將抗原少量注入腹腔，lh后再作緩慢靜脈注射。實(shí)驗(yàn)二 凝集反應(yīng)細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，當(dāng)與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，在適量電解質(zhì)存在的條件下，可逐漸聚集，出現(xiàn)肉眼可見

16、的凝集現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原（agglutinogen），抗體稱為凝集素（agglutinin）。反應(yīng)過程可分為兩階段：抗原抗體的特異結(jié)合；出現(xiàn)可見的顆粒凝集。凝集試驗(yàn)既是一個定性的檢測方法，即根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陽性或陰性；也是一個半定量的檢測方法，即將標(biāo)本作一系列對倍稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為滴度。由于凝集反應(yīng)方法簡便，敏感度高，因而在臨床檢驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩大類。通過以下實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐，掌握各種凝集反應(yīng)的原理，熟悉方法步驟、結(jié)果判斷以及注意事項(xiàng)。一 直接凝集反應(yīng)直接凝集（direct agglutinat

17、ion）反應(yīng)是指細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適量電解質(zhì)參與下，直接與相應(yīng)抗體結(jié)合而出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。常用的凝集試驗(yàn)有玻片法和試管法兩種。（一）玻片凝集試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】玻片凝集試驗(yàn)（slide agglutination test）多用作定性試驗(yàn)。一般是用1滴已知診斷血清與1滴受檢菌液或細(xì)胞懸液，在玻片上混勻后，短時間內(nèi)用肉眼觀察結(jié)果。出現(xiàn)顆粒凝集的為陽性反應(yīng)。此法簡便、快速，適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型。也常用于紅細(xì)胞ABO血型的鑒定。【器材試劑】1標(biāo)本任一常見細(xì)菌的平板或斜面培養(yǎng)物；待測血清2試劑與細(xì)菌相對應(yīng)的診斷血清（可用生理鹽水作適當(dāng)稀釋，以免發(fā)生前帶現(xiàn)象）、生理鹽水、已知

18、沙門傷寒菌菌體抗原懸液（7108/ml）、傷寒沙門菌O抗血清。方法步驟（以鑒定待測標(biāo)本中的細(xì)菌為例） 1、取潔凈玻片1張，用蠟筆劃分為左右2格。 2、用接種環(huán)按無菌操作取生理鹽水和已知診斷血清各2環(huán)分別置于左右格內(nèi)。 3、用接種環(huán)取標(biāo)準(zhǔn)菌液少許于左格生理鹽水中混勻， 4、滅菌接種環(huán)，同樣方法取待檢菌液少許于右格診斷血清并混勻。 5、將玻片輕輕晃動，室溫下觀察結(jié)果，【結(jié)果分析】生理鹽水對照測不出現(xiàn)凝集，為均勻混濁的乳狀液。在診斷血清中，細(xì)菌與相應(yīng)抗體反應(yīng)會出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，為陽性結(jié)果。如與對照測相同不發(fā)生凝集則為陰性?！咀⒁馐马?xiàng)】 1每一待檢菌均需作生理鹽水對照，以排除當(dāng)細(xì)菌發(fā)生SR變異時的

19、細(xì)菌自凝，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2在載波片兩端涂布細(xì)菌時，應(yīng)先涂生理鹽水一側(cè)，后涂診斷血清一側(cè)，以免將血清誤帶入生理鹽水一側(cè)3試驗(yàn)后的細(xì)菌仍有傳染性，應(yīng)將玻片放入消毒缸內(nèi)4若作ABO血型鑒定，室溫過低（10以下）可出現(xiàn)冷凝集，造成假陽性結(jié)果。5嚴(yán)格無菌操作。（二）試管凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)（tube agglutination test）為半定量試驗(yàn)，在微生物學(xué)檢驗(yàn)中常用已知細(xì)菌作為抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合，保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度，通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價（titer），亦稱為滴度。在試驗(yàn)中，由于電解質(zhì)濃度和pH不適當(dāng)?shù)仍?，可引起抗原的非特異性凝集?/p>

20、出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，因此必須設(shè)不加抗體的稀釋液作對照組。臨床上常用的直接試管凝集試驗(yàn)為肥達(dá)試驗(yàn)（Widal test）和外斐試驗(yàn)（Weil-Felix test）。在輸血時也常用于受體和供體兩者的紅細(xì)胞和血清的交互配血試驗(yàn)。（方法步驟見肥達(dá)試驗(yàn)）二間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的與免疫特異性無關(guān)的顆粒性載體的表面，形成人工的免疫微球（或致敏載體），然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應(yīng)（indirect agglutination）或被動凝集反應(yīng)（passive agglutination）。這種反應(yīng)適用于各種抗體和可溶性抗

21、原的檢測，其敏感度高于沉淀反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。（一）間接血凝試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】血凝試驗(yàn)（hem agglutination test）是紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的簡稱。間接血凝試驗(yàn)（indirect hem agglutination test）是將可溶性抗原（細(xì)菌的提取液等）吸附于紅細(xì)胞成為抗原致敏紅細(xì)胞，這種“致敏紅細(xì)胞”與相應(yīng)抗體作用可產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象（圖21）。以測定傷寒血清抗體滴度為例敘述如下：圖21 間接血凝試驗(yàn)原理示意圖【器材試劑】1傷寒桿菌“O”抗原2傷寒桿菌O901免疫兔血清。32%綿羊紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、試管、吸管、37水浴箱。4“O”抗原的制備：將傷寒桿菌O901接種

22、于柯氏瓶，37培養(yǎng)1824h，用生理鹽水洗下菌苔配制成每毫升含100億細(xì)菌的懸液，置100水中2h，離心沉淀，吸取上清液分裝于無菌試管，4冰箱保存?zhèn)溆谩?致敏紅細(xì)胞懸液制備： 取一定稀釋度的抗原（應(yīng)事先滴定）加等量2%綿羊紅細(xì)胞懸液，混合后放入37水浴箱中，每隔15min取出振搖1次，共經(jīng)2h，然后取出，用生理鹽水洗滌3次，再配制成0.25%懸液即成?！痉椒ú襟E】1取小試管10支，排于試管架上，于第1管中加入生理鹽水0.9ml，其余各管加0.25ml。2以吸管吸取已加熱滅活的免疫血清0.1ml，加入第1管，混勻后吸取0.75ml，于第2管中加0.25ml，余下0.5ml棄去。3將第2管血清與鹽

23、水混合后，吸取0.25ml至第3管。如此依次稀釋到第9管，自第9管中吸出0.25ml棄去。第10管不加血清留作對照。4于每管加入等量已致敏的0.25%綿羊紅細(xì)胞懸液，混勻后放入37水浴中2h觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果分析】凡紅細(xì)胞沉積于管底，集中呈一圓點(diǎn)的為不凝集（一）。如紅細(xì)胞凝集，則分布于管底周圍。根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱（圖22），以凝集的孔為滴度終點(diǎn)。：紅細(xì)胞沉積于管底；：紅細(xì)胞沉積于管底，周圍有散在少量凝集；：紅細(xì)胞形成層凝集，面積較小，邊緣較松散；：紅細(xì)胞形成片層凝集，面積略多于；：紅細(xì)胞形成片層凝集，均勻布滿孔底，或邊緣皺縮如花邊狀呈現(xiàn)明顯血凝（）試管中免疫血清的最高稀釋倍數(shù)

24、，即為該血清的間接血凝效價?！咀⒁馐马?xiàng)】參照反向間接血凝試驗(yàn)（二）反向間接血凝試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】把純化的抗體吸附于醛化紅細(xì)胞上，即制成抗體致敏的紅細(xì)胞，它能與相應(yīng)可溶性抗原結(jié)合，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，此即反向間接血凝試驗(yàn)（reverse indirect hem agglutination test）（圖23）。常用于檢查HBsAg、甲胎蛋白、新型隱球莢膜抗原等可溶性抗原。圖23 反向間接血凝示意圖【器材試劑】11:20抗-HBs致敏的醛化紅細(xì)胞，純化的1:20抗-HBs，待檢血清，稀釋液。2配制致敏紅細(xì)胞懸液：于每瓶凍干診斷紅細(xì)胞加4ml稀釋液，輕輕旋搖使成均勻紅細(xì)胞懸液，濃度約為0.6%。3“V”

25、型微量血凝板，0.025稀釋棒，微量攪拌器，刻度吸管，滴管（40滴/ml）?！痉椒ú襟E】（試驗(yàn)加樣程序見表21）1在“V”型血凝板上，每份待檢血清設(shè)立8孔，于各孔內(nèi)用40滴/ml滴管各加1滴稀釋液（相當(dāng)于0.025ml）。2用0.025ml容量的稀釋棒蘸滿待檢血清分別依次在各孔內(nèi)捻轉(zhuǎn)作倍比稀釋（一般每孔均需捻轉(zhuǎn)10次左右），直至第7孔、第8孔為致敏紅細(xì)胞對照。另設(shè)第9孔為陽性對照，加0.025mlHBsAg陽性血清。3于每孔中加入0.025ml混勻的致敏紅細(xì)胞懸液。依照表214將血凝板置于微型振蕩器上振蕩12min，置371h后觀察結(jié)果。表21 反向間接血凝試驗(yàn)加樣程序孔號123456789生

26、理鹽水0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025待檢血清0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025陽性血清致敏紅細(xì)胞0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025血清稀釋度1:41:81:161:321:64 1:1281:256紅細(xì)胞對照陽性對照37h觀察結(jié)果【結(jié)果分析】不凝集：紅細(xì)胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圓點(diǎn)。明顯凝集（+）：紅細(xì)胞于孔底形成簿膜狀凝集，中央可見疏松的紅點(diǎn)。出現(xiàn)明顯凝集的血清最高稀釋度即為HbsAg效價，凡效價1:16者需進(jìn)一步做中和試驗(yàn)。中和試

27、驗(yàn)：在血凝板上每份標(biāo)本設(shè)測定排與對照排，每排8孔，于每孔加稀釋液0.025ml，用2只稀釋棒蘸取被檢血清，分別在第2排作倍比稀釋至第7孔，第8孔不含血清，為紅細(xì)胞對照。然后，于測定排各孔加稀釋液0.025ml，對照排各孔加1:20抗-HBs0.025ml。12min后，血凝板置3730min。取出，于各孔加0.025ml致敏紅細(xì)胞振搖混勻，置371h后觀察結(jié)果?！咀⒁馐马?xiàng)】1致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時間短，且易變脆、溶血和污染，所以配制的致敏紅細(xì)胞懸液一般在當(dāng)天用完，若置210，使用期不超過3d。若想長期保存而不溶血，可在致敏前先將紅細(xì)胞醛化。常用的醛類有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。紅細(xì)胞經(jīng)醛化后體積

28、略有增大，兩面突起呈圓盤狀。2試驗(yàn)用的血凝板、滴管、稀釋棒等器材必須十分清潔，否則易造成非特異性凝集。3血凝板、稀釋棒用后均需用體積分?jǐn)?shù)為10%次氯酸鈉浸過夜；滴管需煮佛10min，然后用水沖凈，再用蒸餾水沖洗，晾干備用。4致敏用的抗原或抗體要求純度高，并保持良好的免疫活性。（三）膠乳凝集抑制試驗(yàn)在呈陽性反應(yīng)的乳膠集凝試驗(yàn)中，若先將待測抗原（抗體）與已知的抗體（抗原）混合，隔一定時間后再加入抗原（抗體）致敏的乳膠顆粒，此時，通過觀察原有的陽性試驗(yàn)結(jié)果是否轉(zhuǎn)陰而得出結(jié)果（圖24），此為膠乳凝集抑制試驗(yàn)（indirect agglutination inhibition test）。本次實(shí)驗(yàn)以臨床

29、上常用的檢測絨毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠試驗(yàn)（preg- nancy testing）為例。圖24 間接凝集抑制試驗(yàn)原理示意圖【實(shí)驗(yàn)原理】將含有可溶性抗原的待測標(biāo)本先與已知抗體混合，充分作用后再加入抗原致敏的乳膠顆粒，因抗體已與標(biāo)本中的可溶性抗原結(jié)合，乳膠顆粒不再出現(xiàn)可見凝集現(xiàn)象?！酒鞑脑噭?HCG致敏乳膠試劑妊娠診斷試劑（有商品出售）。2抗HCG抗體與妊娠診斷試劑配套供應(yīng)。3孕婦尿液、正常人尿液、待測尿液均可臨床篩選獲得。4生理鹽水、黑色方格反應(yīng)板、牙簽、毛細(xì)滴管、刻度吸管、試管、水浴箱等等?！痉椒ú襟E】1、在黑色方格反應(yīng)板上取3 個格，用毛細(xì)滴管分別加待測尿液，、孕婦尿液、正常人尿液

30、（或生理鹽水）1滴，然后每格加抗HCG抗體1滴，分別用牙簽混勻后連續(xù)搖動12min。2、于上述3格每格加HCG致敏乳膠試劑1滴，分別用牙簽混勻后，連續(xù)搖動23min后觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果分析】如試驗(yàn)格出現(xiàn)明顯凝集為陰性反應(yīng)，即HCG陰性；不出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，即HCG陽性?！咀⒁馐马?xiàng)】1、乳膠抗原使用前一定要搖勻。2、放置時間不應(yīng)過長，一般不超過5min。3、注意不出現(xiàn)凝集為陽性，出現(xiàn)凝集為陰性。4、測定HCG時最好取晨尿，待測標(biāo)本如試劑的加入順序應(yīng)遵守規(guī)定的步驟，否則無法判斷結(jié)果。（四）金黃色葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】金黃色葡萄的細(xì)胞壁成分中，含有一種稱為A蛋白的抗原物質(zhì)（SP

31、A）能與人及多種哺乳動物IgG的Fc段發(fā)生非特異性結(jié)合，因此可利用金黃色葡萄球菌為載體吸附IgG。當(dāng)SPA與IgG相應(yīng)結(jié)合后有抗體活性的Fab段暴露于SPA菌表面，此時若有與該IgG相應(yīng)的特異性抗原存在時，則可發(fā)生凝集反應(yīng)，即為金黃色葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn)（staphylococcal protein A co agglutination test）（圖25）。本試驗(yàn)是反向間接凝集試驗(yàn)的一種，特異性及敏感性均高，主要用于檢測可溶性微量抗原。圖25 協(xié)同凝集試驗(yàn)原理示意圖【器材試劑】1、流行腦膜炎病人腦脊液（用前經(jīng)煮沸處理2min，并適當(dāng)稀釋）。2、A群腦膜炎球菌家兔免疫血清（用前經(jīng)5630

32、min滅活）。3、SPA菌穩(wěn)定液。制備過程為：選取能產(chǎn)生SPA的金黃色葡萄球菌Cowan I株接種在瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37孵育1824h，。用少量PBS洗下菌苔，以3000r/min離心30min，其沉淀物用PBS洗2次，然后以含0.5%福爾馬林0.01mol/LPBS制成10%懸液，置室溫作用6h或過夜。再將此懸液加熱5630min，迅速冷卻，再以PBS洗3次，最后用含0.05%0.1%NaN3的PBS制成10%懸液，置4冰箱保存?zhèn)溆谩?、抗體標(biāo)記SPA菌的制備將SPA菌穩(wěn)定液用PBS洗1次后，再用PBS制成2%的懸液，用PBS將免疫血清稀釋成適宜濃度，一般可將測定合適的稀釋度減少半倍（如適

33、宜濃度為1:8，則實(shí)際應(yīng)用為1:6）。將2%SPA菌穩(wěn)定液與稀釋免疫血清等量混合，置37水浴中30min（也可置4冰箱過夜）。取出混合液后，以3000r/min離心30min，棄上清，其沉淀物用PBS洗2次，然后用含0.05%0.1%NaN3，制成2%懸液，放4冰箱保存?zhèn)溆?，一般可保?個月左右，其敏感性不變?！痉椒ú襟E】1取潔凈玻片1張，將其分為3大格，第1格及第2格先各加1滴抗體標(biāo)記SPA菌液，第3格加1滴未經(jīng)抗體標(biāo)記的葡萄球菌菌液。2然后第1格及第3格各加1滴病人腦脊液，第2格加1滴生理鹽水。3分別用牙簽混合均勻并不斷搖動玻片，在日光燈下觀察結(jié)果，一般在幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)。分析各格反應(yīng)有何

34、不同，并作出判斷?！窘Y(jié)果分析】第1格內(nèi)形成白色凝集物，第2、3格內(nèi)無凝集。【注意事項(xiàng)】 1、用前仔細(xì)檢查試劑本身有無自凝顆粒。2、本試驗(yàn)的特異性取決于標(biāo)記用抗血清的特異性，凝集反應(yīng)的強(qiáng)弱取決于抗血清的效價高低，故應(yīng)選用特異性強(qiáng)和效價高的抗血清實(shí)驗(yàn)三沉淀反應(yīng)一環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)【目的要求】要求掌握實(shí)驗(yàn)原理，熟悉其方法步驟，了解其檢測意義。實(shí)驗(yàn)原理可溶性抗原（如血清、細(xì)菌浸出液、毒素等）和相應(yīng)抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下可發(fā)生結(jié)合，經(jīng)過一定的時間，在二者比例適當(dāng)時形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)（precipitation）。環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)是把可溶性抗原小心加入已含抗體溶液的環(huán)狀沉淀管液面上，當(dāng)對應(yīng)的抗原與抗體相

35、遇，在二者交界面處可出現(xiàn)乳白色環(huán)狀沉淀物，即為環(huán)狀沉淀陽性反應(yīng)?！酒鞑脑噭?標(biāo)本人待檢血清 2試劑稀釋雞血清、抗人血清、生理鹽水 3器材沉淀小管（內(nèi)徑1.53mm）或小試管、毛細(xì)吸管、試管架等【方法步驟】 1取3支沉淀小管，排列于試管架并作好標(biāo)記； 2在1號、2號兩支試管內(nèi)分別加入抗人血清0.4ml，3號試管內(nèi)加入0.4ml生理鹽水作為對照； 3再在1號、3號試管內(nèi)分別加入人待檢血清0.2ml，2號試管內(nèi)加入雞血清0.2ml； 4室溫靜置10分鐘，觀察結(jié)果。【結(jié)果分析】11號試管兩液面交界處出現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)，為環(huán)狀沉淀試驗(yàn)陽性，2號和3號試管為陰性。2由于沉淀反應(yīng)抗原多系膠體溶液，沉淀物主要

36、是由抗體蛋白所組成，為求得抗原與抗體的適宜比例，故操作中通常是稀釋抗原而不稀釋抗體，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價。3本試驗(yàn)常用于抗原的定性試驗(yàn)，如診斷炭疽的Ascoli 試驗(yàn)、血跡的鑒別等?！咀⒁馐马?xiàng)】1加抗原時應(yīng)使沉淀管傾斜，使其緩慢由管壁流下，輕浮于抗體上面，勿使相混，避免氣泡產(chǎn)生。2觀察結(jié)果時將沉淀管平放在眼前，如在沉淀管后面襯以黑紙或手指，使光線從斜上方射入兩液面膠結(jié)處，則能更清楚地看到沉淀環(huán)。二雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)【目的要求】要求掌握試驗(yàn)原理、結(jié)果分析，熟悉其方法步驟?！緦?shí)驗(yàn)原理】將對應(yīng)的抗原與抗體放在瓊脂凝膠板中的相應(yīng)孔內(nèi)，讓二者在凝膠中自由擴(kuò)散。當(dāng)二者相遇時發(fā)生特異性反應(yīng)，在濃

37、度比例合適處形成可見的白色沉淀線。若同時含有多種抗原抗體系統(tǒng)，根據(jù)抗原與抗體的性質(zhì)、純度和比例的不同，沉淀線的形狀、位置和數(shù)量不一?！酒鞑脑噭?標(biāo)本待檢人血清、陽性對照血清。 2試劑羊抗人IgG診斷血清、15g/L鹽水瓊脂等。 3器材載玻片、吸管、打孔器、濕盒、微量加樣器等?！痉椒ú襟E】1澆板用粗孔吸管吸取熔化的15g/L鹽水瓊脂4.5ml ,澆注于潔凈載玻片上，要均勻、平整、無氣泡、布滿整個玻片。2打孔待瓊脂凝固后，用直徑3mm的打孔器打孔，使孔間距為4 5mm。臨床常用的孔型為梅花形，中間為抗體孔，四周等距排列6個抗原孔。3加樣用微量加樣器向中央孔加入抗體（羊抗人IgG診斷血清），周圍孔

38、加入待測抗原，其中第1、4孔加入陽性對照血清，第2、3、5、6孔分別加入不同的待檢血清。如用于檢測抗體特異性時，中央孔加抗血清，四周孔加入不同的有關(guān)抗原。如進(jìn)行抗體效價滴定時，則在中央孔加入抗原，四周孔加入不同稀釋的抗血清。4擴(kuò)散將加好樣的瓊脂板放入濕盒中（內(nèi)有5mol/L的石炭酸紗布），置室溫或3712d，于24h和48h各觀察和記錄結(jié)果一次?！窘Y(jié)果分析】1如果凝膠中出現(xiàn)白色沉淀線，說明抗原與抗體相對應(yīng)。若抗原與抗體只含單一的成分則形成一條沉淀線；若含多種成分，可形成多條沉淀線。沉淀線的位置因抗原和抗體的分子量、濃度比例、擴(kuò)散速度等因素不同而異。另外，若相臨抗原濃度相等，可出現(xiàn)對稱相融的沉淀

39、線；若不等，沉淀線移向低濃度一邊。2在梅花孔型中，若相臨兩條沉淀線完全融合，說明兩抗原部分相同；若相臨沉淀線發(fā)生交叉，說明兩抗原完全相同。3陽性結(jié)果多在24h以內(nèi)出現(xiàn)，48h不出現(xiàn)沉淀線可判為陰性結(jié)果。放置過久可使沉淀線消失。4此方法簡便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠；但靈敏度低，試驗(yàn)所需時間長，且只能定性，不能定量，僅適用于大量普查項(xiàng)目?！咀⒁馐马?xiàng)】1所用載玻片要潔凈、邊緣無破損，否則難以澆制瓊脂板。2緩沖瓊脂的溫度要適宜，溫度過高澆板時易外溢，同時表面蒸發(fā)量大，瓊脂板光潔度差；但溫度過低則瓊脂凝固過快，制板厚度不均勻，表面不光滑。3澆制瓊脂板時動作要迅速，過于緩慢容易邊加邊凝，使瓊脂板凹凸不平。4打孔

40、時要小心，勿使瓊脂層脫離載玻片或瓊脂板底層開裂，以免加樣時順裂縫或底部散失。一旦出現(xiàn)裂縫或脫離現(xiàn)象，可向孔內(nèi)滴加少許溫瓊脂加以彌補(bǔ)或?qū)傊逶诨鹧娓咛巵砘赝ㄟ^幾次補(bǔ)底。5為了使沉淀線保持清晰度，可在加樣完畢將瓊脂板置37下進(jìn)行擴(kuò)散，形成沉淀線后置室溫或4冰箱為佳。三單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)【目的要】求要求掌握試驗(yàn)原理、熟悉試驗(yàn)方法及結(jié)果分析，了解其臨床意義?！緦?shí)驗(yàn)原理】將一定量抗體混勻于瓊脂凝膠內(nèi)，凝膠孔中加入抗原，抗原向四周擴(kuò)散的過程中與凝膠中的抗體發(fā)生反應(yīng)，在抗原與抗體比例合適處形成抗原抗體復(fù)合物，呈現(xiàn)白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)直徑的大小與孔中抗原濃度成正比。如預(yù)先用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，可

41、從已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待檢標(biāo)本中抗原的含量?！酒鞑脑噭?標(biāo)本待檢人血清、免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)（IgG含量10mg/ml）。2試劑羊抗人IgG診斷血清（單擴(kuò)效價160）、15g/L鹽水瓊脂。3器材三角燒瓶、載玻片、打孔器、吸管、滴管、濕盒、水浴箱、微量加樣器和半對數(shù)坐標(biāo)紙等。【方法步驟】1瓊脂準(zhǔn)備吸取已熔化瓊脂59ml于三角燒瓶中，置56水浴保溫，將預(yù)溫的羊抗人IgG診斷血清1ml與瓊脂充分混合，繼續(xù)保溫于56備用。如果羊抗人IgG診斷血清的單擴(kuò)效價不是160，試驗(yàn)時所需瓊脂量與抗體量的比例應(yīng)加以調(diào)整。2澆板取混有抗血清的瓊脂液4.5ml澆注于載玻片上，注意澆板要均勻、平整、無氣泡、布滿整張載玻

42、片。3打孔待瓊脂凝固后，用打孔器打孔，孔徑3.5mm，孔距1012mm?？滓虻脠A整光滑，邊緣不要破裂，底部不要與載玻片脫離。如有脫離應(yīng)注意補(bǔ)底。4加樣將待檢血清用生理鹽水做140稀釋，用微量加樣器取稀釋血清10l加入相應(yīng)的試驗(yàn)孔內(nèi)，每份標(biāo)本加兩孔。如同時測定多個標(biāo)本，注意做好標(biāo)記，認(rèn)真記錄，不要搞混。另外，取免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)1支加0.5ml 蒸餾水溶解，用生理鹽水稀釋成如下濃度：110、116、120、132、140，分別加入另一套孔中，每孔中加10l，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。5擴(kuò)散 將加樣完畢的瓊脂放于濕盒中，置室溫或37 24h后觀察結(jié)果。6繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以各稀釋度工作標(biāo)準(zhǔn)的沉淀環(huán)直徑為橫坐

43、標(biāo)，相應(yīng)孔中IgG含量為縱坐標(biāo)，在半數(shù)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。【結(jié)果分析】1精確測量各試驗(yàn)孔沉淀環(huán)直徑，如果沉淀環(huán)不太圓，則取最大直徑和最小直徑的平均值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相對應(yīng)的IgG含量，乘以稀釋倍數(shù)，即為待檢血清中IgG的實(shí)際含量。2瓊脂單擴(kuò)散試驗(yàn)為定量測定法，常用于血清中IgG、IgA、IgM、補(bǔ)體、白蛋白、蛋白酶等物質(zhì)的定量測定，為臨床診斷提供參考指標(biāo)。3本方法比較穩(wěn)定，易于操作；但觀察結(jié)果需時間長，敏感度偏低，每次試驗(yàn)均需做參考血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線?！咀⒁馐马?xiàng)】1澆制瓊脂板的事項(xiàng)同凝膠雙擴(kuò)散試驗(yàn)。2每批試驗(yàn)均應(yīng)同步繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。即檢測待檢血清所用瓊脂板應(yīng)和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線采用的瓊脂板為同一批瓊脂板。

44、3瓊脂熔化后置水浴中保溫時，溫度不可超過56，否則會使抗體變性；溫度也不可過低，否則瓊脂易凝固而不能澆制出很好的瓊脂板。四對流免疫電泳【目的要求】本實(shí)驗(yàn)以測定血清中AFP為例，要求掌握實(shí)驗(yàn)原理、熟悉操作過程和結(jié)果分析；了解臨床應(yīng)用及意義?！緦?shí)驗(yàn)原理】對流免疫電泳實(shí)質(zhì)上是定向加速的電泳技術(shù)與免疫雙擴(kuò)散技術(shù)的結(jié)合。在偏堿性的緩沖液環(huán)境和適當(dāng)?shù)闹绷麟妶鲋校蟛糠挚乖瓗в休^多的負(fù)電荷，電泳力大于電滲力，向正極移動；而抗體（尤其是IgG）在同樣的環(huán)境中帶負(fù)電荷較少，而且其分子量又較大，加上凝膠內(nèi)較強(qiáng)的電滲作用，故抗體電泳力小于電滲力，向負(fù)極移動。試驗(yàn)中將抗原放負(fù)極，抗體放正極，在一定的時間內(nèi)（約3090

45、min），移動的抗原與抗體在兩孔間相遇并發(fā)生反應(yīng)，在濃度比例適當(dāng)時形成沉淀線?！酒鞑脑噭?標(biāo)本待測人血清、陽性對照血清。2試劑 AFP診斷血清、pH8.6 0.05mol/L巴比妥緩沖液、15g/L瓊脂（用pH8.6 0.05mol/L巴比妥溶液配制）。3器材電泳槽、電泳儀、孔型模板、打孔器、載玻片、吸管、微量加樣器、吸球、濾紙或紗布條等?！痉椒ú襟E】1制板用粗孔吸管吸取已熔化好的巴比妥瓊脂4.5ml加到潔凈載玻片上澆制成瓊脂板。2打孔待瓊脂凝固后成對打孔，孔徑為3mm，孔距為5mm。3加樣做好抗原和抗體的標(biāo)記（例如在無關(guān)緊要的邊緣打一小孔等），按標(biāo)記分別加入抗原、抗體及陽性對照。4電泳將加

46、樣完畢的瓊脂板置電泳槽的支架上，抗原孔置陰極端，抗體孔置陽極端，電泳槽內(nèi)加0.05mol/L PH8.6的巴比妥緩沖液，液面至槽高2/3處，瓊脂板兩端用濾紙條或紗布條與緩沖液相連。接通電源，控制電流強(qiáng)度在2.53.5mA/cm板寬。電泳3090min后切斷電源，取出瓊脂板觀察結(jié)果。【結(jié)果分析】1待測孔與抗血清之間出現(xiàn)沉淀線為陽性，否則為陰性。2陽性結(jié)果的沉淀線位置與抗原和抗體分子的電荷情況有關(guān)，也與抗原和抗體的濃度比例有一定關(guān)系。3對流免疫電泳實(shí)際上是電場作用下的瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)，操作簡便，觀察結(jié)果快，敏感度比瓊脂雙擴(kuò)散法高816倍。制作瓊脂板時必須選擇高電滲作用的普通瓊脂，還要選擇高特異性、高

47、親和力的抗體，否則結(jié)果難以解釋。4該方法可用于抗原的半定量測定或根據(jù)沉淀線的位置、形狀做抗原和抗體相對濃度的分析。但分辯率較差，當(dāng)有多種抗原抗體系統(tǒng)存在時，形成的沉淀線常形成重疊，難以分辯清楚，所以用作此目的時，反倒不如瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)。【注意事項(xiàng)】1澆制瓊脂板的注意事項(xiàng)同瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)。2搭橋時應(yīng)注意與凝膠接觸緊密，否則會使電流不均勻，致使沉淀線歪斜、不均勻。3電泳時抗原、抗體電極方向不可放反。4電泳時間和電流強(qiáng)度及孔間距有關(guān)，電泳時電流不可太大，以免蛋白質(zhì)變性，孔間距如果較大應(yīng)適當(dāng)延長電泳時間。5電泳完畢，先斷電源（不僅關(guān)閉電源按鈕，一定要脫開電泳槽和電泳儀之間的連接線，以防積蓄電壓觸電），

48、再取出電泳板。6抗體或抗原要根據(jù)所標(biāo)效價做適當(dāng)稀釋，多做幾個稀釋度，選擇最適的比例關(guān)系。五火箭電泳【目的要求】要求掌握火箭電泳的原理，熟悉其操作方法，了解其應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)原理將凝膠單擴(kuò)散的瓊脂板置人直流電場，板孔中的抗原因帶有負(fù)電荷會在含有抗體的離子瓊脂中向正極泳動，并于比例合適處與抗體發(fā)生反應(yīng)，在泳道上形成可見的沉淀帶。泳動中的抗原濃度越來越小，沉淀帶越來越窄，直至全部抗原與抗體結(jié)合，形成一個錐形的沉淀峰。整個沉淀帶的形狀呈火箭樣，故名火箭電泳?？乖吭礁?，所形成的火箭峰就越長。將沉淀峰與事先用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可得出標(biāo)本中抗原的含量。【器材試劑】 1標(biāo)本待檢人血清、

49、陽性血清(臍帶血清)。 2試劑抗AFP抗體、pH8.6 0.05molL巴比妥緩沖液、精制瓊脂粉或瓊脂糖等。 3器材電泳槽、電泳儀、打孔器、水浴箱、玻璃板、吸管、三角燒瓶和微量加樣器等?！痉椒ú襟E】 1常規(guī)配制pH8.6 0.05molL巴比妥緩沖液，稱取1.5g精制瓊脂粉或瓊脂糖加到100ml緩沖液中，在三角燒瓶內(nèi)加熱熔化。 2將熔化好的瓊脂置56恒溫水浴中預(yù)溫，待溫度平衡(瓊脂膠溫度為56)后，將抗AFP抗體加到瓊脂液中，二者比例為130。搖勻后迅速澆制瓊脂板。 3待瓊脂凝固后在瓊脂板的一端(距板端約5mm)打孔，孔徑3mm，孔間距68mm，孔的數(shù)目根據(jù)需要而定。 4向每孔加入不同稀釋度的

50、待檢血清，其稀釋倍數(shù)分別是5、10、20、40、80。另外，向另一板的孔中加入系列已知濃度的陽性血清或其他抗原，用來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5電泳槽內(nèi)加入pH8.6 0.05molL巴比妥緩沖液至槽高的23處。將加樣完畢的瓊脂板置電泳槽的支架上，將打孔加樣端置陰極，用濾紙或紗布條將凝膠板與電泳液相連。接通電源，調(diào)整電流強(qiáng)度在24mAcm板寬。電泳12h可見火箭峰的出現(xiàn)。 6電泳結(jié)束后，切斷電源，取下瓊脂板，如沉淀峰清晰可見，可直接判讀結(jié)果，否則將瓊脂板浸入10gL鞣酸生理鹽水中10分鐘，可使沉淀峰更明顯。如欲永久保留，可將瓊脂板進(jìn)行染色干燥處理。【結(jié)果分析】 1首先測量已知抗原的火箭峰高度，以此為橫坐

51、標(biāo)，以對應(yīng)濃度為縱坐標(biāo)作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品的定量可根據(jù)峰高從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。 2火箭峰高度與孔中抗原濃度呈正相關(guān)，與凝膠中抗體濃度呈負(fù)相關(guān)。但抗原濃度過高則在瓊脂板上看不到峰頂；而抗體濃度過高則沉淀峰太低，降低試驗(yàn)的敏感度。 3沉淀峰呈尖角狀表示無游離抗原，泳動已到終點(diǎn)；前端呈鈍圓形或云霧狀則表示還未到終點(diǎn)，應(yīng)繼續(xù)電泳。 4用多價抗血清時每個火箭可出現(xiàn)多個子峰；抗原與抗體比例不適合或電泳條件不適當(dāng)時不出現(xiàn)火箭峰。 5與前述幾個電泳方法相比，火箭電泳操作簡便省時，結(jié)果重復(fù)性好，檢測靈敏度可達(dá)0.3gm1。6如在抗原標(biāo)本中加入微量放射性核素，電泳后具有放射性的沉淀帶在暗室中可使膠片感光，

52、感光峰比凝膠中肉眼可見的火箭峰高得多此法稱火箭電泳放射自顯影，檢測靈敏度可提高4060倍?！咀⒁馐马?xiàng)】 1凝膠單擴(kuò)散中的注意事項(xiàng)在此均適用，例如加入抗體時要嚴(yán)格掌握瓊脂膠的溫度，抗原與抗體的濃度應(yīng)預(yù)先試驗(yàn)。 2應(yīng)選擇電滲作用最小的精制瓊脂粉或優(yōu)質(zhì)瓊脂糖來制備凝膠，而不用普通瓊脂。 3打孔完畢，可先將瓊脂板放在電泳槽上，低電流通電后再加樣，加樣后立即加大電流。這樣可防止抗原液向孔四周擴(kuò)散，使火箭峰形狀良好，敏感性增加。這一做法適用于所有打孔加樣的凝膠電泳。使用低電壓、低離子強(qiáng)度、電泳時間長些，效果會更好。4火箭電泳適用于測定那些在pH8.6以上環(huán)境中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，IgG、IgA等在pH8.6

53、條件下凈電荷幾乎等于零，因此要使IgG、IgA等在電場中也向正極泳動，應(yīng)先經(jīng)乙?；?、甲?；虬奔柞；幚韥碓黾铀鼈兊呢?fù)電荷。甲?；姆椒ǎ喝〈龣z血清若干，用0.36甲醛稀釋至分析要求的濃度，室溫30min，即可使蛋白質(zhì)分子中的氨基與甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)，該反應(yīng)抑制了蛋白質(zhì)分子中堿性基團(tuán)的解離，使其形成某種酸，因此在pH8.6的堿性條件下增加了其負(fù)電荷量。六免疫電泳【目的要求】本試驗(yàn)以鑒定人血清IgG提取物的純度為例，掌握免疫電泳的原理，熟悉操作方法，了解結(jié)果分析及臨床應(yīng)用?！緦?shí)驗(yàn)原理】免疫電泳(immunoeletrophoresis，IEP)是瓊脂區(qū)帶電泳和凝膠雙擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫技術(shù)。試驗(yàn)時

54、先進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，將樣品中不同分子量和不同電荷的組分分離成若干區(qū)帶；然后與電泳方向平行挖一小槽，加入含相應(yīng)抗體的免疫血清，與已分離的各抗原成分在瓊脂中作雙向免疫擴(kuò)散。各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)位置與抗體形成弧形沉淀線。根據(jù)沉淀弧的位置、數(shù)量和形態(tài)，可分析樣品中所含抗原成分及其性質(zhì)?！酒鞑脑噭?1標(biāo)本正常人血清、待鑒定的人IgG提取液。 2試劑兔抗人全血清、pH8.6 0.05molL巴比妥緩沖液、12gL瓊脂巴比妥液凝膠、凝膠指示劑(葡萄糖0.5g和氨基黑10B 0.1g溶于20ml巴比妥緩沖液中)等。 3器材電泳儀、電泳槽、37溫箱、恒溫水浴箱、水平臺、載玻片、吸管、3mm打孔器、孔型樣板、尖頭棉

55、簽棒、毛細(xì)滴管、手術(shù)刀片、濕盒等?！痉椒ú襟E】 1瓊脂板制備加熱熔化巴比妥瓊脂膠，用粗口吸管吸取4ml瓊脂膠，澆注到置于水平臺上的潔凈載玻片上。凝固后按孔型樣板打孔、開槽。槽可用刀片劃制，也可用模具在澆注前放到載玻片上；打孔開槽時要求外壁整齊，防止瓊脂破裂。制成后瓊脂板厚約1.5mm，孔徑3mm(可加樣品10l)，槽寬1.52mm。 2加樣用微量加樣器吸取正常人血清和待檢的人IgG各10l分別加入兩個樣品孔中，注意不要外溢。為便于觀察樣品泳動位置可在正常人血清中加微量氨基黑染液。 3電泳將瓊脂板置于電泳槽內(nèi)進(jìn)行電泳?？刂齐娏?4mAcm板寬，當(dāng)?shù)鞍字甘緞┯緞又辆嗖鄱?.0cm時，可終止電泳(約1.5h)。 4雙擴(kuò)散電泳后取出瓊脂