微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)5-2-cmx2011

1、點(diǎn)評(píng) 1.菌落菌落-不稱(chēng)為點(diǎn)點(diǎn)或顆粒物。不稱(chēng)為點(diǎn)點(diǎn)或顆粒物。 2. 結(jié)果描述條理應(yīng)該清晰，而不是簡(jiǎn)單的堆砌。結(jié)果描述條理應(yīng)該清晰，而不是簡(jiǎn)單的堆砌。 3. 設(shè)計(jì)題完成情況不理想。設(shè)計(jì)題完成情況不理想。 4.顯微鏡使用，顯微鏡使用， 復(fù)位，清潔、簽字（尼康）。復(fù)位，清潔、簽字（尼康）。實(shí)驗(yàn)5 革蘭氏染色法莢膜染色 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康膙目的：目的：v1.鞏固顯微鏡操作技術(shù)及無(wú)菌操作技術(shù)鞏固顯微鏡操作技術(shù)及無(wú)菌操作技術(shù);v2.學(xué)習(xí)革蘭氏染色法以及莢膜染色法；學(xué)習(xí)革蘭氏染色法以及莢膜染色法；v3.掌握染色原理。掌握染色原理。二、原理二、原理v革蘭氏染色法革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性

2、菌可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌(G )和革蘭氏陰性菌和革蘭氏陰性菌(G )兩大類(lèi)，是細(xì)菌學(xué)上是常用的鑒兩大類(lèi)，是細(xì)菌學(xué)上是常用的鑒別染色法。別染色法。v該染色法所以能將細(xì)菌分為該染色法所以能將細(xì)菌分為G菌和菌和G菌，是由這兩類(lèi)菌，是由這兩類(lèi)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。vG菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚（菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚（20-80nm，15-50層）且交層）且交聯(lián)度高，類(lèi)脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖聯(lián)度高，類(lèi)脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏

3、色。顏色。 vG菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類(lèi)脂質(zhì)，而菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類(lèi)脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄且肽聚糖層較薄(10nm,2-3層層)、交聯(lián)度低，故用乙醇或、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類(lèi)脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使丙酮脫色時(shí)溶解了類(lèi)脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。色，再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。金黃色葡萄球菌革蘭氏染色圖金黃色葡萄球菌革蘭氏染色圖大腸桿菌革蘭氏染色圖大腸桿菌革蘭氏染色圖革蘭氏染色的實(shí)際意義革蘭氏染色的實(shí)際意義v(1)鑒別細(xì)菌鑒別

4、細(xì)菌:用此染色法可將所有細(xì)菌分為兩大用此染色法可將所有細(xì)菌分為兩大類(lèi)類(lèi),這樣可將致病菌的范圍縮小這樣可將致病菌的范圍縮小,然后再進(jìn)一步鑒定然后再進(jìn)一步鑒定. (2)選擇藥物選擇藥物:革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌在細(xì)革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌在細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)上有很大差別胞壁等結(jié)構(gòu)上有很大差別,因而對(duì)抗菌素等藥物的敏因而對(duì)抗菌素等藥物的敏感度不一感度不一.例如大多數(shù)陽(yáng)性菌對(duì)青霉素敏感，大多數(shù)例如大多數(shù)陽(yáng)性菌對(duì)青霉素敏感，大多數(shù)陰性菌對(duì)青霉素不敏感陰性菌對(duì)青霉素不敏感(腦膜炎球菌等除外腦膜炎球菌等除外),可供臨可供臨床實(shí)踐中選用抗菌藥物的參考床實(shí)踐中選用抗菌藥物的參考. (3)與致病性的關(guān)系與致病性的關(guān)

5、系:大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌的致病大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌的致病物質(zhì)主要為外毒素物質(zhì)主要為外毒素;而大多數(shù)革蘭氏陰性菌的致病物而大多數(shù)革蘭氏陰性菌的致病物質(zhì)主要為內(nèi)毒素。質(zhì)主要為內(nèi)毒素。v莢膜莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外的一層粘液狀或是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外的一層粘液狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)，含水量大，其他成分多為多膠質(zhì)狀物質(zhì)，含水量大，其他成分多為多糖、多肽或糖蛋白。糖、多肽或糖蛋白。v細(xì)菌莢膜染色細(xì)菌莢膜染色的原理是因?yàn)榍v膜和染料間的原理是因?yàn)榍v膜和染料間的親和力弱，不易著色，且易被水洗去，的親和力弱，不易著色，且易被水洗去，通常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體通常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從

6、而使莢膜在和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周?chē)室煌该魅?。由于莢膜的含水量菌體周?chē)室煌该魅?。由于莢膜的含水量在在90以上，固染色時(shí)一般不加熱固定，以上，固染色時(shí)一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。以免莢膜皺縮變形。v莢膜功能：莢膜功能： 抗吞噬作用：莢膜因其親水性及其空間占位、屏障作用，抗吞噬作用：莢膜因其親水性及其空間占位、屏障作用，可有效抵抗宿主吞噬細(xì)胞的吞噬作用?？捎行У挚顾拗魍淌杉?xì)胞的吞噬作用。 粘附作用：莢膜多糖可使細(xì)菌彼此間粘鏈，也可粘附于粘附作用：莢膜多糖可使細(xì)菌彼此間粘鏈，也可粘附于組織細(xì)胞或無(wú)生命物體表面，是引起感染的重要因素。組織細(xì)胞或無(wú)生命物體表面，是引起感染的重

7、要因素。 抗有害物質(zhì)的損傷作用：處于細(xì)菌細(xì)胞最外層，莢膜猶抗有害物質(zhì)的損傷作用：處于細(xì)菌細(xì)胞最外層，莢膜猶如盔甲可有效保護(hù)菌體免受或少受多種殺菌、抑菌物質(zhì)的如盔甲可有效保護(hù)菌體免受或少受多種殺菌、抑菌物質(zhì)的損傷，如溶菌酶、補(bǔ)體等。損傷，如溶菌酶、補(bǔ)體等。 抗干燥作用：莢膜多糖為高度水合分子，含水量在抗干燥作用：莢膜多糖為高度水合分子，含水量在95%以上，可幫助細(xì)菌抵抗干燥對(duì)生存的威脅。以上，可幫助細(xì)菌抵抗干燥對(duì)生存的威脅。v莢膜用途莢膜用途:用于菌種鑒定、用作藥物和生化試劑、用作工業(yè)原料等。有用于菌種鑒定、用作藥物和生化試劑、用作工業(yè)原料等。有莢膜的菌形成的菌膠團(tuán)對(duì)污水中的污染物有極強(qiáng)的吸附、

8、莢膜的菌形成的菌膠團(tuán)對(duì)污水中的污染物有極強(qiáng)的吸附、降解的作用。降解的作用。v形成條件：形成條件： 莢膜的形成與環(huán)境條件密切相關(guān)。一般在動(dòng)莢膜的形成與環(huán)境條件密切相關(guān)。一般在動(dòng)物體內(nèi)或含有血清或糖的培養(yǎng)基中容易形成物體內(nèi)或含有血清或糖的培養(yǎng)基中容易形成莢膜，在普通培養(yǎng)基上或連續(xù)傳代則易消失。莢膜，在普通培養(yǎng)基上或連續(xù)傳代則易消失。v產(chǎn)莢膜的細(xì)菌形成的菌落一般具有直徑產(chǎn)莢膜的細(xì)菌形成的菌落一般具有直徑較大較大，無(wú)色透明，無(wú)色透明，隆起隆起明顯，用接種環(huán)挑取時(shí)可明顯，用接種環(huán)挑取時(shí)可拉拉出粘絲出粘絲等特點(diǎn)。等特點(diǎn)。 三、實(shí)驗(yàn)材料v革蘭氏染色：革蘭氏染色：（1） 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌(Stap

9、hylococcus aureus)、大腸桿菌（、大腸桿菌（Escherichia coli）斜）斜面；或選用自己保種的細(xì)菌。面；或選用自己保種的細(xì)菌。（2） 革蘭氏染色液革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95乙醇、石炭酸復(fù)紅液等乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、（3） 香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。精燈。四、實(shí)驗(yàn)步驟菌體適中，菌體適中，玻璃涂成薄膜玻璃涂成薄膜，不宜太厚，不宜太厚，用后接種環(huán)用火焰滅菌。用后接種環(huán)用火焰滅菌。制作涂片制作涂片四、實(shí)驗(yàn)步驟晾干

10、，易于染色晾干，易于染色3-6次過(guò)火固定，強(qiáng)度適中，不宜燙手次過(guò)火固定，強(qiáng)度適中，不宜燙手初染初染1-2min，所有染色過(guò)程染液不可干涸，所有染色過(guò)程染液不可干涸水洗至水流無(wú)色水洗至水流無(wú)色媒染媒染先沖去殘留水，媒染先沖去殘留水，媒染1min，水洗并瀝干，水洗并瀝干脫色脫色脫色至流出液為無(wú)色，一般脫色至流出液為無(wú)色，一般20-30s-1min，水洗并瀝干。，水洗并瀝干。整個(gè)過(guò)程整個(gè)過(guò)程不要靠近火焰。不要靠近火焰。復(fù)染復(fù)染1-2min，所有染色過(guò)程染液不可干涸，所有染色過(guò)程染液不可干涸water水洗，晾干，鏡檢。水洗，晾干，鏡檢。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)v1、染料避免干涸，酒精脫色務(wù)必避開(kāi)火焰。、染料避

11、免干涸，酒精脫色務(wù)必避開(kāi)火焰。v2、老齡菌易被染成紅色（細(xì)胞通透性出現(xiàn)變化），造成假陰性。、老齡菌易被染成紅色（細(xì)胞通透性出現(xiàn)變化），造成假陰性。一般選用生長(zhǎng)活躍的菌體進(jìn)行染色。（一般選用生長(zhǎng)活躍的菌體進(jìn)行染色。（18h-32h）v3、涂片過(guò)厚或菌懸液過(guò)濃，導(dǎo)致細(xì)胞大量堆積，容易導(dǎo)致脫色、涂片過(guò)厚或菌懸液過(guò)濃，導(dǎo)致細(xì)胞大量堆積，容易導(dǎo)致脫色不完全，造成假陽(yáng)性。染色結(jié)果以不完全，造成假陽(yáng)性。染色結(jié)果以分散良好分散良好的細(xì)菌染色結(jié)果為準(zhǔn)。的細(xì)菌染色結(jié)果為準(zhǔn)。v4、酒精脫色不夠?qū)е录訇?yáng)性，脫色過(guò)渡導(dǎo)致假陰性。、酒精脫色不夠?qū)е录訇?yáng)性，脫色過(guò)渡導(dǎo)致假陰性。v5、控制好染色區(qū)域控制好染色區(qū)域，保證整個(gè)染

12、色過(guò)程及最后鏡檢在同一個(gè)區(qū)，保證整個(gè)染色過(guò)程及最后鏡檢在同一個(gè)區(qū)域進(jìn)行，可用鉛筆標(biāo)記域進(jìn)行，可用鉛筆標(biāo)記 。思考題思考題v可用什么方法證明革蘭氏染色是成功的？可用什么方法證明革蘭氏染色是成功的？v革蘭氏染色中，哪一個(gè)步驟可以省去而不影革蘭氏染色中，哪一個(gè)步驟可以省去而不影響最終結(jié)果？在什么情況下可以采用？響最終結(jié)果？在什么情況下可以采用？v革蘭氏染色哪一步最關(guān)鍵？革蘭氏染色哪一步最關(guān)鍵？ 五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果v大腸桿菌、金黃葡萄球菌革蘭氏染色，繪圖，大腸桿菌、金黃葡萄球菌革蘭氏染色，繪圖，并記錄染色結(jié)果（顏色，并記錄染色結(jié)果（顏色，G+或或G-）及放大倍）及放大倍數(shù)（包括物鏡及目鏡）等等。數(shù)（包

13、括物鏡及目鏡）等等。大腸桿菌光學(xué)顯微鏡圖（革蘭氏染色）大腸桿菌光學(xué)顯微鏡圖（革蘭氏染色） 放大倍數(shù)：放大倍數(shù)：1000 解析：大腸桿菌，桿狀，菌體為粉紅色，屬革蘭氏陰性菌解析：大腸桿菌，桿狀，菌體為粉紅色，屬革蘭氏陰性菌1. 細(xì)菌的革蘭氏染色細(xì)菌的革蘭氏染色金黃葡萄球菌光學(xué)顯微鏡圖（革蘭氏染色）金黃葡萄球菌光學(xué)顯微鏡圖（革蘭氏染色） 放大倍數(shù)：放大倍數(shù)：1000 莢膜染色莢膜染色v實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：(l) 同學(xué)們自己培養(yǎng)的細(xì)菌同學(xué)們自己培養(yǎng)的細(xì)菌, 或或菌株菌株vv6/vv52/XH7 (2) 1%甲基紫或結(jié)晶紫染色液、黑色液（墨汁）。甲基紫或結(jié)晶紫染色液、黑色液（墨汁）。(3)載玻片、接種

14、環(huán)、洗瓶。載玻片、接種環(huán)、洗瓶。(4)顯微鏡。顯微鏡。實(shí)驗(yàn)步驟v1制片：在制片：在干凈干凈載玻片一端滴一小滴無(wú)菌水，取少許細(xì)菌載玻片一端滴一小滴無(wú)菌水，取少許細(xì)菌在水滴中制成懸液。取在水滴中制成懸液。取一小滴一小滴墨汁（或墨汁（或一接種環(huán)一接種環(huán)墨汁）與菌墨汁）與菌懸液混合，另取一塊載玻片作為推片，將推片一端平整的邊懸液混合，另取一塊載玻片作為推片，將推片一端平整的邊緣與菌懸液以緣與菌懸液以30度角接觸后，順勢(shì)將菌懸液推向前方，使其度角接觸后，順勢(shì)將菌懸液推向前方，使其成勻薄的一層，風(fēng)干。成勻薄的一層，風(fēng)干。2固定：固定：用純甲醇固定用純甲醇固定1分鐘，立即傾去甲醇，自然晾干。分鐘，立即傾去甲

15、醇，自然晾干。3染色：加結(jié)晶紫染色：加結(jié)晶紫/番紅番紅/堿性復(fù)紅堿性復(fù)紅/甲基紫染液數(shù)滴于涂片甲基紫染液數(shù)滴于涂片上，染上，染1-2min，以細(xì)水流適當(dāng)沖洗，吸去水后自然晾干。，以細(xì)水流適當(dāng)沖洗，吸去水后自然晾干。4. 油鏡觀察結(jié)果。油鏡觀察結(jié)果。 先用低倍鏡再高倍鏡觀察。先用低倍鏡再高倍鏡觀察。 結(jié)果：背景黑色，菌體紫色或紅色，莢膜呈一清晰透明圈。結(jié)果：背景黑色，菌體紫色或紅色，莢膜呈一清晰透明圈。圖6-2莢膜染色制片法注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)v1、玻片干凈無(wú)油脂。、玻片干凈無(wú)油脂。v2、墨水使用量適中，關(guān)鍵是涂片要薄。、墨水使用量適中，關(guān)鍵是涂片要薄。v3、整個(gè)過(guò)程不加熱，固定使用甲醇，甲醇有、整個(gè)過(guò)程不加熱，固定使用甲醇，甲醇有較強(qiáng)的毒性且易揮發(fā)，對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)和較強(qiáng)的毒性且易揮發(fā)，對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)影響最大血液系統(tǒng)影響最大 ，請(qǐng)同學(xué)使用過(guò)程特別留，請(qǐng)同學(xué)使用過(guò)程特別留意。意。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果v2株菌株莢膜染色，繪圖，記錄染色結(jié)果（菌株菌株莢膜染色，繪圖，記錄染色結(jié)果（菌