生物分子的分離純化

1、Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第七章生物分子的分離純化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸、糖復(fù)合物等）生物分子（Biomolecule）泛指生物體特有的各類分子，是自然存在于生物體中的分子的總稱，是組成生命的基本單位。包括小分子（如脂類、激素、維生素等）Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5）能人工合成與改造。生物分子是生物所特有的有機(jī)化合物，具有如下主要特征：1）結(jié)構(gòu)復(fù)雜有序、具有特殊的層

2、次；2）行使專一的功能；3）代謝是其存在的條件；4）生物分子體系具有自我復(fù)制的能力；Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics一、生物大分子的制備 生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬(wàn)或更多的有機(jī)分子。常見(jiàn)的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics（1）分離純化方法千差萬(wàn)別，沒(méi)有一種標(biāo)準(zhǔn)方法可通用于各種生物大分子的分離制備；（2）制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，難以準(zhǔn)確估計(jì)和判斷pH值、溫度度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組份的綜合影響

3、生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)：Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics（3）大多數(shù)生物大分子的含量極微，分離純化的步驟多，流程長(zhǎng)，有的目的產(chǎn)物甚至要經(jīng)過(guò)幾十步的操作才能達(dá)到所需純度；（4）分離純化過(guò)程中要保證目標(biāo)產(chǎn)物的活性。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics生物大分子制備的一般步驟：生物大分子制備的一般步驟： 確定制備的目的和要求確定制備的目的和要求文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)建立相應(yīng)的可靠的分析測(cè)定方法建立相應(yīng)的可靠的分析測(cè)定方法材料的破碎和預(yù)處理材料的破碎和預(yù)處理

4、分離純化方案的選擇和探索分離純化方案的選擇和探索產(chǎn)物純度的鑒定產(chǎn)物純度的鑒定產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存。產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存?？蒲?、開(kāi)發(fā)或發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)制備的關(guān)鍵要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰最困難的過(guò)程掌握目的產(chǎn)物的理化性質(zhì)特異性強(qiáng)準(zhǔn)確度高靈敏度高使用快捷方便 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間理化性質(zhì)的差異。根據(jù)作用原理生物分子的分離、純化可分為以下幾種類型：（1）根據(jù)分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、鹽析法、分配層析法、分級(jí)

5、沉淀法等；（2）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過(guò)濾層析等；（3）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；（4）根據(jù)分子帶電性（電離性質(zhì)）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics破碎方法應(yīng)用機(jī)械法研磨法細(xì)菌、酵母勻漿法機(jī)體軟組織搗碎法動(dòng)物韌性組織化學(xué)法酶解法細(xì)菌、酵母去垢劑組織、細(xì)胞有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母物理法反復(fù)凍融法細(xì)胞超聲波法細(xì)胞懸液低滲裂解法紅細(xì)胞冷熱交替法細(xì)菌、病毒常用破碎方法常用破碎方法 Zhejiang Provincial Key Lab of

6、 Medical Genetics影響提取效果的因素影響提取效果的因素（1）pH值 （2）鹽濃度（即離子強(qiáng)度） （3）溫度 （4）水解酶 （5）攪拌與氧化 （6）有機(jī)溶劑 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 生物大分子的分離純化生物大分子的分離純化 （1）鹽析法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics（2）有機(jī)溶劑沉淀法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics(3) 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子

7、化合物分開(kāi)的方法。含蛋白溶液透析袋透析液磁子電磁攪拌器Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics二、核酸的分離純化 核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)(包括DNA與RNA)。 無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。 DNA與RNA理化性質(zhì)及細(xì)胞定位上的差異決定了兩者的最適分離與純化條件的不同Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics分離純化的原則 一是保持核酸堿基序列的完整性。二是盡量清除其它

8、分子的污染，保證核酸制品的純度。 意義：遺傳信息全部?jī)?chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics對(duì)于核酸的純化應(yīng)達(dá)到以下三點(diǎn)要求： 1）核酸樣品中不存在過(guò)高濃度的金屬離子和對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑； 2）其它生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類和多糖分子的污染應(yīng)降至最低程度； 3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)應(yīng)去除RNA，提取RNA分子時(shí)應(yīng)去除DNA。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics保持核酸的完

9、整性 在整個(gè)操作過(guò)程中應(yīng)盡量避免各種有害因素對(duì)核酸的破壞。 1）溫度不要過(guò)高(04)；(高溫破壞氫鍵) 2）控制pH值范圍(pH值4-10);(極端酸堿破壞磷酸二酯鍵) 3）保持一定離子強(qiáng)度; 4）減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力.Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸制備的技術(shù)路核酸制備的技術(shù)路線線Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸的濃縮、沉淀與洗滌 隨著提取試劑的逐步加入，去除雜質(zhì)時(shí)的丟失，樣品中核酸的濃度會(huì)逐步下降，當(dāng)不能滿足后續(xù)研究與診斷所需時(shí)應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行濃縮。 沉

10、淀是濃縮核酸的最常用且高效的方法， 優(yōu)點(diǎn)： 改變核酸的溶解緩沖液； 重新調(diào)整核酸的濃度； 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定1. 濃度鑒定 核酸濃度的測(cè)定可通過(guò)紫外分光光度法與熒光光度法進(jìn)行。 紫外分光光度法：該法是基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可以吸收紫外線，其最大吸收波長(zhǎng)為260nm，這一物理特性。前提：核酸樣品要較純，無(wú)顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測(cè)定濃度應(yīng)大于0.25 g/mlZhejiang Provincial Key Lab of Medic

11、al Genetics熒光光度法：核酸在熒光染料溴化乙錠（ethidium bromide，EB）嵌入堿基平面后，本身無(wú)熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，且熒光強(qiáng)度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 純度鑒定 紫外分光光度法或熒光光度法皆可用于核酸制品的純度鑒定。紫外分光光度法：該法主要通過(guò)A260與A280的比值來(lái)判定有無(wú)蛋白質(zhì)的污染。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280為1.8，純RNA的比值為2.0。比值升高與降低均提示不純。熒光光度法：用EB等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可判定核酸制品的

12、純度。DNA分子較RNA大得多，電泳遷移率低。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics完整性鑒定瓊脂糖凝膠電泳法：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳結(jié)果為依據(jù)?；蚪MDNA片段如發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀。完整的或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶的熒光強(qiáng)度積分應(yīng)呈特定的比值，如有改變則提示有RNA的降解。此外，若在點(diǎn)樣孔附近有著色條帶，則說(shuō)明存在DNA 的污染。其它方法：必要時(shí)，還可通過(guò)一些特殊的實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定RNA的完整性。 如小規(guī)模的cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)，已知大小的某種mRNA的Northern雜交等Zhejiang Provincial

13、 Key Lab of Medical Genetics(1) 對(duì)DNA DNA樣品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；在-70可保存數(shù)年 長(zhǎng)期保存樣品中可加入1滴氯仿。(2) 對(duì)RNA RNA樣品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70 保存; 長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70,可保存數(shù)年。（二）核酸的保存Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics盡管基因組DNA因來(lái)源、性質(zhì)以及制備的目的不同，其分離純化的方法不盡相同，但

14、有關(guān)分離純化的原則、主要步驟、主要技術(shù)、主要試劑及其作用原理是一樣的。基因組DNA分離純化的一般程序見(jiàn)圖7-4。真核基因組DNA的分離純化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics真核基因組DNA分離純化的一般技術(shù)路線Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1、酚抽提法、酚抽提法(SDS法）法）本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過(guò)改良，以含EDTA、SDS及無(wú)DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純

15、度后，根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics裂解液中：EDTA：離子螯合劑，抑制DNase活性，降低細(xì)胞膜穩(wěn)定性SDS：溶解細(xì)胞膜、核膜，乳化脂質(zhì)、蛋白，并使其變性沉淀，同時(shí)變性DNase無(wú)DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白質(zhì)酚：變性沉淀蛋白，抑制DNase活性pH 8.0的Tris溶液保證抽提時(shí)DNA進(jìn)入水相，防止DNA變性Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsq SDS

16、 SDS法流程圖法流程圖 （以動(dòng)物組織為例）（以動(dòng)物組織為例） 動(dòng)物組織動(dòng)物組織細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解上層溶液上層溶液組織勻漿組織勻漿抽提抽提干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2 2、 甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法該法操作步驟少，但耗時(shí)，所得DNA濃度低，適用于制備大片段DNA1987年Kupiec等報(bào)道了甲酰胺（formamide）解聚法，該法的細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)水解同酚抽提法相似，但不進(jìn)行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰胺裂解DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物（即染色質(zhì)），然后通過(guò)火棉膠袋的充分透

17、析以除去蛋白酶K和有機(jī)溶劑。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 3 3、玻棒纏繞法、玻棒纏繞法用該法收集高分子量DNA的沉淀始于20世紀(jì)30年代，現(xiàn)今使用的纏繞法是以1987年Bowtell的方法經(jīng)改進(jìn)而來(lái)。本法有兩個(gè)關(guān)鍵步驟：一是基因組DNA沉淀在細(xì)胞裂解液和乙醇的交界面；二是將DNA沉淀纏繞在帶鉤玻棒上。帶鉤玻棒將大片段DNA從無(wú)水乙醇中轉(zhuǎn)移至pH8.0的TE緩沖液中。該法以鹽酸胍裂解細(xì)胞，制備的DNA片段約有80kb，適用于同時(shí)從不同細(xì)胞或組織標(biāo)本中提取DNAZhejiang Provincial Key Lab of Med

18、ical Genetics物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、超聲波法、研磨法、凍融法凍融法化學(xué)方式化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法q根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics吸附材料結(jié)合法：吸附材料結(jié)合法：q根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料硅質(zhì)材料陰離子交換樹(shù)脂陰離子交換樹(shù)脂磁珠磁珠高鹽低高鹽低pHpH值結(jié)合核酸，低鹽高值結(jié)合核酸，低鹽高pHpH值洗脫值洗脫快捷高效。快捷高效。低鹽

19、高低鹽高pHpH值結(jié)合核酸，高鹽低值結(jié)合核酸，高鹽低pHpH值洗脫值洗脫適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。的物，從而達(dá)到分離目的。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics濃鹽法濃鹽法：有機(jī)溶劑抽提法：有機(jī)溶劑抽提法：密度梯度離心法：密度梯度離心法：利用利用RNP和和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利用不同

20、內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics基因組基因組DNADNA片段的純化片段的純化純化的原則與要求純化的原則與要求純化的方法有透析、層析、電泳及選擇性沉淀等。無(wú)論采用何種方法從何種支持介質(zhì)中純化與回收所需要的DNA片段都要注意兩個(gè)原則：一是提高片段的回收率；二要清除回收的DNA樣品中的污染。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 回收率 為提高DNA片段的回收率，可通過(guò)提高DNA樣品的上樣量和選擇適宜的方法與

21、材料而實(shí)現(xiàn)。2. 純度 常用的純化方法包括有機(jī)溶劑抽提法與商品化的柱層析法（column chromatography）。柱層析法采用的是陰離子交換層析的原理Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段從瓊脂糖凝膠中純化DNA片段的方法主要有二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-纖維素（cellulose）膜插片電泳法電泳洗脫法（透析袋及非透析袋電泳洗脫法）冷凍擠壓法低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法等。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics

22、從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。它是將含待回收DNA條帶的凝膠塊切出，用吸頭或接種針將其壓碎，然后以洗脫緩沖液浸泡，使DNA洗脫出來(lái)。該方法能很好地回收小于1 kb的ss或ds-DNA，依分子量不同，其回收率從小于30%至大于90%不等。回收的DNA純度極高，無(wú)酶抑制劑，也無(wú)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞或微注射細(xì)胞有毒的污染物，雖費(fèi)時(shí)但操作簡(jiǎn)單，是小片段DNA回收的較好方法。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取與純化的提取與純化Zhejiang Provincial Key L

23、ab of Medical Genetics質(zhì)粒DNA的提取與純化的經(jīng)典方法包括： 堿裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等這些方法主要由質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增、質(zhì)粒DNA的釋放、質(zhì)粒DNA的分離純化三個(gè)步驟組成Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1、堿裂解法、堿裂解法在NaOH提供的高pH（12.012.6）條件下，用強(qiáng)陽(yáng)離子去垢劑SDS破壞細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞，與NaOH共同使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsq堿裂解法原理堿裂

24、解法原理 染色體染色體DNADNA比質(zhì)粒比質(zhì)粒DNADNA分子大得多，且染色體分子大得多，且染色體DNADNA為為線狀分線狀分子，而質(zhì)粒子，而質(zhì)粒DNADNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)用堿處理當(dāng)用堿處理DNADNA溶液時(shí)，線狀染色體溶液時(shí)，線狀染色體DNADNA容易發(fā)生變性，共容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體變性染色體DNADNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNADNA分子則以溶解狀態(tài)存在液

25、相分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics盡管堿溶液能破壞DNA中的堿基配對(duì)，但CCC質(zhì)粒DNA因纏繞緊密而不易解鏈，只要不在堿性條件下變性太久，當(dāng)pH調(diào)至中性時(shí)，CCC質(zhì)粒DNA就可重新恢復(fù)天然的超螺旋。該法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好且成本低，制備的質(zhì)粒純度能滿足DNA測(cè)序與PCR等實(shí)驗(yàn)要求，是使用最廣泛的方法Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsq堿裂解法流程圖堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體對(duì)數(shù)期菌體溶液溶液II

26、I中和中和溶液溶液I充分重懸充分重懸溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀質(zhì)粒質(zhì)粒DNA溶液溶液Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2 2、SDSSDS裂解法裂解法 SDS裂解法是將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁，去壁細(xì)菌再用SDS裂解，從而溫和地釋放質(zhì)粒DNA到等滲液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA 由于條件溫和，該法特別適用于大質(zhì)粒DNA（15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會(huì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。Zheji

27、ang Provincial Key Lab of Medical Genetics3、煮沸裂解法、煮沸裂解法該法條件劇烈，只能用于小質(zhì)粒DNA的制備煮沸裂解法是將細(xì)菌懸浮于含Triton X-100和溶菌酶的緩沖液中，Triton X-100和溶菌酶破壞細(xì)胞壁后，沸水浴裂解細(xì)胞的同時(shí)可破壞DNA鏈的堿基配對(duì)，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA變性，但CCC質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈。當(dāng)溫度下降后，CCC質(zhì)粒DNA可重新恢復(fù)其超螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清中的質(zhì)粒DNA。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genet

28、ics質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的純化的純化 1、CsCl-EB法 利用CsCl形成的連續(xù)密度梯度，在過(guò)量EB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開(kāi)。 2、聚乙二醇沉淀法 （一種分級(jí)沉淀法） 3、柱層析法 （樹(shù)脂）Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics RNA極易被RNase水解，除胞內(nèi)的RNase外，它還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中；RNase分子結(jié)構(gòu)中二硫鍵的存在使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，加熱煮沸及一般的變性劑均不能使其完全滅活，而且去除變性劑（denaturant）后，RNase的活性又可恢復(fù)。 因此，在RNA

29、的制備過(guò)程中，排除RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵真核細(xì)胞RNA的分離純化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 為獲得完整的RNA分子，必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性。 選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類變性劑）。 蛋白酶K和能與蛋白質(zhì)結(jié)合的陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉，并聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對(duì)RNA的降解。 此外，在變性液中加入-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等

30、還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。它以含4mmol/L的(異)硫氰酸胍與0.1mmol/L的-巰基乙醇的變性溶液裂解細(xì)胞，然后在pH4.0的酸性條件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通過(guò)異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌來(lái)制備RNA。 。 本法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效及提取的RNA質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，能在3小時(shí)內(nèi)迅速處理多個(gè)標(biāo)本 酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法 分離總RNAZhejiang Provincial Ke

31、y Lab of Medical GeneticsmRNAmRNA的分離純化的分離純化 與序列明確的rRNA、tRNA、snRNA、scRNA不同，真核生物的mRNA在細(xì)胞中含量少，種類多且分子量大小不一。除血紅蛋白及組蛋白的mRNA外，絕大多數(shù)mRNA在其3末端帶有長(zhǎng)短不同的poly（A）尾巴。 依據(jù)mRNA的結(jié)構(gòu)特征，利用堿基配對(duì)原則，通過(guò)oligo（dT）-纖維素或poly（U）-瓊脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地從總RNA制品中分離純化mRNA。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1、oligo（dT）-纖維素柱層析法2、oli

32、go（dT）-纖維素柱離心法3、oligo（dT）-纖維素液相結(jié)合離心法4、磁性球珠分離法 該法聯(lián)合利用了oligo（dT）與poly（A）的互補(bǔ)配對(duì)、生物素（biotin）與鏈親和素（streptavidin）的結(jié)合特異性以及磁性分離原理，可對(duì)poly（A）+RNA進(jìn)行高效、靈敏及快捷的分離。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+總RNA中的poly(A) +RNA分子退火形成雜交體 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Bio

33、tin5鏈親和素標(biāo)記的磁珠+Streptavidin- 磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁生物素與鏈親和素的特異性結(jié)合 磁性分離5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁鐵3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁洗滌與洗脫水相(含純化的mRNA)固相生物素標(biāo)記的oligo(dT)磁鐵5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁圖 3-2 磁珠分離法純化poly(A) +RNA的原理Zhejiang Provincial K

34、ey Lab of Medical Genetics5、其它方法Poly(U)-凝膠層析法: 利用 Poly(U)與 Poly(A)的互補(bǔ)配對(duì)原理Poly(U)-濾紙法: 將總RNA加到共價(jià)交聯(lián)有Poly(U)的濾紙上,經(jīng)洗滌后加熱洗脫Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsq 蛋白質(zhì)的去除：蛋白質(zhì)的去除： 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提 使用變性劑變性（使用變性劑變性（SDSSDS、異硫氰酸胍等）、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌高鹽洗滌 蛋白酶處理蛋白酶處理Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetic

35、sq 多糖的去除：多糖的去除： 高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/21/2體體積的積的5M NaCl5M NaCl，高鹽可溶解多糖。，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2(1/2體積體積) )，氯苯可，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG200l 20% PEG80

36、00 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneticsq 多酚的去除：多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合q

37、鹽離子的去除：鹽離子的去除： 7070的乙醇洗滌的乙醇洗滌Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsDNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)糖、多酚類雜質(zhì)DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)后續(xù)酶解反應(yīng)DNADNA中殘留有金屬離中殘留有金屬離子子重新純化重新純化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等雜白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見(jiàn)前）質(zhì)（具體方法見(jiàn)前）重新沉淀重新沉淀DNADNA，讓酒精，讓酒精充分揮發(fā)充分揮發(fā)增加增加7070乙醇洗滌的乙醇洗滌的次數(shù)（次數(shù)（2-32-3次）

38、次）q問(wèn)題一：?jiǎn)栴}一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。 原原因因?qū)?duì)策策Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics材料不新鮮或反復(fù)凍材料不新鮮或反復(fù)凍融融未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，烈，DNADNA被機(jī)械打斷被機(jī)械打斷外源核酸酶污染外源核酸酶污染反復(fù)凍融反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液前加入裂解緩沖

39、液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的的DNADNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌溫滅菌將將DNADNA分裝保存于緩沖液中，避免分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融反復(fù)凍融q問(wèn)題二：?jiǎn)栴}二：DNADNA降解。降解。對(duì)對(duì)策策 原原因因Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗滌時(shí)洗

40、滌時(shí)DNADNA丟失丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材盡量選用新鮮（幼嫩）的材料料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁或機(jī)械方式破壁高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加加PKPK的用量）的用量）低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間加輔助物，促進(jìn)沉淀加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒液吸出，勿傾倒q問(wèn)題三：?jiǎn)栴}三：DNADNA提取量少。提取量少。對(duì)對(duì)策策 原原因因Zhejiang Provincial Key L

41、ab of Medical Genetics三、蛋白質(zhì)的分離與純化Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能、新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和疾病分子診斷的基礎(chǔ)；分子克隆中，下游的處理和分析鑒定，基因工程產(chǎn)品的制備，也需要蛋白質(zhì)的分離和純化。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白質(zhì)分離純化的總目標(biāo)是增加制品的純度（purity）或比活（specific activity），以增加單位蛋白質(zhì)重量中靶蛋白的含量或生物學(xué)活性（比活常以活力單位數(shù)/毫

42、克蛋白質(zhì)表示），即從蛋白混合物中設(shè)法去除不要的雜蛋白和變性的靶蛋白，使靶蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最高值。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質(zhì)分離純化的一般技術(shù)路線 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分離純化的總體原則 一是保證靶蛋白結(jié)構(gòu)的完整，防止降解和活性蛋白質(zhì)的變性； 二是盡量滿足研究與診斷對(duì)靶蛋白純度的要求。純化蛋白質(zhì)總是希望純度和產(chǎn)率均高，例如純化某種酶，理想的結(jié)果是比活力和總回收率均高，但實(shí)際工作中二者不能兼得，通常在科研上希望比活力盡可能高，而犧牲一些回收率，在工業(yè)生

43、產(chǎn)和分子診斷中則正相反。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質(zhì)分離純化的條件蛋白質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、有生物活性的生物大分子，離開(kāi)天然的存在體系，其結(jié)構(gòu)與活性變得極不穩(wěn)定，因此從生物材料中提純各種靶蛋白均需要特定的條件。應(yīng)注意各種因素對(duì)靶蛋白的影響。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics緩沖液 鹽、金屬離子和螯合劑.3. 還原劑 4. 去垢劑5. 增溶劑 6. 蛋白酶抑制劑（pronase inhibitor）7. 蛋白質(zhì)的環(huán)境因素 表面效應(yīng)的影響溫度的影響儲(chǔ)存Zhejiang

44、Provincial Key Lab of Medical Genetics蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化方法 蛋白質(zhì)的分離純化是依據(jù)其溶解性、分子質(zhì)量大小及形狀、電離性質(zhì)和生物學(xué)功能的差異而進(jìn)行的。分離純化的方法可分類如下： 以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、分配層析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀和結(jié)晶等； 以分子大小及形狀差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過(guò)濾層析等；Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics以電離性質(zhì)差異為依據(jù)的方法：電泳、離子交換層析等；以生物學(xué)功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析。Zhejiang

45、Provincial Key Lab of Medical Genetics鹽析法：鹽析法：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。 等電點(diǎn)沉淀法：等電點(diǎn)沉淀法：凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。該法適用于在等電點(diǎn)pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低溫），破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋

46、白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics凝膠過(guò)濾層析凝膠過(guò)濾層析(gel filtration)(gel filtration)凝膠過(guò)濾層析亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大

47、小不同的物質(zhì)分離開(kāi)的一種方法。凝膠色譜的機(jī)理是分子篩效應(yīng)，在洗脫過(guò)程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長(zhǎng)、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合樣品如同“過(guò)篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開(kāi)。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics離子交換層析的原理離子交換層析的原理Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics密度梯度（

48、區(qū)帶）離心：常用蔗糖密度梯度Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics電電 泳泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳(elctrophoresis) 。電泳(elctrophoresis)Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics幾種重要的蛋白質(zhì)電泳幾種重要的蛋白質(zhì)電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

49、：常用于蛋白質(zhì)分 子量的測(cè)定。每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，Eq值接近一個(gè)常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics等電聚焦電泳（等電聚焦電泳（isoelectric focusingisoelectric focusing，IEFIEF） 通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。pH梯度以兩性電解質(zhì)ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場(chǎng)作用下自然形成。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳two-dimensional two-dimensional electrophoresis electrophoresis Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics方法原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)凝膠層析分子篩的排阻效應(yīng)分辨力高、不會(huì)引起變性凝膠介質(zhì)昂貴、處理量有限離子交換層析各組份與離子交換劑親和力不同分辨力高、處理量較