蛋白質(zhì)測(cè)定學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定第一頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 了解蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志；掌握凱氏定氮法、雙縮脲法、茚三酮比色法、氨基態(tài)氮的測(cè)定方法及原理。 重點(diǎn)掌握：蛋白質(zhì)系數(shù)的概念；凱氏定氮中各種試劑的用途；凱氏定氮裝置的原理及操作技能；掌握PH計(jì)甲醛滴定法測(cè)定氨基態(tài)氮的原理、方法及其操作技能。 第1頁/共57頁第二頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第2頁/共57頁第三頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第一節(jié)第一節(jié) 概述概述蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是食品蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是食品中重要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。中重要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。食品中的蛋白質(zhì)種類非常復(fù)雜，蛋白食品中的蛋白質(zhì)種類非常

2、復(fù)雜，蛋白質(zhì)分子量的變化范圍通常為質(zhì)分子量的變化范圍通常為50001000,000道爾頓，它們包括氫、道爾頓，它們包括氫、 碳碳、 氮、氧和硫等元素。氮、氧和硫等元素。第3頁/共57頁第四頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第4頁/共57頁第五頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 蛋白質(zhì)由氨基酸以不同比例構(gòu)成蛋白質(zhì)由氨基酸以不同比例構(gòu)成；氨基酸由；氨基酸由C、H、O、N以不同以不同方法構(gòu)成；方法構(gòu)成； 由于氨基酸種類不同和蛋白質(zhì)中由于氨基酸種類不同和蛋白質(zhì)中氨基酸構(gòu)成比例不同導(dǎo)致氨基酸構(gòu)成比例不同導(dǎo)致蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的含氮量不同的含氮量不同第5頁/共57頁第六頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 不同食品中不

3、同食品中蛋白質(zhì)的含氮量蛋白質(zhì)的含氮量為為13.4%19.1%*蛋白質(zhì)系數(shù)蛋白質(zhì)系數(shù)16%第6頁/共57頁第七頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第7頁/共57頁第八頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 食品中的總有機(jī)氮主要來自于蛋白質(zhì)食品中的總有機(jī)氮主要來自于蛋白質(zhì)，小部分來自于，小部分來自于非蛋白質(zhì)組份非蛋白質(zhì)組份的有機(jī)的有機(jī)氮，會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定。氮，會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定。 食品中脂類和碳水化合物可能會(huì)干擾食品中脂類和碳水化合物可能會(huì)干擾 一些具有相似的物化性質(zhì)的組份干一些具有相似的物化性質(zhì)的組份干擾分析。擾分析。干擾蛋白分析物質(zhì)干擾蛋白分析物質(zhì):第8頁/共57頁第九頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。

4、二、二、凱氏定氮法凱氏定氮法第9頁/共57頁第十頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第10頁/共57頁第十一頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。2.1.2 凱氏定氮過程步驟：凱氏定氮過程步驟：樣品制備樣品制備(自學(xué)自學(xué)) 消化消化 蒸餾蒸餾 吸收與滴定吸收與滴定*學(xué)習(xí)中特別需要注意掌握各個(gè)過學(xué)習(xí)中特別需要注意掌握各個(gè)過程中所使用的試劑都有哪些作用程中所使用的試劑都有哪些作用常量凱氏定氮法常量凱氏定氮法第11頁/共57頁第十二頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。1. 原理原理 消化：消化： 樣品與濃硫酸和催化劑樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和一同加熱，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧

5、化碳和水逸出，而樣氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫與硫酸結(jié)合成硫酸銨。酸銨。第12頁/共57頁第十三頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第13頁/共57頁第十四頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。2.1.2.2 濕法消化濕法消化蛋白質(zhì)中的氮形成銨離子和硫酸結(jié)蛋白質(zhì)中的氮形成銨離子和硫酸結(jié)合成硫酸銨，合成硫酸銨，硫酸氧化有機(jī)物使碳元素和氧元素被硫酸氧化有機(jī)物使碳元素和氧元素被轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水。轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水。樣品中的有機(jī)物消化至透明澄清樣品中的有機(jī)物消化至透明澄清. 第14頁/共57頁第十五頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第15頁/共57頁第十

6、六頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 硫酸鉀：硫酸鉀：增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消化時(shí)間，加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消化時(shí)間，加入催化劑：加入催化劑：第16頁/共57頁第十七頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 加硫酸銅作用：加硫酸銅作用：加速有機(jī)物的氧化與分解加速有機(jī)物的氧化與分解有機(jī)物全部被消化完后，不再有硫酸有機(jī)物全部被消化完后，不再有硫酸亞銅褐色生成，溶液呈現(xiàn)清澈的二價(jià)銅亞銅褐色生成，溶液呈現(xiàn)清澈的二價(jià)銅的籃綠色，可指示消化終點(diǎn)的到達(dá)的籃綠色，可指示消化終點(diǎn)的到達(dá)第17頁/共57頁第十八頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第18頁/共57頁第十九頁，編輯于星期三：

7、點(diǎn) 四十四分。第19頁/共57頁第二十頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第20頁/共57頁第二十一頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第21頁/共57頁第二十二頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。指示劑在反應(yīng)過程中色澤變化: （酸性條件下為甲基紅所顯的紅色，當(dāng)體系變?yōu)榫G色時(shí)則呈現(xiàn)溴甲基酚綠所有的綠色，因此，稱為混合指示劑）指示劑先加入硼酸中，呈現(xiàn)酸性紅色，通入氨氣后呈現(xiàn)變藍(lán)綠色；用HCL一滴定，到后來又顯了稍過量鹽酸的酸性紅色第22頁/共57頁第二十三頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。定氮裝置一、第23頁/共57頁第二十四頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。1、電爐； 2、水蒸氣發(fā)生器；3、螺旋夾a；4、小漏

8、斗及棒狀玻璃塞（樣品入口處）；5、反應(yīng)室；6、反應(yīng)室外層；7、橡皮管及螺旋夾b；8、冷凝管9、蒸餾液接收瓶。 定氮裝置二第24頁/共57頁第二十五頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。定氮裝置的檢查與洗滌 檢查微量定氮裝置是否裝好。在蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水約三分之二，加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。 測(cè)定前定氮裝置如下法洗滌23次：從樣品進(jìn)口入加水適量（約占反應(yīng)管三分之一體積）通入蒸汽煮沸，產(chǎn)生的蒸汽沖洗冷凝管，數(shù)分鐘后關(guān)閉夾子a，使反應(yīng)管中的廢液倒吸流到反應(yīng)室外層，打開夾子b由橡皮管排出，如此數(shù)次，即可使用。 第25頁/共57頁第二十六頁，編輯于星期三

9、：點(diǎn) 四十四分。第26頁/共57頁第二十七頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。新鮮食品中的含氮化合物大多以蛋新鮮食品中的含氮化合物大多以蛋白質(zhì)為主體，先測(cè)定總氮量，然后乘白質(zhì)為主體，先測(cè)定總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，得到蛋白質(zhì)含量以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，得到蛋白質(zhì)含量。換算系數(shù)換算系數(shù)一般為（）。一般為（）。 即：即：%N 6.25 = %蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)第27頁/共57頁第二十八頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第28頁/共57頁第二十九頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 問題問題1:1:為什么凱氏定氮所用為什么凱氏定氮所用試劑溶液應(yīng)用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水無氨蒸餾水配制配制, ,如何配制。如何配制。 第

10、29頁/共57頁第三十頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第30頁/共57頁第三十一頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第31頁/共57頁第三十二頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或藍(lán)色或淺綠色淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色深綠色。問題四：如何判斷消化的終點(diǎn)？問題四：如何判斷消化的終點(diǎn)？第32頁/共57頁第三十三頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 問題五：蒸餾前若加堿量不足問題五：蒸餾前若加堿量不足會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象，為什么，如何解會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象，為什么，如何解決？決？ 若加堿量充足，

11、消化液變?yōu)樯钏{(lán)色若加堿量充足，消化液變?yōu)樯钏{(lán)色，或產(chǎn)生黑色氫氧化銅沉淀，若加堿，或產(chǎn)生黑色氫氧化銅沉淀，若加堿量不足，則消化液呈藍(lán)色而無沉淀，量不足，則消化液呈藍(lán)色而無沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。第33頁/共57頁第三十四頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。問題六：蒸餾完畢拆下裝置時(shí)的注意事項(xiàng) 第34頁/共57頁第三十五頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。問題七：為何要控制硼酸吸收液的問題七：為何要控制硼酸吸收液的溫度？溫度？第35頁/共57頁第三十六頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第36頁/共57頁第三十七頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第37頁/共57頁第三十八頁，編

12、輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析?？捎糜谒惺称返牡鞍踪|(zhì)分析。 2操作比較簡(jiǎn)單。操作比較簡(jiǎn)單。 3實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低。實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低。 4結(jié)果準(zhǔn)確，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法。結(jié)果準(zhǔn)確，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法。 5用微量法可測(cè)定樣品中微量的蛋白質(zhì)。用微量法可測(cè)定樣品中微量的蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)缺點(diǎn) 1最終測(cè)定的是總氮含量，而不只是蛋白質(zhì)氮。最終測(cè)定的是總氮含量，而不只是蛋白質(zhì)氮。 2實(shí)驗(yàn)時(shí)間太長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間太長(zhǎng)。 3所用試劑有腐蝕性。所用試劑有腐蝕性。 本實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)、缺點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)、缺點(diǎn)第38頁/共57頁第三十九頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。2.2 2.2 微量凱氏定氮

13、法微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點(diǎn)：、與常量法不同點(diǎn)：加入硼酸量加入硼酸量有有50 ml 10 ml,滴定用鹽酸濃度由滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管?？捎梦⒘康味ü?。第39頁/共57頁第四十頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。2.3常量改良凱氏定氮法常量改良凱氏定氮法2.3.1 2.3.1 原理及適用范圍同前原理及適用范圍同前 在凱氏法改良中主要的問題是：在凱氏法改良中主要的問題是： 氮的完全氮化、縮短時(shí)間、簡(jiǎn)化操氮的完全氮化、縮短時(shí)間、簡(jiǎn)化操作作 這里主要需解決的是催化劑的種類、這里主要需解決的是催化劑的種類、

14、硫酸和鹽類的添加量等。硫酸和鹽類的添加量等。 第40頁/共57頁第四十一頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。2.3.2 2.3.2 特點(diǎn)：特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，氮百分含量并記錄，12分鐘完成分鐘完成1個(gè)樣個(gè)樣。第41頁/共57頁第四十二頁，編輯于星

15、期三：點(diǎn) 四十四分。為什么在蒸汽發(fā)生瓶中要加入指示劑甲基橙和硫酸？加入數(shù)粒玻璃珠的作用是什么？第42頁/共57頁第四十三頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第43頁/共57頁第四十四頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第44頁/共57頁第四十五頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。樣品的測(cè)定：樣品的測(cè)定： 自學(xué)自學(xué)第45頁/共57頁第四十六頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。氨基酸態(tài)氮的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法四、氨基酸態(tài)氮的測(cè)定第46頁/共57頁第四十七頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。4.1 雙指示劑甲醛滴定法原理： 氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的基和堿性的-NH2基。它們相互租

16、用而使氨基酸成為中基。它們相互租用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。性的內(nèi)鹽。 當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。，從而使其堿性消失。 這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定 -COOH基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。量。第47頁/共57頁第四十八頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 吸取含氨基酸約吸取含氨基酸約20mg20mg的樣品溶液于的樣品溶液于100ml100ml容量瓶中，加水至標(biāo)線，混勻后吸取置于容量瓶中，加水至標(biāo)線，混勻后吸取置于200ml200ml燒杯中，加水燒杯中，加水60ml6

17、0ml，開動(dòng)磁力攪拌器，開動(dòng)磁力攪拌器，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示，記錄用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液mlml數(shù)（數(shù)（V V1010），供計(jì)算），供計(jì)算總酸含量。總酸含量。 加入甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉加入甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。溶液體積。第48頁/共57頁第四十九頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。第49頁/共57頁第五十頁，編輯于星期三：點(diǎn) 四十四分。 此法準(zhǔn)確快速，適用于測(cè)定食品中游離此法準(zhǔn)確快速，適用于測(cè)定食品中游離氨基酸。氨基酸。 固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，然后測(cè)定萃取液；液體試樣如醬油水萃取，然后測(cè)定萃取液；液體試樣如醬油、飲料等可直接吸取試樣進(jìn)行測(cè)定。、飲料等可直接吸取試樣