動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

1、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)Animal cells cultured in vitro 一、基本概念一、基本概念 動(dòng)物體內(nèi)取出組織，分離出單細(xì)胞，在體外動(dòng)物體內(nèi)取出組織，分離出單細(xì)胞，在體外模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件，建立無菌、適溫和一模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件，建立無菌、適溫和一定的營(yíng)養(yǎng)條件，使之生長(zhǎng)和生存，并維持其結(jié)定的營(yíng)養(yǎng)條件，使之生長(zhǎng)和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)，稱動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)。構(gòu)和功能的技術(shù)，稱動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)。 是動(dòng)物細(xì)胞工程的重要技術(shù)基礎(chǔ)：細(xì)胞融合、是動(dòng)物細(xì)胞工程的重要技術(shù)基礎(chǔ)：細(xì)胞融合、組織工程、胚胎工程、干細(xì)胞工程、動(dòng)物克隆、組織工程、胚胎工程、干細(xì)胞工程、動(dòng)物克隆、動(dòng)物細(xì)

2、胞產(chǎn)品的大規(guī)模制備技術(shù)等都離不開。動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的大規(guī)模制備技術(shù)等都離不開。（1 1）原代培養(yǎng)）原代培養(yǎng) ( Primary Culture ) ： 亦稱初代培養(yǎng)，指直接從機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)亦稱初代培養(yǎng)，指直接從機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn) 行培養(yǎng)的過程。行培養(yǎng)的過程。（2 2）繼代培養(yǎng)）繼代培養(yǎng)（ Secondary Culture ）：）： 亦稱傳代培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱亦稱傳代培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱 繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng). .（3 3）細(xì)胞系）細(xì)胞系（cell line）：）： 由原代細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)初步純化，獲得的以一種細(xì)胞由原代細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)初步純化，獲得的以一種細(xì)胞

3、為主、能在體外長(zhǎng)期生存的不均一的細(xì)胞群體，能保為主、能在體外長(zhǎng)期生存的不均一的細(xì)胞群體，能保 持一致的二倍體核型。持一致的二倍體核型。（4）細(xì)胞株）細(xì)胞株 ( cell strain ) ： 細(xì)胞系經(jīng)過克隆或其他方法而得的單一類型的細(xì)胞細(xì)胞系經(jīng)過克隆或其他方法而得的單一類型的細(xì)胞 群體。群體。二、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)特性二、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)特性 組成人及哺乳類動(dòng)物體的細(xì)胞具有極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)相互依賴、相互制約，在神經(jīng)體液的調(diào)解下形成了一種天然的內(nèi)環(huán)境，體外生長(zhǎng)時(shí)脫離了這些內(nèi)平衡系統(tǒng)，與體內(nèi)細(xì)胞相比是完全不相同的。體外生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞形態(tài)上也發(fā)生了變化。1.1.與體內(nèi)主要不同相對(duì)

4、孤立、相對(duì)單一，缺乏體內(nèi)與體內(nèi)主要不同相對(duì)孤立、相對(duì)單一，缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響的影響 ；2.2.主要表現(xiàn)：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化主要表現(xiàn)：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化減弱或不顯，細(xì)胞趨向單一化；減弱或不顯，細(xì)胞趨向單一化； 3.3.提示：要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞是一種特定條件提示：要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞是一種特定條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。三、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過程三、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過程 培養(yǎng)的細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)的時(shí)間有限，最終自行停止生長(zhǎng)。細(xì)胞的種類、性狀、原供體的年齡決定其生存時(shí)

5、間長(zhǎng)短。 如：人胚成纖維細(xì)胞存活一年、傳30-50代相當(dāng)于150-300個(gè)細(xì)胞周期；供體是成體或衰老個(gè)體時(shí)則存活更短；肝、腎細(xì)胞僅能傳幾代或十幾代。 獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化（遺傳性改變）生存期則發(fā)生變化。1 1、原代培養(yǎng)、原代培養(yǎng)期（期（primary culture phage)primary culture phage) 為新鮮組織自體內(nèi)取出接種培養(yǎng)至第一次傳代的階為新鮮組織自體內(nèi)取出接種培養(yǎng)至第一次傳代的階段段,一般持續(xù)一般持續(xù)14周。周。細(xì)胞的代數(shù)細(xì)胞的代數(shù)= =轉(zhuǎn)接的次數(shù)。每一代轉(zhuǎn)接的次數(shù)。每一代中細(xì)胞分裂中細(xì)胞分裂3-63-6次。次。2 2、傳代期、傳代期 （passage phase

6、passage phase）：）： 當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)增殖一段時(shí)間，達(dá)到一定的細(xì)胞密當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)增殖一段時(shí)間，達(dá)到一定的細(xì)胞密度后，就應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞分離成兩部分（或更多）至新的培度后，就應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞分離成兩部分（或更多）至新的培養(yǎng)器皿中，并補(bǔ)充更新培養(yǎng)液，此即為傳代。養(yǎng)器皿中，并補(bǔ)充更新培養(yǎng)液，此即為傳代。（一）細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程（一）細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程 3、衰退期、衰退期（senescence phasesenescence phase）：）：此期細(xì)此期細(xì)胞雖仍存活，但胞雖仍存活，但不增殖或增殖很慢不增殖或增殖很慢，細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生衰退、死亡。形態(tài)輪廓增強(qiáng)，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生衰退、死亡。

7、細(xì)胞通過所謂細(xì)胞通過所謂“危機(jī)期危機(jī)期”(crisis)，獲，獲得不死性而具有持久或無限增殖的能力。得不死性而具有持久或無限增殖的能力。失去接觸抑制。失去接觸抑制。 每代細(xì)胞每代細(xì)胞（群體）（群體）要經(jīng)過四個(gè)生長(zhǎng)階段：要經(jīng)過四個(gè)生長(zhǎng)階段：1 1、潛伏期（、潛伏期（latent phase）：）： 接種懸浮貼附不馬上分裂（潛伏）。 潛伏期特點(diǎn)潛伏期特點(diǎn)：長(zhǎng)短與細(xì)胞接種密度、種類、使用培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。2 2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（logarthmic growth phase）：）： 分裂旺盛、分裂相增多（其數(shù)量標(biāo)志分裂的旺盛 程度）。 細(xì)胞分裂指數(shù)（mitotic index, MI）: M

8、I=(分裂相個(gè)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞) 100% 。 3 3、穩(wěn)定期（、穩(wěn)定期（stationary phasestationary phase）：）：因培養(yǎng)空間和營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)有限，特別是代謝廢物的累積，細(xì)胞進(jìn)入： 新分裂的細(xì)胞數(shù)與死亡的細(xì)胞數(shù)相等的動(dòng)態(tài)平衡時(shí) 期。細(xì)胞數(shù)不增加，但代謝還是活躍的。 4 4、衰亡期（、衰亡期（senescencesenescence）：）：營(yíng)養(yǎng)物的耗盡和有害 物質(zhì)的作用，細(xì)胞死亡數(shù)大于細(xì)胞分裂數(shù)。 細(xì)胞濃度的對(duì)數(shù)潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定期衰亡期 0 24 48 72 96 120 h每代（群體）細(xì)胞生長(zhǎng)的四個(gè)時(shí)期每代（群體）細(xì)胞生長(zhǎng)的四個(gè)時(shí)期四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)四、動(dòng)物

9、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備條件（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備條件無菌條件：無菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細(xì)胞生長(zhǎng)條件：細(xì)胞生長(zhǎng)條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶， CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測(cè)條件：細(xì)胞檢測(cè)條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀 ，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器 細(xì)胞保存條件：細(xì)胞保存條件：液氮罐凈化工作室 - 我國(guó)藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn)我國(guó)藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn) -潔凈度級(jí)別塵粒最大允許數(shù)/立方米塵粒最大允許數(shù)0.5um5um浮游菌/立方沉降菌

10、/皿1003,50005110,000350,0002,0001003100,0003,500,00020,00050010300,00010,500,00060,000NA15風(fēng)淋室風(fēng)淋室:風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，它不僅可以清除人體和物品表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。風(fēng)淋時(shí)間可在30-99秒間的調(diào)整。風(fēng)淋室可以配合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調(diào)，一般控制溫度在30-35較為適宜。傳遞窗傳遞窗:該裝置是一種潔凈室的輔助設(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對(duì)潔凈區(qū)的污染降低到

11、最低程度。超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái) 超凈工作臺(tái)的工作超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空得到凈化。凈化空氣徐氣徐徐通過工作臺(tái)徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。成無菌環(huán)境。 紫外燈紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培 養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 大容量高壓滅菌器大容量高壓滅菌器 全自動(dòng)手提式滅菌器全自動(dòng)手提式滅菌器 電熱干燥箱：電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時(shí)）。主要用干玻璃器皿消毒 濾濾 器器濾器：濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，

12、如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。自動(dòng)三重純水蒸餾器自動(dòng)三重純水蒸餾器 純水儀純水儀培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：n 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。n 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90 ，14 h)。n 箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。移液器移液器離心機(jī)離心機(jī) 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器微孔板震蕩器液氮罐液氮罐（二）動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)一般條件（二）動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)一般條件1、恒定的溫度、恒定的溫度: 37

13、2、pH：最適為：最適為7.27.43、氣體：需要、氣體：需要O2、CO2 （95%空氣、空氣、5% CO2）4、營(yíng)養(yǎng)：、營(yíng)養(yǎng)：要求高，需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、要求高，需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌嘌呤、嘧啶、激素和生長(zhǎng)因子等。呤、嘧啶、激素和生長(zhǎng)因子等。（1 1）血清：）血清： 主要為牛（胎牛、新生牛、小牛）、馬、雞、兔、羊、人血清，各有特點(diǎn)。含各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生長(zhǎng)因子及無機(jī)物等。在生理平衡下促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。成分復(fù)雜，不同種類、不同廠家、不同批號(hào)作用均有差異。 血清提供細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和增殖必需的激素與生長(zhǎng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素（雌

14、二醇、孕酮、睪酮）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因（FGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血小板生長(zhǎng)因子（PDGF）。 血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。支原體、病毒污染。 血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘分鐘 血清的消毒：過濾除菌血清的消毒：過濾除菌（2）基礎(chǔ)培

15、養(yǎng)基（）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（essential medium）：）： 人工合成的只能使體外培養(yǎng)細(xì)胞短暫生存（添加天然培養(yǎng)基后細(xì)胞才能繁殖）的培養(yǎng)基。也稱通用培養(yǎng)基（可用于許多細(xì)胞）。低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要含：無機(jī)鹽、微量元素、氨基酸、維生素、碳水化合物等。現(xiàn)已有幾十種，用途不同。 基礎(chǔ)培養(yǎng)液：目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 HamF12和DMEM等。 (三三) 體外培養(yǎng)的一般過程體外培養(yǎng)的一般過程 體外細(xì)胞培養(yǎng)一般過程：體外細(xì)胞培養(yǎng)一般過程： 組織獲得組織獲得 組織消化組織消化 接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)傳傳代及細(xì)胞凍存復(fù)蘇等代及細(xì)胞凍存復(fù)蘇等 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程動(dòng)物細(xì)胞

16、培養(yǎng)的基本過程過程過程 組織組織取材取材 組織細(xì)胞的分離組織細(xì)胞的分離 培養(yǎng)培養(yǎng) 機(jī)械法機(jī)械法 消化法消化法 1、取材、取材 取鼠胚組織取鼠胚組織2、組織的分離、組織的分離（1）機(jī)械分散法）機(jī)械分散法 1）清洗：取得組織后，先用）清洗：取得組織后，先用 PBS 洗去表面血污，然后預(yù)切成洗去表面血污，然后預(yù)切成 5-10 mm3的小塊，置入不銹鋼網(wǎng)篩中（的小塊，置入不銹鋼網(wǎng)篩中（1mm 孔徑）；孔徑）； 2）壓擠：把網(wǎng)篩放在大碟皿上方，一手持網(wǎng)篩柄，另手用無菌度管末）壓擠：把網(wǎng)篩放在大碟皿上方，一手持網(wǎng)篩柄，另手用無菌度管末端徑輕壓擠組織，使之穿過紗網(wǎng)，然后用吸管吸取營(yíng)養(yǎng)液把紗網(wǎng)上剩余端徑輕壓擠

17、組織，使之穿過紗網(wǎng)，然后用吸管吸取營(yíng)養(yǎng)液把紗網(wǎng)上剩余組織吹洗掉；組織吹洗掉； 3）反復(fù)：用吸管從碟皿中吸出較大組織塊，置入）反復(fù)：用吸管從碟皿中吸出較大組織塊，置入 10m 篩中，進(jìn)行再篩中，進(jìn)行再壓擠，方法同（壓擠，方法同（2）；）； 4）鏡檢：被濾過的懸液即可用于培養(yǎng)；可先吸取不許懸液鏡檢，如組）鏡檢：被濾過的懸液即可用于培養(yǎng)；可先吸取不許懸液鏡檢，如組織塊過大，可再用織塊過大，可再用 20m 篩做進(jìn)一步壓擠，以分散成單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)；篩做進(jìn)一步壓擠，以分散成單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)； 5）培養(yǎng)：計(jì)數(shù)細(xì)胞（方法后述）后，接種培養(yǎng)。）培養(yǎng)：計(jì)數(shù)細(xì)胞（方法后述）后，接種培養(yǎng)。 （2）消化分離法）消化分

18、離法 組織消化法是在把組織剪切成較小體積的基礎(chǔ)上，應(yīng)用組織消化法是在把組織剪切成較小體積的基礎(chǔ)上，應(yīng)用生化和化學(xué)手段進(jìn)一步分散組織的方法。生化和化學(xué)手段進(jìn)一步分散組織的方法。1）胰蛋白酶（）胰蛋白酶（Trypsin ）消化法）消化法 胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較小的軟組織，如胚胎組織、胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較小的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮組織、肝、腎等軟組織，對(duì)傳代細(xì)胞也非常好。羊膜、上皮組織、肝、腎等軟組織，對(duì)傳代細(xì)胞也非常好。2）膠原酶（）膠原酶（Collagenase）消化法：）消化法： 膠原酶是一種由細(xì)菌中提取出的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化膠原酶是一種由細(xì)菌中提取出的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的

19、消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。上皮作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。上皮細(xì)胞本身對(duì)膠原酶有一定耐性，但膠原酶對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有好的細(xì)胞本身對(duì)膠原酶有一定耐性，但膠原酶對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有好的消化作用，可使上皮細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害，效果消化作用，可使上皮細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害，效果甚好。甚好。 3）EDTA 消化法：消化法： EDTA是一種非酶性消化物，常用不含是一種非酶性消化物，常用不含 Ca2+和和 Mg2+的的 PBS 配成配成0.02%的工作液。的工作液。 關(guān)于關(guān)于 EDTA的作用機(jī)制一般認(rèn)為是：一些組織，的作用機(jī)制一般認(rèn)為是：一些組織，尤其是上皮組織

20、，在生存中需要尤其是上皮組織，在生存中需要 Ca2+和和 Mg2+才能才能維持組織的完整性。維持組織的完整性。 EDTA能從這些組織生存環(huán)能從這些組織生存環(huán)境中吸收這些離子，形成螯合物，能促進(jìn)細(xì)胞相境中吸收這些離子，形成螯合物，能促進(jìn)細(xì)胞相互分離?；シ蛛x。（1 1）原代培養(yǎng)分為兩種：）原代培養(yǎng)分為兩種： 1 1）組織塊培養(yǎng)組織塊培養(yǎng) 2 2）組織消化培養(yǎng)組織消化培養(yǎng) 3 3、原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù)、原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù) 基本步驟：無菌取出目的組織基本步驟：無菌取出目的組織 用利刀無菌切割成用利刀無菌切割成1 12 2mm小塊小塊 培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)1801800 0，置，置15153030

21、分，使其貼壁分，使其貼壁 培養(yǎng)瓶翻回，置于培養(yǎng)瓶翻回，置于3737培養(yǎng)培養(yǎng)1）組織塊培養(yǎng)）組織塊培養(yǎng) 以以Hanks液漂洗干凈液漂洗干凈,低速離心，棄上清低速離心，棄上清移入培養(yǎng)瓶，加入適當(dāng)培養(yǎng)基浸潤(rùn)。移入培養(yǎng)瓶，加入適當(dāng)培養(yǎng)基浸潤(rùn)。機(jī)械分散組織法機(jī)械分散組織法組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法 取材分離和組織消化取材分離和組織消化 無菌取出目的組織無菌取出目的組織 用利刀無菌切割成細(xì)塊用利刀無菌切割成細(xì)塊 胰蛋白酶液消化胰蛋白酶液消化 HanksHanks液漂洗兩次，低速離心棄上清液漂洗兩次，低速離心棄上清 吸管吹打分散細(xì)胞吸管吹打分散細(xì)胞 移入培養(yǎng)瓶薄層培養(yǎng)移入培養(yǎng)瓶薄層培養(yǎng)2) 組織消化培養(yǎng)組織消

22、化培養(yǎng) 加入30-50倍體積0.25%濃度胰蛋白酶溶液37消化30-60min，每5-10min搖動(dòng)一次相關(guān)酶類包括：胰蛋白酶、膠原相關(guān)酶類包括：胰蛋白酶、膠原酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等，需根據(jù)酶及組織成分的牛酶等，需根據(jù)酶及組織成分的特點(diǎn)選擇使用特點(diǎn)選擇使用 接種、培養(yǎng)接種、培養(yǎng) 常規(guī)檢查常規(guī)檢查（檢查細(xì)胞形態(tài)及活力、檢查營(yíng)養(yǎng)液（檢查細(xì)胞形態(tài)及活力、檢查營(yíng)養(yǎng)液pHpH及污染）及污染）原代培養(yǎng)與檢查原代培養(yǎng)與檢查 傳代：當(dāng)原代培養(yǎng)成功后，細(xì)胞分裂增殖成片時(shí)，傳代：當(dāng)原代培養(yǎng)成功后，細(xì)胞分裂增殖成片時(shí)，需要對(duì)其分離重新培養(yǎng)，這一操作過程成為傳代。需要對(duì)其分離重

23、新培養(yǎng)，這一操作過程成為傳代。 第一次傳代時(shí)間：有第一次傳代時(shí)間：有80-90%80-90%或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞是傳代的理想時(shí)期。過早產(chǎn)量不足，過晚細(xì)胞狀態(tài)是傳代的理想時(shí)期。過早產(chǎn)量不足，過晚細(xì)胞狀態(tài)不佳。不佳。 （2 2）傳代培養(yǎng)技術(shù)）傳代培養(yǎng)技術(shù)基本步驟：基本步驟： 吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液 加入胰蛋白酶和加入胰蛋白酶和EDTAEDTA混和液混和液 (以能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)） 吸出消化液，加入培養(yǎng)液終止消化吸出消化液，加入培養(yǎng)液終止消化 吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散成懸液，計(jì)數(shù)吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散成懸液，計(jì)數(shù) 重新接種重新接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)1 1

24、）貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代）貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 培養(yǎng)培養(yǎng)2 2）懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代）懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代離心法傳代 直接傳代法直接傳代法 離心法傳代：離心（離心法傳代：離心（800-1000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分）去上）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除上清培養(yǎng)液去除l2一一23，然后用吸管，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。5、細(xì)胞的凍存復(fù)蘇、細(xì)胞的凍存復(fù)蘇 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。 （1 1）凍存意義：）凍

25、存意義： 1 1）長(zhǎng)期保存細(xì)胞；）長(zhǎng)期保存細(xì)胞； 2 2）防止細(xì)胞老化；）防止細(xì)胞老化； 3 3）減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染。）減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染。（2）凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融）凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 在細(xì)胞凍存時(shí)要盡可能均勻地減少細(xì)胞內(nèi)水分，在細(xì)胞凍存時(shí)要盡可能均勻地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞

26、逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。的損傷和破裂。 復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。的重結(jié)晶。（3）保存細(xì)胞三要素：營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)劑和低溫）保存細(xì)胞三要素：營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)劑和低溫低溫保護(hù)劑的應(yīng)用低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 在細(xì)胞凍存時(shí)加入保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。在細(xì)胞凍存時(shí)加入保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護(hù)劑是常用的低溫保護(hù)劑是甘油或甘油或DMSO，滲透性保護(hù)劑，可，滲透

27、性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。損傷。 保護(hù)劑的濃度在保護(hù)劑的濃度在515%之間，常用之間，常用10%。細(xì)胞凍存方法細(xì)胞凍存方法1）預(yù)先配制凍存液：）預(yù)先配制凍存液： 90%培養(yǎng)基（含培養(yǎng)基（含10%小牛血清小牛血清+10%DMSO）。）。2 ）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉海┤?duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，

28、加入適量?jī)龃嬉? 用用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞細(xì)胞/ml)。3 ）分裝：每瓶）分裝：每瓶1ml，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。稱和冷凍日期。4 ）凍存）凍存a.傳統(tǒng)方法：冷存管置于傳統(tǒng)方法：冷存管置于410分鐘分鐘 -2030分鐘分鐘 -801618小時(shí)小時(shí)(或隔夜或隔夜)液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存。液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20不可超過不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 b.程序

29、降溫：程序降溫：將凍存管放于盛有異丙醇的程序降溫凍存盒中。將凍存管放于盛有異丙醇的程序降溫凍存盒中。然后將凍存盒放入然后將凍存盒放入-70 冰箱內(nèi)。冰箱內(nèi)。24h后，把后，把-70 保存的凍保存的凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中。記錄細(xì)胞在液氮罐中凍存的位置。存管轉(zhuǎn)移至液氮中。記錄細(xì)胞在液氮罐中凍存的位置。冷凍管冷凍管程序降溫凍存盒程序降溫凍存盒（4）細(xì)胞復(fù)蘇方法）細(xì)胞復(fù)蘇方法 與快速融化的手段，以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的與快速融化的手段，以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞時(shí)間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害 。

30、 程序：程序： l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入）從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 水水浴中，使其融化（浴中，使其融化（1分鐘左右）。分鐘左右）。 2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。倍以上。 3）低速離心）低速離心10分鐘。分鐘。 4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。六、六、 培養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè)和特性鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè)和特性鑒定 （一）培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查（一）培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查 細(xì)胞接種或傳代以后，在生存期間，實(shí)驗(yàn)者每細(xì)胞接種或傳代以后，在生存期間，實(shí)驗(yàn)者每天或至多間隔天或至多間隔1-2天，要對(duì)細(xì)胞做常規(guī)性檢

31、查。天，要對(duì)細(xì)胞做常規(guī)性檢查。 觀察的結(jié)果是：污染與否，細(xì)胞生長(zhǎng)和觀察的結(jié)果是：污染與否，細(xì)胞生長(zhǎng)和pH等情況，等情況，隨時(shí)掌握細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，以便做換液或傳代處理，隨時(shí)掌握細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，以便做換液或傳代處理，如發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時(shí)采取措施。如發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時(shí)采取措施。 1、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞形態(tài) 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，在一般顯微鏡下觀察時(shí)透生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，在一般顯微鏡下觀察時(shí)透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看清明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看清細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。細(xì)胞機(jī)能不良時(shí)，輪廓增強(qiáng)，胞細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。細(xì)胞機(jī)能不良時(shí)，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間質(zhì)

32、中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點(diǎn)，如上皮細(xì)胞變成類纖維細(xì)胞等。點(diǎn)，如上皮細(xì)胞變成類纖維細(xì)胞等。2、細(xì)胞生長(zhǎng)情況、細(xì)胞生長(zhǎng)情況 很多情況下，開始從組織最先很多情況下，開始從組織最先“長(zhǎng)長(zhǎng)”出的為游走細(xì)胞，它出的為游走細(xì)胞，它們單獨(dú)活動(dòng)，形態(tài)不規(guī)則。在游走細(xì)胞之后，接著出現(xiàn)的們單獨(dú)活動(dòng)，形態(tài)不規(guī)則。在游走細(xì)胞之后，接著出現(xiàn)的是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞。說細(xì)胞是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞。說細(xì)胞“生長(zhǎng)生長(zhǎng)”不如說移動(dòng)更不如說移動(dòng)更為恰當(dāng)，因這時(shí)尚很少見細(xì)胞分裂，僅有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而已。為恰當(dāng)，因這時(shí)尚很少見細(xì)胞分裂，

33、僅有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而已。只有當(dāng)細(xì)胞開始分裂后，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成較大的只有當(dāng)細(xì)胞開始分裂后，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成較大的生長(zhǎng)暈或連接成片時(shí)，才真正進(jìn)入了生長(zhǎng)狀態(tài)。生長(zhǎng)暈或連接成片時(shí)，才真正進(jìn)入了生長(zhǎng)狀態(tài)。 一般發(fā)現(xiàn)細(xì)胞覆蓋瓶底的一般發(fā)現(xiàn)細(xì)胞覆蓋瓶底的80%80%就應(yīng)及時(shí)傳代，否則會(huì)影響細(xì)就應(yīng)及時(shí)傳代，否則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致細(xì)胞脫落。當(dāng)發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)顯著、密胞生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致細(xì)胞脫落。當(dāng)發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)顯著、密度增大、分布稠密、培養(yǎng)基變黃也應(yīng)及時(shí)傳代。度增大、分布稠密、培養(yǎng)基變黃也應(yīng)及時(shí)傳代。 3、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液 在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。用一般溫箱培養(yǎng)時(shí)，在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。用一

34、般溫箱培養(yǎng)時(shí)，隨細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，隨細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CO2積累增多，在超越緩沖范圍積累增多，在超越緩沖范圍后，營(yíng)養(yǎng)液酸化變黃，如不及時(shí)調(diào)節(jié)后，營(yíng)養(yǎng)液酸化變黃，如不及時(shí)調(diào)節(jié)PH，對(duì)細(xì)胞會(huì)發(fā)生，對(duì)細(xì)胞會(huì)發(fā)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞脫落死亡。培養(yǎng)液中加不利影響，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞脫落死亡。培養(yǎng)液中加Hepes或用或用CO2溫箱培養(yǎng)可使溫箱培養(yǎng)可使PH維持穩(wěn)定。用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)時(shí)，維持穩(wěn)定。用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)時(shí)，可因瓶口漏氣，可因瓶口漏氣，CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶和瓶塞洗刷溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶和瓶塞洗刷不潔殘留堿性物，使之變堿發(fā)紅。更換營(yíng)養(yǎng)液時(shí)間，可依不潔殘留堿性物，使之變堿發(fā)紅。更換營(yíng)養(yǎng)液時(shí)間，可依營(yíng)

35、養(yǎng)物的消耗而定，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)營(yíng)養(yǎng)物的消耗而定，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)- -天換一次，生天換一次，生長(zhǎng)緩慢時(shí)，長(zhǎng)緩慢時(shí)，- -天亦可。天亦可。 4、微生物污染、微生物污染 細(xì)胞接種、傳代、換液加藥后經(jīng)常觀察，密切注細(xì)胞接種、傳代、換液加藥后經(jīng)常觀察，密切注意是否有微生物污染發(fā)生。一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、意是否有微生物污染發(fā)生。一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、液體內(nèi)漂浮著菌絲或細(xì)菌，或生長(zhǎng)明顯變緩，胞質(zhì)液體內(nèi)漂浮著菌絲或細(xì)菌，或生長(zhǎng)明顯變緩，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，有中毒表現(xiàn)等應(yīng)懷疑是否有微生物污內(nèi)顆粒增多，有中毒表現(xiàn)等應(yīng)懷疑是否有微生物污染，進(jìn)一步觀察檢查并及時(shí)處理。染，進(jìn)一步觀察檢查并及時(shí)處理。 按現(xiàn)代的觀念，凡是混入培養(yǎng)

36、環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的按現(xiàn)代的觀念，凡是混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)該視為污染。根據(jù)這一概成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)該視為污染。根據(jù)這一概念，組織培養(yǎng)污染物應(yīng)包括念，組織培養(yǎng)污染物應(yīng)包括 生物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）生物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體） 化學(xué)物質(zhì)（影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成分）化學(xué)物質(zhì)（影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成分） 細(xì)胞（非同種的其他細(xì)胞）。細(xì)胞（非同種的其他細(xì)胞）。 其中以微生物最為多見。另外，隨著使用細(xì)胞種類增多，其中以微生物最為多見。另外，隨著使用細(xì)胞種類增多，不同細(xì)胞交叉污染，尤其是不同細(xì)胞交叉污染，尤其是Hela細(xì)胞的污染

37、也時(shí)有發(fā)生，細(xì)胞的污染也時(shí)有發(fā)生，從而造成細(xì)胞不純。從而造成細(xì)胞不純。污染的途徑污染的途徑 1） 空氣：空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑。因此，空氣：空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所。無菌操作應(yīng)在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所。無菌操作應(yīng)在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩，以免因講話、咳嗽等使外界污染進(jìn)入操工作時(shí)要帶口罩，以免因講話、咳嗽等使外界污染進(jìn)入操作面，造成污染。作面，造成污染。 2 ）器材：各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導(dǎo)）器材：各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導(dǎo)致污染，另外需要對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行定期消毒，防止形成污染致污染，另

38、外需要對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行定期消毒，防止形成污染 。3 ）操作：實(shí)驗(yàn)操作無菌觀念不強(qiáng)，培養(yǎng)兩種細(xì)胞以上時(shí)，）操作：實(shí)驗(yàn)操作無菌觀念不強(qiáng)，培養(yǎng)兩種細(xì)胞以上時(shí)，交叉使用吸管或培養(yǎng)液、瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。交叉使用吸管或培養(yǎng)液、瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。4 ）血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，）血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。變成了污染。 5 ）組織樣本）組織樣本污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響 培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。 細(xì)胞污染早期或污染程度較輕時(shí)，如果能及時(shí)去除細(xì)胞污染早期或污染程度較輕時(shí)，如果

39、能及時(shí)去除污染物，部分細(xì)胞有可能恢復(fù)。污染物，部分細(xì)胞有可能恢復(fù)。 污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中，輕者細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中，輕者細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，分裂相減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)細(xì)胞漿出現(xiàn)分裂相減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)細(xì)胞漿出現(xiàn)顆粒；污染較嚴(yán)重，細(xì)胞增值停止，分裂相消失，顆粒；污染較嚴(yán)重，細(xì)胞增值停止，分裂相消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓、脫壁細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓、脫壁。1）細(xì)菌的污染及檢測(cè)（）細(xì)菌的污染及檢測(cè)（肉眼直接觀察法、肉眼直接觀察法、培養(yǎng)檢查法、顯微鏡觀察法）培養(yǎng)檢查法、顯微鏡觀察法）l 多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞在遭到細(xì)菌的污染后，培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞

40、在遭到細(xì)菌的污染后，培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象，可見培變黃，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。l 培養(yǎng)檢測(cè)，可以取少量培養(yǎng)液涂布在無菌瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)檢測(cè)，可以取少量培養(yǎng)液涂布在無菌瓊脂培養(yǎng)基上，過夜查看。過夜查看。l 防止方法：通常在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作之外，培養(yǎng)基中加入防止方法：通常在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作之外，培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素能夠有效的防止細(xì)菌污染。青霉素、鏈霉素能夠有效的防止細(xì)菌污染。污染的預(yù)防污染的預(yù)防 培養(yǎng)前培養(yǎng)前培養(yǎng)操作時(shí)，必要的細(xì)胞備份。培養(yǎng)操作時(shí)，必要的細(xì)胞備份。 對(duì)新引進(jìn)或構(gòu)建的細(xì)胞

41、株應(yīng)加強(qiáng)觀察，對(duì)新引進(jìn)或構(gòu)建的細(xì)胞株應(yīng)加強(qiáng)觀察，并做必要的支原體和病毒的檢查。并做必要的支原體和病毒的檢查。定期消毒培養(yǎng)箱。定期消毒培養(yǎng)箱。培養(yǎng)物的污染及防止培養(yǎng)物的污染及防止如果有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時(shí)排除污染如果有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時(shí)排除污染物挽救細(xì)胞，常用的排除微生物污染的方法有以下幾種：物挽救細(xì)胞，常用的排除微生物污染的方法有以下幾種： 抗生素排除法抗生素排除法：采用：采用510倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用用2448小時(shí)，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時(shí)可以奏效。小時(shí)，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液

42、，有時(shí)可以奏效。 加溫除菌：加溫除菌：根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。將受支原體污染的細(xì)胞置于根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。將受支原體污染的細(xì)胞置于41度中作用度中作用510小時(shí)（最長(zhǎng)可以達(dá)小時(shí)（最長(zhǎng)可以達(dá)18小時(shí)）殺滅支原體。但是小時(shí)）殺滅支原體。但是41度對(duì)細(xì)度對(duì)細(xì)胞本身應(yīng)有較大影響，故在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定最大限度殺胞本身應(yīng)有較大影響，故在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定最大限度殺傷支原體而對(duì)細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。傷支原體而對(duì)細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。 動(dòng)物體內(nèi)接種：動(dòng)物體內(nèi)接種：細(xì)胞可以接種到同種動(dòng)物皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)免疫系細(xì)胞可以接種到同種動(dòng)物皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微

43、生物。統(tǒng)消滅掉微生物。 與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)：與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)：巨噬細(xì)胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消巨噬細(xì)胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用化。利用96孔板將極少培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，本方法與抗生素聯(lián)孔板將極少培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，本方法與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。合應(yīng)用效果更佳。 （二）培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定（二）培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定1 1、細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞形態(tài)觀察 內(nèi)容：細(xì)胞形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小及內(nèi)容：細(xì)胞形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小及 多少、微絲微管排列狀態(tài)等。多少、微絲微管排列狀態(tài)等。 方法：倒置相差顯微鏡、電鏡。方法：倒置相差顯微鏡、電鏡。2

44、 2、細(xì)胞生長(zhǎng)情況、細(xì)胞生長(zhǎng)情況細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定1）細(xì)胞計(jì)數(shù)法）細(xì)胞計(jì)數(shù)法 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞 Counter計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)儀步驟步驟 取生長(zhǎng)良好接近匯合的細(xì)胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基取生長(zhǎng)良好接近匯合的細(xì)胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。如是非貼壁細(xì)胞，則離心棄舊培養(yǎng)制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。如是非貼壁細(xì)胞，則離心棄舊培養(yǎng)基后，換上一定量的新鮮培養(yǎng)基然后制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)?；螅瑩Q上一定量的新鮮培養(yǎng)基然后制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)。 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按每個(gè)小方瓶根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按每個(gè)小方瓶5104mL作傳代培養(yǎng)作傳代培養(yǎng)接種細(xì)胞，共接種接種細(xì)胞，共接種21瓶細(xì)胞。瓶細(xì)胞。 24 h后開始計(jì)數(shù)細(xì)胞，以后每隔后開始計(jì)數(shù)細(xì)胞，以后每隔24 h計(jì)數(shù)一次，每次取計(jì)數(shù)一次，每次取3瓶細(xì)胞，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)瓶細(xì)胞，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)7 d。 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)mL)為縱坐標(biāo)，為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。2 2）四唑鹽）四唑鹽（MTT）比色法比色法 四唑鹽四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)，商品名為噻唑藍(lán)， 四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶