細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、METHODS AND TECHNIQUES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法u光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光（或紫外線）為光源。光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光（或紫外線）為光源。u電子顯微鏡：以電子束為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。n 顯微技術(shù)顯微技術(shù)1. 構(gòu)成：構(gòu)成： 照明系統(tǒng)照明系統(tǒng) 光學(xué)放大系統(tǒng)光學(xué)放大系統(tǒng) 機(jī)械裝置機(jī)械裝置2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡放大成虛像。原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡放大成虛像。（一）普通光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡u 光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡技術(shù)n顯微鏡的分辨率顯微鏡的分辨率分辨率分辨率 D0.61 N . sin / 2= N：聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)

2、的折射率，空氣為：聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率，空氣為1，油為，油為1.5； ：樣品對(duì)物鏡的張角（孔徑角）；：樣品對(duì)物鏡的張角（孔徑角）； ：照明光源的波長(zhǎng)；：照明光源的波長(zhǎng)； NANsin/2（物鏡的數(shù)值孔徑），（物鏡的數(shù)值孔徑），干燥系物鏡：干燥系物鏡：0.050.95，油鏡，油鏡0.851.40。幾種介質(zhì)的折射率幾種介質(zhì)的折射率n顯微鏡的最大分辨率顯微鏡的最大分辨率 目前最好的玻璃透鏡的鏡口角是目前最好的玻璃透鏡的鏡口角是140 可見(jiàn)光的波長(zhǎng)范圍可見(jiàn)光的波長(zhǎng)范圍400700nm，其中藍(lán)色光的波長(zhǎng)，其中藍(lán)色光的波長(zhǎng) 最短，為最短，為450nm 空氣介質(zhì)：空氣介質(zhì)： r0.61/NA0.61

3、450/0.94292nm0.3um 油介質(zhì)：油介質(zhì)： r0.61/NA0.61450/1.50.94196nm0.2um肉眼：肉眼：0.2 mm; 0.2 mm; 光鏡：光鏡：0.2 um; 0.2 um; 電鏡：電鏡：0.2 nm0.2 nmn顯微鏡的有效放大倍數(shù)顯微鏡的有效放大倍數(shù)光鏡：光鏡：0.2mm/0.2um0.2mm/0.2um1000 X1000 X電鏡：電鏡：0.2mm/0.2nm0.2mm/0.2nm10106 6 X X原理原理: : 熒光分子在受到光照射后，可吸收特定波熒光分子在受到光照射后，可吸收特定波 長(zhǎng)的短波光線，并發(fā)射出比原來(lái)吸收波長(zhǎng)長(zhǎng)的短波光線，并發(fā)射出比原來(lái)

4、吸收波長(zhǎng) 更長(zhǎng)的光。更長(zhǎng)的光。可見(jiàn)光可見(jiàn)光紫外光紫外光紅外光紅外光shortshortlonglong 基本構(gòu)造：基本構(gòu)造： A A 光源光源 B B 二向色鏡：反射短波光線，透過(guò)長(zhǎng)波光線二向色鏡：反射短波光線，透過(guò)長(zhǎng)波光線 C C 一組濾光片：得到純的激發(fā)光和發(fā)射光一組濾光片：得到純的激發(fā)光和發(fā)射光 (二二) 熒光顯微鏡熒光顯微鏡激發(fā)光濾片激發(fā)光濾片發(fā)射光光阻斷濾片發(fā)射光光阻斷濾片分光鏡分光鏡物鏡物鏡(二二) 熒光顯微鏡熒光顯微鏡特點(diǎn)：光源為短波光；特點(diǎn)：光源為短波光；有兩個(gè)特殊的濾光片；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。照明方式通常為落射式。Fluorescence image,

5、DNA in blue and Microtubules in green用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。觀察、基因定位、疾病診斷。 可用以觀察活細(xì)胞。可用以觀察活細(xì)胞。 波長(zhǎng)波長(zhǎng) 顏色顏色 振幅振幅 亮度亮度 速度速度 相位相位普通顯微鏡普通顯微鏡: : 光通過(guò)染色標(biāo)本時(shí)，波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，人眼光通過(guò)染色標(biāo)本時(shí)，波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，人眼才能觀察到。但光通過(guò)活細(xì)胞時(shí)，波長(zhǎng)和振幅幾乎無(wú)改變，才能觀察到。但光通過(guò)活細(xì)胞時(shí)，波長(zhǎng)和振幅幾乎無(wú)改變，這就無(wú)法用人眼觀察。這就無(wú)法用人眼觀察。 （三）（三）直視活細(xì)胞直視活細(xì)胞的

6、相差顯微鏡的相差顯微鏡 細(xì)胞內(nèi)的各結(jié)構(gòu)可因密度不同而產(chǎn)生相位差細(xì)胞內(nèi)的各結(jié)構(gòu)可因密度不同而產(chǎn)生相位差( (即即光程差光程差) )，不過(guò)人眼無(wú)法鑒別這種微小的變化。相差，不過(guò)人眼無(wú)法鑒別這種微小的變化。相差顯微鏡能夠把這種顯微鏡能夠把這種“相位差相位差”變成變成“振幅差振幅差”，即，即圖像的明暗差。圖像的明暗差。通過(guò)致密部分通過(guò)致密部分( (如細(xì)胞核如細(xì)胞核),),速度慢速度慢通過(guò)疏松部位通過(guò)疏松部位( (如細(xì)胞質(zhì)如細(xì)胞質(zhì)),),速度快速度快（四）（四）觀察物體輪廓觀察物體輪廓的暗視野顯微鏡的暗視野顯微鏡 在日常生活中，室內(nèi)飛揚(yáng)的微粒塵土是不易在日常生活中，室內(nèi)飛揚(yáng)的微粒塵土是不易被看見(jiàn)的，但在

7、暗的房間中若有一束從光線從門被看見(jiàn)的，但在暗的房間中若有一束從光線從門縫斜射過(guò)來(lái)，灰塵便粒?？梢?jiàn)了，這是光學(xué)上的縫斜射過(guò)來(lái)，灰塵便粒?？梢?jiàn)了，這是光學(xué)上的丁達(dá)爾現(xiàn)象丁達(dá)爾現(xiàn)象。 制造暗視野顯微鏡的靈感制造暗視野顯微鏡的靈感 原理原理: :（四）（四）觀察物體輪廓觀察物體輪廓的暗視野顯微鏡的暗視野顯微鏡（四）（四）觀察物體輪廓觀察物體輪廓的暗視野顯微鏡的暗視野顯微鏡聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標(biāo)本反射聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，物體邊緣是亮的，反差增大。和衍射的光線進(jìn)入物鏡，物體邊緣是亮的，反差增大?？捎^察可觀察 4 4200nm20

8、0nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高5050倍。倍。觀察的是物體的輪廓，分不清內(nèi)部的精細(xì)構(gòu)造，用于觀察活觀察的是物體的輪廓，分不清內(nèi)部的精細(xì)構(gòu)造，用于觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。（五）激光共聚焦掃描顯微鏡（五）激光共聚焦掃描顯微鏡用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描；用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描；能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)；能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)；分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3 3倍；倍；用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖用途類似熒光顯微鏡，

9、但能掃描不同層次，形成立體圖像。像。（六）倒置顯微鏡（六）倒置顯微鏡物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，有的還具有熒光裝置。有的還具有熒光裝置。 u電子顯微鏡電子顯微鏡n 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)以電子束（波長(zhǎng)比光波短以電子束（波長(zhǎng)比光波短100,000100,000倍）作光源，電倍）作光源，電磁場(chǎng)作透鏡；磁場(chǎng)作透鏡；分辨力分辨力0.2nm0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍；，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍；用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.20.2m m）。）。透射

10、電鏡的成像原理透射電鏡的成像原理 電子束通過(guò)標(biāo)本時(shí)，根據(jù)標(biāo)本各部位密度的不同，電子束通過(guò)標(biāo)本時(shí)，根據(jù)標(biāo)本各部位密度的不同，部分電子發(fā)生散射，只有剩余的電子成像，經(jīng)物鏡部分電子發(fā)生散射，只有剩余的電子成像，經(jīng)物鏡和投射鏡放大后投射到照相底片或熒屏上。和投射鏡放大后投射到照相底片或熒屏上。 由于散射的電子不參加成像，故標(biāo)本中密度大的部由于散射的電子不參加成像，故標(biāo)本中密度大的部分成像后形成電子流量減少的暗區(qū)；相反密度小的分成像后形成電子流量減少的暗區(qū)；相反密度小的部分散射電子少而形成明區(qū)。部分散射電子少而形成明區(qū)。透射電鏡及其圖像透射電鏡及其圖像n 掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡 工作原理：是用一束

11、極細(xì)的電子束掃描樣品，在工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出二次電子，二次電子的多少與樣樣品表面激發(fā)出二次電子，二次電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，二次電子由探測(cè)器收集，信號(hào)品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，二次電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。與電子束同步的掃描圖像。 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出二次電子，標(biāo)本在固定、為了使標(biāo)本表面發(fā)射出二次電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。樣品表面

12、形貌樣品表面形貌 表面越突出，圖像越亮表面越突出，圖像越亮 表面越凹陷，圖像越暗表面越凹陷，圖像越暗掃描電鏡及其圖像掃描電鏡及其圖像1.使用哪種儀器，可以獲得三維圖象使用哪種儀器，可以獲得三維圖象（ ） A.掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡 B透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡 C.熒光顯微鏡熒光顯微鏡 D光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡2.顯微鏡是觀察動(dòng)、植物切片和微生物的工具，評(píng)價(jià)一臺(tái)顯顯微鏡是觀察動(dòng)、植物切片和微生物的工具，評(píng)價(jià)一臺(tái)顯微鏡首選的因素是（微鏡首選的因素是（ ） A.物鏡和目鏡倍數(shù)物鏡和目鏡倍數(shù) B清晰度清晰度 .有名廠家有名廠家 D零件、功能齊全零件、功能齊全AB3.下列哪一項(xiàng)與顯微鏡的分辨率無(wú)

13、關(guān)（下列哪一項(xiàng)與顯微鏡的分辨率無(wú)關(guān)（ ） A光波波長(zhǎng)光波波長(zhǎng) B標(biāo)本和透鏡之間的物質(zhì)的折射率標(biāo)本和透鏡之間的物質(zhì)的折射率 C透鏡的數(shù)值孔徑透鏡的數(shù)值孔徑 D物鏡放大倍數(shù)物鏡放大倍數(shù) 4普通光學(xué)顯微鏡用油鏡觀察時(shí)鏡油應(yīng)該加在哪個(gè)部位普通光學(xué)顯微鏡用油鏡觀察時(shí)鏡油應(yīng)該加在哪個(gè)部位? A標(biāo)本上標(biāo)本上 B物鏡上物鏡上 C標(biāo)本和物鏡之間標(biāo)本和物鏡之間 D目鏡上目鏡上DC生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)n細(xì)胞化學(xué)技術(shù)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)n免疫細(xì)胞化學(xué)免疫細(xì)胞化學(xué)n顯微光譜分析技術(shù)顯微光譜分析技術(shù)n分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)nPCRPCR技術(shù)技術(shù)1.1.物理固定：物理固定：如冷凍切片。如冷凍切片。（一

14、）細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（一）細(xì)胞化學(xué)技術(shù)l固定固定目的是將細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)物質(zhì)雙重地目的是將細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)物質(zhì)雙重地保存下來(lái)。保存下來(lái)。2.2.化學(xué)固定：化學(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑均能對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和其中的某二醛和鋨酸等試劑均能對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和其中的某些化學(xué)物質(zhì)加以固定保存。些化學(xué)物質(zhì)加以固定保存。l顯示方法顯示方法1.1.金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成終生成CoSCoS或或PbSPbS有色沉淀，而顯示出酶活性。有色沉淀，而顯示出酶活性。2.2.SchiffSchiff反應(yīng)：醛基可

15、使反應(yīng)：醛基可使SchiffSchiff試劑中的無(wú)色品紅變?yōu)榧t試劑中的無(wú)色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（FeulgenFeulgen反應(yīng)）。反應(yīng)）。3.3.聯(lián)苯胺反應(yīng)：過(guò)氧化酶分解聯(lián)苯胺反應(yīng)：過(guò)氧化酶分解H H2 20 02 2。產(chǎn)生新生氧，后者再。產(chǎn)生新生氧，后者再將無(wú)色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。將無(wú)色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。4.4.脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。5.5.茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白

16、質(zhì)、酶、糖類與脂質(zhì)等的顯色方法與脂質(zhì)等的顯色方法（二）免疫細(xì)胞化學(xué)（二）免疫細(xì)胞化學(xué) 免疫細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用免疫細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同抗體同特定抗原專一結(jié)合特定抗原專一結(jié)合，對(duì)，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。的技術(shù)?？乖饕獮榇蠓肿踊蚺c大分子相結(jié)合的小分子；抗抗原主要為大分子或與大分子相結(jié)合的小分子；抗體則是由漿細(xì)胞針對(duì)特定的抗原分泌的體則是由漿細(xì)胞針對(duì)特定的抗原分泌的球蛋白。球蛋白。如果將抗體結(jié)合上標(biāo)記物，再與組織中的抗原發(fā)生如果將抗體結(jié)合上標(biāo)記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于

17、組織中的部位?？椫械牟课?。（三）顯微光譜分析技術(shù)（三）顯微光譜分析技術(shù) 細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。例如，性的吸收曲線。例如，核酸的吸收波長(zhǎng)為核酸的吸收波長(zhǎng)為260nm260nm，而而蛋白質(zhì)的則為蛋白質(zhì)的則為280nm280nm。某些成分經(jīng)組織化學(xué)染。某些成分經(jīng)組織化學(xué)染色后，對(duì)可見(jiàn)光有特定的吸收光譜。根據(jù)細(xì)胞成色后，對(duì)可見(jiàn)光有特定的吸收光譜。根據(jù)細(xì)胞成分所具有的這種特性，可利用分所具有的這種特性，可利用顯微分光光度計(jì)顯微分光光度計(jì)對(duì)對(duì)某些成分進(jìn)行定

18、位、定性，甚至定量測(cè)定。某些成分進(jìn)行定位、定性，甚至定量測(cè)定。具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過(guò)氫鍵結(jié)合，形成條件下，通過(guò)氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNADNA-DNA，DNA-RNADNA-RNA或或RNA-RNARNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來(lái)測(cè)定單鏈分子核苷酸序雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來(lái)測(cè)定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。1.1.原位雜交原位雜交用于檢測(cè)染色體上的特殊用于檢測(cè)染色體上的特殊DNADNA序列。最初是使用放射性序列。最初是使用放射性DNADNA探針，后來(lái)又發(fā)明

19、了免疫探針?lè)āＬ结?，后?lái)又發(fā)明了免疫探針?lè)ā＃ㄋ模┓肿与s交技術(shù)（四）分子雜交技術(shù)人類染色體端粒人類染色體端粒DNADNA的熒光原位雜交照片的熒光原位雜交照片 2.Southern雜交雜交是體外分析特異是體外分析特異DNADNA序列的方法，操作時(shí)先用限制序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核性內(nèi)切酶將核DNADNA或線粒體或線粒體DNADNA切成切成DNADNA片段，經(jīng)凝片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過(guò)放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互針雜交，通過(guò)放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。補(bǔ)的特殊核苷序列。將將RNARN

20、A轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交雜交。（五）（五）PCR技術(shù)技術(shù)1. 原理原理 PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）,它是利用它是利用DNA 雙鏈復(fù)制的原理，將基因的核苷酸序列不斷的雙鏈復(fù)制的原理，將基因的核苷酸序列不斷的加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。因?yàn)檎麄€(gè)過(guò)程是在加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。因?yàn)檎麄€(gè)過(guò)程是在體外體外進(jìn)行進(jìn)行，所以又叫做，所以又叫做體外體外DNA擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)。高溫變性高溫變性（9095）低溫退火低溫退火（5560）中溫延伸中溫延伸（7075）p 雙鏈雙鏈DNADNA是在高溫條件下解鏈為單鏈?zhǔn)窃诟邷貤l件下解鏈為單鏈DNADNA的，因此整的，因此整個(gè)過(guò)程不需要解旋酶。個(gè)過(guò)程不需要解旋酶。多次多次重復(fù)重復(fù)離心技術(shù)離心技術(shù)l差速離心差速離心l密度梯度離心密度梯度離心細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程體外培養(yǎng)的體外培養(yǎng)的3 3個(gè)環(huán)節(jié)：個(gè)環(huán)節(jié)：營(yíng)養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)生存環(huán)境生存環(huán)境廢物的排除廢物的排除 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（1 11010代）代） 傳代培養(yǎng)