無創(chuàng)產(chǎn)前檢測

1、無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測簡介無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測簡介內(nèi)容提要內(nèi)容提要sd_常見染色體疾病概述常見染色體疾病概述染色體非整倍體病發(fā)病機(jī)理染色體非整倍體病發(fā)病機(jī)理 傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)介紹傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)介紹 無創(chuàng)產(chǎn)前項(xiàng)目、院內(nèi)流程無創(chuàng)產(chǎn)前項(xiàng)目、院內(nèi)流程 四一二三一，染色體非整倍體概述（唐氏綜合征為例一，染色體非整倍體概述（唐氏綜合征為例 ）sd_7世紀(jì)考古學(xué)家挖掘出考古學(xué)家挖掘出典型唐氏綜合征典型唐氏綜合征體征顱骨。體征顱骨。素描畫中見到具素描畫中見到具有唐氏綜合征樣有唐氏綜合征樣面容的兒童。面容的兒童。John Langdon John Langdon D D own own 醫(yī)生第一次對醫(yī)生第一

2、次對唐氏綜合征的典型唐氏綜合征的典型體征進(jìn)行完整的描體征進(jìn)行完整的描述并發(fā)表述并發(fā)表。Downs syndromeDowns syndrome. .法國遺傳學(xué)家法國遺傳學(xué)家(Jerome LeJeune)(Jerome LeJeune)發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征是由人體的是由人體的第第2121號染色體的三體號染色體的三體變異變異造成的現(xiàn)象。造成的現(xiàn)象。16世紀(jì) 18661866年年19591959年年 21、18、13-三體綜合征是人類最常見的三種染色體疾病，患兒面容特殊，絕大多數(shù)為嚴(yán)重智力障礙及器官畸形，對家庭和社會造成巨大危害和負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對胎兒染色體疾病尚無有效治療方法，最好的方法是

3、在孕期通過產(chǎn)前篩查及診斷，發(fā)現(xiàn)異常并及時(shí)采取相應(yīng)措施染色體非整倍體疾病臨床表現(xiàn)染色體非整倍體疾病臨床表現(xiàn)2121三體照片三體照片a. a. 同源染色體同源染色體不分離不分離;b. ;b. 姐妹染色單體姐妹染色單體不分離不分離 二，二，染色體非整倍體病發(fā)病機(jī)理染色體非整倍體病發(fā)病機(jī)理 減數(shù)分裂中染色體不分離減數(shù)分裂中染色體不分離第一次減數(shù)分裂第一次減數(shù)分裂第二次減數(shù)分裂第二次減數(shù)分裂三，三，現(xiàn)有的現(xiàn)有的產(chǎn)前篩查與診斷手段產(chǎn)前篩查與診斷手段 sd_l 產(chǎn)前篩查產(chǎn)前篩查 母血清學(xué)篩查母血清學(xué)篩查 頸項(xiàng)透明膜厚度篩查頸項(xiàng)透明膜厚度篩查l 產(chǎn)前診斷產(chǎn)前診斷 羊水穿刺羊水穿刺 絨毛取樣絨毛取樣 臍靜脈穿刺

4、臍靜脈穿刺7侵入性診斷方式侵入性診斷方式風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算現(xiàn)有產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的現(xiàn)有產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的缺陷性缺陷性來源：來源：Estimated prenatal screening performance 1991-2006 (2006 data are provisional), England and Wales. sd_產(chǎn)前篩查（S）100,000篩查結(jié)果陽性（SP）7,000篩查結(jié)果陰性（SN）93,000唐氏綜合征胎兒 400真陽性 （TSP） 340假陰性 （FSN） 60非唐氏綜合征胎兒 99,600假陽性（FSP） 6,660真陰性 （TSN） 92,9401992-200

5、6傳統(tǒng)診斷方法（穿刺）導(dǎo)致的正常胎兒流失傳統(tǒng)診斷方法（穿刺）導(dǎo)致的正常胎兒流失5619最緊迫任務(wù)：最緊迫任務(wù)：新方法新方法的探索：的探索：提高檢測的準(zhǔn)確性與檢出率、降低檢測過程提高檢測的準(zhǔn)確性與檢出率、降低檢測過程中的假陽性率和假陰性率。中的假陽性率和假陰性率。sd_四，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)產(chǎn)生前四，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)產(chǎn)生前提一：孕婦外周血中存在胎兒提一：孕婦外周血中存在胎兒DNADNA胎兒胎兒DNADNA來源和特點(diǎn)來源和特點(diǎn)來源：來源：1 胎兒細(xì)胞通過胎盤滲透到母血中，被母體免疫系統(tǒng)破壞，胎兒DNA殘留下來；2 胎兒細(xì)胞凋亡；3 胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡基本特點(diǎn)：基本特點(diǎn)：1 含量有一定的變化

6、規(guī)律。妊娠第4周開始可檢出胎兒游離DNA，隨著孕周增加而增加，存在個(gè)體差異，平均濃度。2 分娩后短時(shí)間內(nèi)消失，平均半衰期為16.3min (4-30min)， 2h就無法檢出。再次妊娠不影響檢測結(jié)果。3 DNA片段較小，平均166bp左右。常規(guī)技術(shù)很難檢測前提二前提二：第二代高通量測序儀發(fā)明第二代高通量測序儀發(fā)明6 6億個(gè)億個(gè)DNADNA片段片段/ /次，全基因組測序只要次，全基因組測序只要1010天天/ /臺；臺；9090個(gè)個(gè)DNADNA片段片段/ /次，全基因組測通要次，全基因組測通要5050年年/ /臺。臺。（20122012年）年）無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測：無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測：母血漿母血漿DNA

7、+DNA+高通量測序高通量測序2022-7-2母體和胎兒的混合物13Unique reads (單一序單一序列讀取列讀?。? no mismatch, one location(Lo (Lo et alet al, , PNASPNAS, , 20082008) )理論模型理論模型 母親母親Chr 21Chr 21：95952=1902=190母體外周血中母體外周血中Chr 21=190+10=200Chr 21=190+10=200以21-三體為例：100 DNA單位 /毫升血漿。其中，95個(gè)單位來源于母親， 5個(gè)單位來源于胎兒 通過大規(guī)模并行測序，獲得分布在每條染色體上的真實(shí)的核酸片段數(shù)通

8、過大規(guī)模并行測序，獲得分布在每條染色體上的真實(shí)的核酸片段數(shù)量，經(jīng)過計(jì)數(shù)與比較：量，經(jīng)過計(jì)數(shù)與比較： 正常胎兒正常胎兒 或者或者 21-21-三體胎兒三體胎兒 正常胎兒正常胎兒 Chr 21Chr 21：5 52=102=10 母親母親Chr 21Chr 21：95952=1902=190 21-21-三體胎兒三體胎兒 Chr 21Chr 21：5 53=153=15母體外周血中母體外周血中Chr 21=Chr 21=190+190+15=20515=205 醫(yī)醫(yī) 院院華大基因華大基因無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測流程無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測流程sd_準(zhǔn)確性高于準(zhǔn)確性高于99%99%；早期診斷早期診斷，1212孕周即

9、可檢測；減少妊娠晚期引產(chǎn)對孕婦造孕周即可檢測；減少妊娠晚期引產(chǎn)對孕婦造成的傷害；成的傷害；非侵入性非侵入性，減輕孕婦心理負(fù)擔(dān)，無流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)以及產(chǎn)前診斷，減輕孕婦心理負(fù)擔(dān)，無流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)以及產(chǎn)前診斷引起的并發(fā)癥；引起的并發(fā)癥；可以同時(shí)檢測可以同時(shí)檢測其它染色體異常其它染色體異常所需樣本量所需樣本量少少，只需，只需5 5毫升毫升母體外周血。母體外周血。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的優(yōu)勢：優(yōu)勢：無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的優(yōu)勢：保險(xiǎn)保障優(yōu)勢：保險(xiǎn)保障檢測結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)受檢者檢測結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)受檢者產(chǎn)前診斷所產(chǎn)生的費(fèi)用含：羊膜腔穿刺術(shù)(或經(jīng)皮臍靜脈穿刺術(shù))和染色體核型分析和染色體熒光原位雜交（或F

10、ISH），保險(xiǎn)公司給予報(bào)銷超過2500元。檢測結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)檢測結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)，若受檢者嬰兒出生后一年內(nèi)經(jīng)縣級以上檢測醫(yī)院?？漆t(yī)生明確診斷患有“21-三體綜合征”、“18-三體綜合征”、“13-三體綜合征”，保險(xiǎn)公司支付受檢者保險(xiǎn)二十萬元整 孕期各項(xiàng)檢測信息圖孕期各項(xiàng)檢測信息圖10-13.510-13.5周周早孕期篩查早孕期篩查( (檢出率檢出率85%85%)中孕期篩查中孕期篩查 (檢出率檢出率81%)15-2015-20周周16-2216-22周周羊水穿刺羊水穿刺（流產(chǎn)率（流產(chǎn)率0.5-1%0.5-1%）9-119-11周周絨毛取樣絨毛取樣（流產(chǎn)率（流產(chǎn)率1-5%1-5%） 24-2824-28

11、周周 臍帶血取樣臍帶血取樣（流產(chǎn)率（流產(chǎn)率1-3%）0 04040周周12-2412-24周周無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（準(zhǔn)確率準(zhǔn)確率99%99%）適應(yīng)人群和適應(yīng)癥適應(yīng)人群和適應(yīng)癥 經(jīng)B超確認(rèn)為單、活胎孕婦； 可檢測胎兒-13三體、18三體和21三體； 孕12周以上均可進(jìn)行檢測。禁忌人群、禁忌癥禁忌人群、禁忌癥 懷多胞胎的孕婦； 孕婦本人為染色體非整倍體疾病患者； 孕婦接受過異體輸血、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療、接受過配偶或親屬淋巴細(xì)胞免疫治療等； 無法精確檢測胎兒染色體嵌合型、易位型、微缺失、微重復(fù)、微缺失等結(jié)構(gòu)性異常；院內(nèi)流程院內(nèi)流程檢測前確認(rèn)事項(xiàng)：1.單活胎（超聲確認(rèn)）2.孕后未接受過異

12、體的血液制品；3. 孕12周以后開始檢測 產(chǎn)前診斷中心/產(chǎn)科就診,醫(yī)生解釋該項(xiàng)目孕婦簽署知情同意書/送檢單,領(lǐng)取保險(xiǎn)卡孕婦交費(fèi)后返回產(chǎn)前診斷護(hù)士站抽血（附知情同意/送檢單）采血：EDTA抗凝管采集外周血5ml（輕微顛倒采血管4次）護(hù)士打印2張條形碼1張貼于采血管上，1張貼于申請單的右上角采血后護(hù)士立即交給標(biāo)本處理人員標(biāo)本處理人員（附申請單）（產(chǎn)前診斷中心3樓標(biāo)本接收處（標(biāo)本4保存，不可室溫放置）；）；標(biāo)本處理人員標(biāo)本處理人員8小時(shí)內(nèi)分離血漿，并填寫樣本信息單全血采集抽取孕婦外周血5 mL，采用 EDTA 抗凝；采血完畢后，輕微顛倒采血管4次，并及時(shí)將采血管放置于4冰箱中，在4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行血漿分離

13、工作。【注意事項(xiàng)】采血時(shí)孕婦無需空腹；采血管為 5 mL EDTA 抗凝管；顛倒混勻時(shí)動作不能太劇烈，防止溶血。血漿分離（本步驟在華大基因完成）1 1、將采血管、將采血管4 4 1600g1600g離心離心10min10min，上清（血漿）分裝到置于冰盒上且已編號的，上清（血漿）分裝到置于冰盒上且已編號的2.0ml2.0ml的的 EP EP 管中。管中?！咀⒁馐马?xiàng)】1）嚴(yán)格核對樣本編號、確保編號唯一； 2）開啟離心管時(shí)，不能碰到管內(nèi)蓋；3）吸取血漿過程中不要吸到中間層的白細(xì)胞；2 2、上述血漿、上述血漿 4 4 16000g 16000g 離心離心10 min10 min，冰盒上將上清轉(zhuǎn)入已編

14、號的，冰盒上將上清轉(zhuǎn)入已編號的2.0ml EP 2.0ml EP 管管中，每個(gè)離心管轉(zhuǎn)入中，每個(gè)離心管轉(zhuǎn)入600ul600ul血漿。同時(shí)在每個(gè)血漿。同時(shí)在每個(gè)2.0ml2.0ml離心管上標(biāo)記樣本編號、血漿體離心管上標(biāo)記樣本編號、血漿體積、分離日期。積、分離日期?！咀⒁馐马?xiàng)】1）嚴(yán)格核對樣本編號、確保樣本編號唯一；2）開啟離心管管蓋時(shí)，不能碰到離心管內(nèi)蓋；3）將分離好的血漿貼上對應(yīng)的條碼并用封口膜密封，密封結(jié)束后立即將血漿放入-20 或-80 冰箱中，避免反復(fù)凍融?！咀⒁馐马?xiàng)】全血須保證在8小時(shí)內(nèi)進(jìn)行血漿分離；分離后的血漿在-20 冰箱中可保存3天，長期保存需存放于-80 冰箱。樣本儲存與運(yùn)輸1

15、、全血樣本在冰袋(4 )條件下運(yùn)輸，且在4小時(shí)內(nèi)送達(dá)樣本接收處，樣本接收后要立即完成血漿分離。2、血漿樣本在干冰（-20 ）條件下運(yùn)輸，并確保樣本送達(dá)時(shí)有干冰剩余，到達(dá)后及時(shí)存放于-80 冰箱中，禁止將樣本在室溫下放置?！咀⒁馐马?xiàng)】1）泡沫箱的規(guī)格：壁厚6cm、外徑長39cm、外徑寬32cm、外徑高35cm。2）干冰用量：10公斤/2-3天；15公斤/4-5天；根據(jù)運(yùn)送時(shí)間的長短，相應(yīng)增加干冰用量。樣本數(shù)T21T18T13XOXXYXXXXYY樣本總數(shù)26619272891513753核型分析347619163108643假陽性 1101000假陰性 0000000檢出率100%100%100

16、%100%100%100%100%假陽性率0.03%0.03%0.00%0.02%0.00%0.00%0.00%陽性預(yù)測值99.48%98.44%100%88.89%100%100%100%假陰性率 - 0%0%0%0%0%0%0%陰性預(yù)測值100%100%100%100%100%100%100%數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（截至2012年3月）全球全球100100多家合作醫(yī)院。多家合作醫(yī)院。完成核型驗(yàn)證完成核型驗(yàn)證34763476例，產(chǎn)后隨訪驗(yàn)證例，產(chǎn)后隨訪驗(yàn)證54895489例。例。病例分析：單純型/標(biāo)準(zhǔn)型標(biāo)準(zhǔn)型標(biāo)準(zhǔn)型T21T21樣本編號：樣本編號： PDP10003761PDP10003761孕婦年齡：孕婦

17、年齡：3131唐唐 篩：篩：1/510 1/510 （低風(fēng)險(xiǎn)）（低風(fēng)險(xiǎn)）無創(chuàng)檢測：無創(chuàng)檢測：T21T21核型分析：核型分析：4747，XXXX，+21+21T13T13 樣本編號：樣本編號：PDP100003321PDP100003321 孕婦年齡：孕婦年齡：3232 無創(chuàng)檢測：無創(chuàng)檢測：T13T13 核型分析：核型分析：4747，XXXX，+13+13病例分析：單純型/標(biāo)準(zhǔn)型T18T18 樣本編號：樣本編號：PDP100002190PDP100002190 孕婦年齡：孕婦年齡：3232 無創(chuàng)檢測：無創(chuàng)檢測：T18T18 核型分析：核型分析：4747，XYXY，+18+18T9T9 PDB11

18、AJ00026 PDB11AJ00026，4141歲，孕歲，孕23w+423w+4周周 無創(chuàng)檢測：無創(chuàng)檢測：T9T9 羊水核型：羊水核型：T9T9T16T16 PDB11AJ00783 PDB11AJ00783 ，3030歲，孕歲，孕1919周周 無創(chuàng)檢測：無創(chuàng)檢測：1616號染色體偏多號染色體偏多 羊水羊水FISHFISH：T16T16病例分析：其它染色非整倍體病例分析：T9嵌合體PDB11AG00106PDB11AG00106，3939歲，孕歲，孕2020周周無創(chuàng)檢測：兩次測序結(jié)果均顯示無創(chuàng)檢測：兩次測序結(jié)果均顯示9 9號染色體偏多號染色體偏多羊水核型：羊水核型：47,XX,+955/46,XX3347,XX,+955/46,XX33臍血核型：臍血核型：47,XX,+93/46,XX,22547,XX,+93/46,