3,5二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖

1、3,5-二硝基水楊酸比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1.實(shí)驗(yàn)原理還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖10257RP麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。COOE還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應(yīng)乘以0.9。加熱還驚

2、糖»堿tt2實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑2.1實(shí)驗(yàn)材料主要用到這些實(shí)驗(yàn)材料：紅曲黃色素發(fā)酵液、鈉慮膜濃縮后紅曲黃色素液、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后紅曲黃色素液。2.2主要儀器本實(shí)驗(yàn)用到的實(shí)驗(yàn)儀器有:1) 具塞玻璃刻度比色管：25mLxl9；2) 燒杯：100mLx4；3) 二角瓶：lOOmLxl；4) 容量瓶：100mLx3,50mLx3；5) 刻度吸管：1mLx4；2mLx3；lOmLxl；6) 沸水??；7)冰??；8)扭力天平；9)UV2802SH型紫外可見分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司；2.3實(shí)驗(yàn)試劑1) lmg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取8O°C烘至恒重的分析純葡萄糖lOOmg,置于

3、小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到lOOmL容量瓶中，用蒸餾水定容至lOOmL,混勻，4C冰箱中保存?zhèn)溆谩?) 3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑將6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有l(wèi)85g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至lOOOmL，貯于棕色瓶中備用。3實(shí)驗(yàn)步驟制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支25mL具塞刻度試管編號，按表l分別加入濃度為lmg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。表1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管號1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水(mL)DNS(mL)葡萄糖

4、含量(mg)光密度值(OD540nm)(mL)0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2將各管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min，取出，冰浴冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計上進(jìn)行比色。調(diào)波長540nm,用0號管調(diào)零點(diǎn)，測出16號管的光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。蒽酮比色法測糖一 目的掌握蒽酮比色法測糖的原理和方法二 原理蒽酮比色法是一個快速而簡便的定糖方法。蒽酮可以與游離的已糖或多糖中的已糖基、戊

5、糖基及已糖醛酸起反應(yīng)，反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色，在620nm處有最大吸收。本法多用于測定糖原的含量，也可用于測定葡萄糖的含量。三 實(shí)驗(yàn)器材及試劑馬鈴薯干粉可調(diào)試移液器或移液管可見分光光度計(723型)電子分析天平水浴鍋電爐子蒽酮試劑：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml,當(dāng)日配制使用。標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(0.1mg/ml)：100mg葡萄糖溶解到蒸餾水中，定容到1000ml備用。四、操作1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支干燥潔凈的試管，按表1順序加入試劑，進(jìn)行測定。以吸光度值為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1蒽酮比色法定糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作沸水浴中準(zhǔn)

6、確煮沸l(wèi)Omin,取出用流水冷卻，室溫放lOmin,于620nm處比色葡萄糖濃度（mg/ml）2. 樣品含量的測定樣品液的制作：精確稱取馬鈴薯干粉O.lg置于錐形瓶中加入30ml沸水沸水浴30min（不時搖動）取出，3000rpm離心lOmin（或過濾）反復(fù)洗滌殘渣2次合并濾液冷卻至室溫定容到50ml的錐形瓶中再從中取出1ml,再定容到10ml的容量瓶中樣品液的測定：（1）取4支試管，按照表2加樣（加蒽酮時需要冰水浴5min冷卻）表2蒽酮比色法定糖樣品的測定（2）加樣冷卻完成后置沸水中煮沸l(wèi)Omin,取出流水冷卻放置lOmin,620nm處比色測量各管OD值。（3）以l號試管作為調(diào)零管，2、3

7、、4號管的OD值取平均后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品液相應(yīng)的含糖量。3結(jié)果計算：CxVxlOO%m，式中W：糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（）C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/ml）V：樣品稀釋后的體積（ml）m：樣品的質(zhì)量（ml）一 目的掌握蒽酮比色法測糖的原理和方法二 原理蒽酮比色法是一個快速而簡便的定糖方法。蒽酮可以與游離的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反應(yīng)，反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色，在620nm處有最大吸收。本法多用于測定糖原的含量，也可用于測定葡萄糖的含量。三 實(shí)驗(yàn)器材及試劑馬鈴薯干粉可調(diào)試移液器或移液管可見分光光度計（723型）電子分析天平水浴鍋電爐子蒽酮試劑：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，

8、以80%H2SO4定容到1000ml,當(dāng)日配制使用。標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸餾水中，定容到1000ml備用。四、操作1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支干燥潔凈的試管，按表1順序加入試劑，進(jìn)行測定。以吸光度值為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1蒽酮比色法定糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作沸水浴中準(zhǔn)確煮沸10min,取出用流水冷卻，室溫放10min,于620nm處比色葡萄糖濃度（mg/ml）2. 樣品含量的測定樣品液的制作：精確稱取馬鈴薯干粉0.1g置于錐形瓶中一-加入30ml沸水一-沸水浴30min（不時搖動）一一取出，3000rpm離心10min（或過濾

9、）反復(fù)洗滌殘渣2次合并濾液冷卻至室溫定容到50ml的錐形瓶中再從中取出1ml,再定容到10ml的容量瓶中樣品液的測定：（1）取4支試管，按照表2加樣（加蒽酮時需要冰水浴5min冷卻）表2蒽酮比色法定糖樣品的測定（2）加樣冷卻完成后置沸水中煮沸10min,取出流水冷卻放置10min,620nm處比色測量各管0D值。（3）以1號試管作為調(diào)零管，2、3、4號管的0D值取平均后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品液相應(yīng)的含糖量。3結(jié)果計算：CxVw=x100%m，式中W:糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（）C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/ml）V:樣品稀釋后的體積（ml）m：樣品的質(zhì)量（ml）原理植物在個體發(fā)育的各個時期，代謝活

10、動也發(fā)生相應(yīng)的變化，碳水化合物的代謝也不例外，其含量也隨之發(fā)生變化。了解可溶性糖含量的變化，在生理上和實(shí)踐上都有重要的意義。這里介紹的是蒽酮比色法，糖在硫酸的作用下生成糖醛，糖醛再與蒽酮作用，形成一種綠色的絡(luò)合物，顏色的深淺與糖含量有關(guān)。方法簡便，但沒有志一性，對于絕大部分的碳水化合物都能與蒽酮反應(yīng)，產(chǎn)生顏色。儀器藥品721型分光光度計分析天平研缽恒溫水浴鍋燒杯容量瓶三角燒瓶大試管移液管漏斗乙醚草酸鈉飽和醋酸鉛葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取已在80°C烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg,配制成500ml溶液，即得每ml含糖為200pg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。蒽酮試劑：稱取1g經(jīng)過純化的蒽酮，溶解于1000m

11、l稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml濃硫酸（比重1.84）稀釋成1000ml而成。操作步驟1可溶性糖的提取稱取重約5g的新鮮植物葉子，于研缽中乙醚少許，仔細(xì)研磨成均勻的漿狀物，倒入燒杯中，用70C熱水洗滌研缽，洗液并入燒杯中，再加蒸鎦水3040ml。將燒杯放在水浴鍋中加熱，保持溫度70-80C約半小時，冷卻后1滴1滴地加入飽和中性醋酸鉛，以除去蛋白質(zhì)，直至加入醋酸鉛時不再形成白色沉淀為止。然后將此混合物連同殘渣一并洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振蕩。以干燥漏斗將濾液過濾于一干燥的三角燒瓶中，瓶中事先放有少量（約0.20.4g）草酸鈉粉末，以除去濾液中過量的醋酸鉛，使生成草酸鉛沉淀，再

12、行過濾，所得的透明濾液即為可溶性糖提取液。2顯色及比色吸取上述糖提取液1ml,放入一干潔的試管中，加蒽酮試劑5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻，然后于分光光度計上進(jìn)行測定，波長為625nm,測得吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得濾液中的糖含量（或經(jīng)直線回歸公式計算），然后再行計算樣品中含糖百分?jǐn)?shù)。3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液將其釋成一系列不同濃度的溶液，濃度分別為每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100pg。按上述方法分別測得其吸光度，然后繪制A026糖濃度曲線，或進(jìn)行直線回歸求得直線方程。4計算樣品中含糖%設(shè)V為植物樣品稀釋后的體積（ml）C為提取液

13、的含糖量（pg/ml）W為植物組織鮮重（g）則得計算式如下：=CxV/（WJ000000）"00%編輯本段蒽酮比色法測定多糖含量a多糖含有幾百個或更多殘基，但只有一個還原基團(tuán)，因此它的還原能力極弱，對于他們的測定，應(yīng)先將它們用酸水解成單糖組分。蒽酮比色法是一種快速而簡便的定糖方法，糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛及其衍生物，該衍生物與蒽酮發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色，于620nm處有最大吸收。因此可用此方法測定多糖含量。b試劑2g/L蒽酮試劑：溶解2g蒽酮于1L濃硫酸（98%的濃硫酸）中，當(dāng)日配制使用。0.01g/L葡萄糖溶液（可加幾滴甲苯作防腐劑）0.1g/L糖元溶液c實(shí)驗(yàn)器材試管及試管架

14、吸量管（1ml,5ml）恒溫水浴箱（100°C）制冰機(jī)紫外分光光度計滴管白瓷板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取0.1g葡萄糖（分析純），溶解并用蒸餾水定容至100ml后，分別取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分別加入到50的容量瓶中，并用蒸餾水定容到50ml，配成濃度分別為20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于試管中，再加入3ml的蒽酮試劑，迅速浸入冰水中冷卻，待幾支試管均勻加完后，一起浸入100r恒溫水浴箱中，為防止水分蒸發(fā)，應(yīng)在試管口上加蓋一個玻璃球或者加一個塞子，自溫度重新升至100°C起計時，準(zhǔn)確保溫10min后取出，用流動水冷卻，然后，于室溫中平衡片刻（約10min左右），在分光光度計上，波長620nm處，用0.5cm厚度的比色杯，以空白管做對照空白（此處的空白是指不加葡萄糖的蒽酮試劑，其他反應(yīng)條件都一致），進(jìn)行比色。既得標(biāo)準(zhǔn)曲線。如下表格編號123456體積ml012345濃度ug/ml020406080100d樣品測定如上述條件一致，但要記得用除去蛋白質(zhì)的樣品溶液進(jìn)行測定，否則會影響測定結(jié)果