基因工程復(fù)習(xí)內(nèi)容整理

1、第二章 基因操作的主要原理1、核酸凝膠電泳的原理及分類？在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)。將DNA、RNA放到電場中，它就會(huì)由負(fù)極正極移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的分子具有更緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移率也就比同等分子量的松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快些。分類：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、脈沖電場凝膠電泳。2、影響DNA遷移率的因素有那些？DNA分子量大小；DNA的構(gòu)象；凝膠的濃度。3、EB的作用原理。一種具扁平分子的核酸染料，可插入到DN

2、A或RNA分子的堿基之間。在300nm紫外燈照射下發(fā)射出熒光。4、核酸分子雜交所依據(jù)的原理是什么？有那幾種雜交方式？帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。雜交方式有:DNA/DNA印跡雜交Southern Blotting；RNA/RNA印跡雜交Northern blotting；斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交；菌落或噬菌斑雜交。5、細(xì)菌轉(zhuǎn)化的技術(shù)方法。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法、電穿孔法。6、Sanger的雙脫氧鏈終止法的技術(shù)路線？利用了DNA聚合酶的兩種特性：第一，它能夠利用單鏈的DNA做模板，合成出準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；第二，

3、DNA聚合酶能夠利用2,3-雙脫氧核苷酸做底物，使之參入到寡核苷酸連的3末端，從而終止鏈的生長。技術(shù)路線：見書7.化學(xué)修飾法的技術(shù)路線：見P71，參考技術(shù)圖8.PCR的原理：雙鏈DNA分子在高溫下解鏈成兩條單鏈DNA，然后DNA聚合酶在有一對(duì)寡核苷酸引物的存在的情況下，以單鏈DNA為模板利用反應(yīng)混合物中的dNTPs合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。并且，每一條新生鏈上都具有了新的引物結(jié)合位點(diǎn)。然后反應(yīng)混合物再經(jīng)過上述過程，即可有合成新鏈。如此反復(fù)循環(huán)，即可實(shí)現(xiàn)特定區(qū)段DNA的迅速大量擴(kuò)增。9.簡并引物：一類由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的差異。Taq聚合酶：有5®3D

4、NA聚合酶活性；無3®5外切酶活性；最適聚合酶溫度72，連續(xù)保溫30min具有相當(dāng)活力，選擇72延伸；變性溫度：95使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性。Pfu聚合酶：耐熱；有5®3DNA聚合酶活性和35外切酶活性；精確度：pfu >Taq，但pfu擴(kuò)增效率通常比Taq酶略差反向PCR：是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。10.盒式取代誘變的原理：利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒取代野生型基因中的相應(yīng)序列。這種寡核苷酸盒是由兩條合成的寡核苷酸組成的，當(dāng)它們退火時(shí)，會(huì)按設(shè)計(jì)要求產(chǎn)生出需要的粘性

5、末端。Kunkel定點(diǎn)誘變： 將待突變的基因克隆入RF-M13 DNA載體上，導(dǎo)入具有dUTP酶（dut-）和N-尿嘧啶脫糖苷酶（ung-）雙缺陷的大腸桿菌（dut-，ung-）菌株中。 dUTP酶缺陷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)dUTP水平上升，并在DNA復(fù)制時(shí)，部分取代dTTP進(jìn)入DNA新生鏈中。又由于ung缺陷使摻入DNA的dUTP殘基不能除去。由這種大腸桿菌菌株產(chǎn)生的M13單鏈DNA大約有1%的T被U所取代，然后進(jìn)行DNA定點(diǎn)誘變。 雙鏈DNA導(dǎo)入正常的大腸桿菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基。結(jié)果原來的M13模板鏈被降解，只有突變鏈因不含U，被保留下來。這種方法產(chǎn)生的M13噬菌體中含

6、有突變DNA的比例大大增加。重組PCR定點(diǎn)誘變：詳見P9811.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)原理：DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合后分子量變大，改變了遷移率，由此判斷DNA是否與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合。競爭DNA的作用：反應(yīng)體系中加入超量的非標(biāo)記競爭DNA，用于研究DNA與蛋白質(zhì)作用的專一性。12.DNaseI印跡試驗(yàn)原理：詳見P115，參考技術(shù)圖13.甲基化干擾試驗(yàn)原理：根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理。第三章1、限制性內(nèi)切酶識(shí)別DNA的特點(diǎn)？什么是同裂酶，什么是同尾酶？型酶：分子量較大，反應(yīng)需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。 這類酶有特異的識(shí)別位

7、點(diǎn)但沒有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大；型酶（狹義的限制性內(nèi)切酶）：分子量較?。?05 Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需Mg2+的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。 許多型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重組。（1）基本特點(diǎn)在DNA雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。兩個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片斷，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。（2）識(shí)別順序和酶切位點(diǎn) 識(shí)別-8個(gè)相連的核苷酸

8、 對(duì)稱性 限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是5-P和3-OH （3）末端種類 3-端突起，個(gè)數(shù)為2或4個(gè)核苷酸 5-端突起，個(gè)數(shù)為2或4個(gè)核苷酸 平齊末端 非互補(bǔ)的粘性末端，切點(diǎn)在識(shí)別順序之外的型酶：這類酶可識(shí)別特定堿基順序，并在這一順序的3端2426bp處切開DNA，所以它的切割位點(diǎn)也是沒有特異性的。同裂酶：定義：能識(shí)別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶特點(diǎn)： 識(shí)別相同順序，切割形成相同的末端 同尾酶：來源各異，識(shí)別的靶序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端2、說明有哪些因素會(huì)影響內(nèi)切酶活力的？什么是星號(hào)活力？1）DNA的純度:污染的蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高濃度的鹽

9、離子等都有可能抑制核酸內(nèi)切酶活力。（2）DNA的甲基化程：基因克隆中采用失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。（3）酶切消化的反應(yīng)溫度大多數(shù)核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)溫度在37，有些酶例外。（4）DNA的分子結(jié)構(gòu)：DNA分子的不同結(jié)構(gòu)對(duì)核酸內(nèi)切酶的活性有很大影響（5）核酸內(nèi)切酶的緩沖液（-20保存）主要成分： 氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀，Tris-HCl，-巰基乙醇，二硫蘇糖醇（DTT）Mg2：酶發(fā)揮活性必需，不正確的Mg2和NaCl會(huì)影響對(duì)特異序列的識(shí)別。Tris-HCl：保證酶反應(yīng)的pH，一般在pH 7.4條件下功能最佳巰基乙醇：保持某些酶的穩(wěn)定性；甘油的影響（星號(hào)活性）例：EcoR在正常情況下識(shí)別

10、GAATTC，但是如果甘油濃度超過5（V/V），識(shí)別序列發(fā)生變化，可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割。3、試舉例說明什么是同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法？見書上圖。4、什么是Klenow片段，如何進(jìn)行DNA末端標(biāo)記？Klenow片段:由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來的分子量為76×103dal的大片段分子。仍具有53的聚合酶活性和35 的外切酶活性，失去了全酶的53外切酶活性。 具有 3隱蔽末端的帶標(biāo)記得的DNA片斷 5GATCT3 3 A5 在反應(yīng)物中加入Klenow聚合酶-32p-dGTP，一道溫育后生成： 5GATCT3 3 *GA5

11、 或是同時(shí)加入-32p-dATP dGTP 5GATCT3 3 *AGA55、T4 DNA取代合成法標(biāo)記DNA的方法n 在反應(yīng)過程中，通過T4 DNA聚合作用，反應(yīng)物中的-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片段上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。n 3外切酶活力可以切割ds DNA和ss DNA，ds DNA>ss DNA，要控制降解時(shí)間。（圖見書上）6、反轉(zhuǎn)錄酶的作用方式n 鏈具有聚合酶活性和RNase H活性n 鏈具有以RNA-DNA雜交分子為底物的53脫氧核酸外切酶活性7、T7 DNA聚合酶的特點(diǎn)n 1978年，S. Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細(xì)胞中

12、純化出來的一種核酸酶。n 加工形式的T7 DNA聚合酶系：T7噬菌體編碼的基因5蛋白質(zhì)，另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白。n 基因5蛋白質(zhì)：具有聚合酶活性和35外切酶活性；硫氧還蛋白：增強(qiáng)基因5蛋白質(zhì)與模板引物的結(jié)合力n 具有53的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3 5核酸外切酶活性。8、DNA末端轉(zhuǎn)移酶的特點(diǎn)n 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)，在二甲胂酸緩沖液中，能催化脫氧核苷三磷酸進(jìn)行53方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3-OH末端。n 不需要模板，可以用含有的3-OH DNA片段為引物，在3-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。 n 它

13、作用的底物可以是具有3-OH末端的單鏈DNA，也可以是具有3-OH突出末端的雙鏈DNA，平末端不是有效底物，如果用Co代替Mg做為輔助因子，可以成為有效底物。 9、堿性磷酸酶的作用n 來自于大腸桿菌或小牛腸，該酶用于脫去DNA（RNA）5末端的磷酸基團(tuán)，使5-P成為5-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。 10、T4多核苷酸激酶特點(diǎn)T4多核苷酸激酶：由T4噬菌體的pseT基因編碼的一種蛋白質(zhì)，最初從T4噬菌體感染的E. coli中分離出來。n 作用：催化-磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA或者RNA的末端，不受底物分子鏈的

14、長短限制。n 正向反應(yīng)（forward reaction）堿性磷酸酶處理DNA的5端使其脫磷酸暴露出5-OH，多核苷酸激酶將-32P-ATP的-32P轉(zhuǎn)移到5-OH，實(shí)現(xiàn)末端標(biāo)記。11、簡述一種核酸內(nèi)切酶和一種核酸外切酶的作用特點(diǎn)外切酶III（Exo III）ds DNA1、一般特點(diǎn)： 來自于E.coli，分子量28,000 kD 2、催化反應(yīng)類型 （1）外切酶活性：35，產(chǎn)生5-單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 , 外切酶活性特點(diǎn) 反應(yīng)底物：互補(bǔ)ds-DNA 堿基釋放速度：C>>AT>>G 反應(yīng)產(chǎn)物：5-單磷酸核苷和具缺口或5-端突起的d

15、s-DNA，過渡反應(yīng)將導(dǎo)致DNA降解（2）核酸酶H活性：除去DNA-RNA雜交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5（3）3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反應(yīng)，pH 6.8-7.4 （4）內(nèi)切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將DNA鍵切開，pH 7.6-8.5 內(nèi)切酶見第一題。第4章 基因克隆的質(zhì)粒載體1. 什么是載體（vector）？答：載體（vector）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的DNA分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實(shí)驗(yàn)手段可使其它的DNA片段連接在它的上面，進(jìn)行復(fù)制。2、 作為基因工程的載體，必須具備哪些性能？質(zhì)粒載體必須具備的基本條件是什么？答：作為基因工程

16、的載體，必須具備以下性能：1、分子較小，可攜帶比較大的DNA片段。 2、能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。 3、要有盡可能多種限制酶的 切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn) multiple cloning sites，MCS） 。 4、有適合的標(biāo)記，易于選擇。 5、有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。 6、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件是： 1、具有至少一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)； 2、具有抗菌素抗性，以便為寄主細(xì)胞提供易于檢測的表型性狀做為選擇信號(hào)，而且在有關(guān)的

17、限制酶位點(diǎn)上插入外源DNA后形成的質(zhì)粒有一個(gè)選擇標(biāo)記； 3、具有若干限制酶切單一位點(diǎn)（MCS）； 4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)，低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷后（不超過15kb）仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因。3、 氯化銫密度梯度離心的原理是什么？答：1、質(zhì)粒DNA占總DNA的1%2%； 2、在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB-DNA復(fù)合物中，E

18、B含量越高，密度會(huì)越低。3、 堿裂解法的原理是什么？解釋其中相關(guān)試劑的作用？答：堿裂解法的原理： 1、共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷在拓?fù)鋵W(xué)上存在差異； 2、pH值在12.012.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性； 3、在冷卻或恢復(fù)中性pH值使DNA復(fù)性的過程中，線性染色體會(huì)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心法去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，用乙醇沉淀，便可以獲得質(zhì)粒DNA。相關(guān)試劑的作用： 葡萄糖：有利于PH的調(diào)節(jié)。 T ris-HCl ：緩沖液，調(diào)節(jié)PH。 EDTA：二價(jià)金屬離子的少量存在，抑制核酸酶的活性

19、，從而保護(hù)質(zhì)粒DNA免被降解。 NaOH：提供高的PH環(huán)境，使線性缺口的質(zhì)粒DNA和線性的染色體DNA片段被選擇性地變性。 SDS：使細(xì)胞裂解，釋放出質(zhì)粒及染色體的DNA。 醋酸鈉：降低反應(yīng)混合物的PH值，起到了中和作用，使現(xiàn)行的質(zhì)粒及染色體DNA復(fù)性，并聚集成不可溶的網(wǎng)絡(luò)聚合物；同時(shí)，高濃度的醋酸鈉亦會(huì)引起蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和高分子量的RNA分子發(fā)生沉淀。 苯酚：抽提去除蛋白質(zhì)污染物。 乙醇：沉淀并收集質(zhì)粒DNA。5、表達(dá)型的質(zhì)粒載體有什么特點(diǎn)？體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體和穿梭質(zhì)粒載體各有什么特點(diǎn)？答：表達(dá)性的質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：待表達(dá)的真核基因編碼序列被克隆在緊挨于啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)上，

20、而且必須是其編碼的蛋白質(zhì)氨基末端這一頭靠近啟動(dòng)子方向插入，才能在啟動(dòng)子控制下進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：在pUC質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，有來自噬菌體的啟動(dòng)子，即T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子，為RNA聚合酶的附著作用提供特異的識(shí)別位點(diǎn)。穿梭質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，可在兩種不同的寄主細(xì)胞存活和復(fù)制。6、ColE 1質(zhì)粒載體有什么特點(diǎn)？答：ColE 1質(zhì)粒載體的特點(diǎn)如下：多拷貝的質(zhì)粒，能產(chǎn)生細(xì)菌素，但含有對(duì)細(xì)菌素的免疫基因，在其分子結(jié)構(gòu)上對(duì)核酸內(nèi)切限制酶EcoR I也只存在有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，這種質(zhì)粒除了編碼有大腸桿菌E1基因之外，為了其自身存活的需要，還編碼有使寄主

21、細(xì)胞具有對(duì)大腸桿菌素E1免疫性的基因。7、pBR322質(zhì)粒載體有什么特點(diǎn)？答：pBR322質(zhì)粒載體的特點(diǎn)如下：（1）具有較小的分子量：它的分子量為4363bp?？寺≥d體的分子量大小不要超過10kb。（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。（pBR322 DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)。）（3）具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累1000300

22、0個(gè)拷貝。8、pUC質(zhì)粒載體有什么特點(diǎn)？答：pUC質(zhì)粒載體的特點(diǎn)如下：第一：具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù)： 僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變?cè)斐闪嘶騬op的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞500700個(gè)拷貝。第二：適用于組織化學(xué)檢測重組體： 具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補(bǔ)作用，用X-gal顯色對(duì)重組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。（補(bǔ)充：藍(lán)白篩選：lacZ基因編碼-半乳糖苷酶的肽鏈，即其N端，可以與宿主細(xì)胞中的C端互補(bǔ)形成完整的-半乳糖苷酶互

23、補(bǔ)作用，-半乳糖苷酶可以在X-gal和IPTG的作用下產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，形成藍(lán)色菌落）第三：具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。第五章 噬菌體載體和柯斯載體一、舉例說明噬菌體載體的載體類型。其中cos位點(diǎn)的作用是什么？ 噬菌體載體的主要類型1、插入式載體n 一種只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)的 派生載體。只能插入較小分子量的外源（10kb），廣泛用于cDNA及小片段DNA的克隆n cI基因插入失活 如gt10、NM1149等載體，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶源化，產(chǎn)生

24、清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。 n Lac Z基因插入失活：如charon16A，gt 11載體，在非必需區(qū)段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR位點(diǎn)，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。2、替換型載體（取代型載體）n 具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。可以克隆較大分子量的外源，克隆高等真核生物DNAn Charon 4A載體是用Lac 5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時(shí)將Lac 5作為選擇標(biāo)記.使用時(shí)用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組、包裝。而后

25、，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑n NM781:在NM781替換型載體中，可取代的EcoR片段，編碼有一個(gè)supE基因（大腸桿菌突變體tRNA基因），這種NM781噬菌體感染細(xì)胞后，寄主細(xì)胞lacZ基因的琥珀突變被抑制，因此能在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍(lán)色的噬菌斑。如果這個(gè)具有supE基因的EcoR片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述指示培養(yǎng)基上只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑3.凱倫噬菌體載體 在噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，既有插入型又有替換型；在基因工程實(shí)驗(yàn)中的用途十分廣泛 承受外源DNA的能力：幾個(gè)kb到23kb cos位點(diǎn)的兩個(gè)作用：(

26、1)使進(jìn)入細(xì)菌的DNA分子成為環(huán)狀 ，這是插入細(xì)菌基因組的先決條件。(2)作為識(shí)別位點(diǎn)，由內(nèi)切酶將滾環(huán)復(fù)制的多聯(lián)體DNA切開二、簡述重組體DNA的體外包裝過程，并說明可容納外源基因的大小？ 1.重組體DNA的體外包裝：在A蛋白（有終止復(fù)制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。在體外試管中完成上述反應(yīng)，利用D基因突變和E基因突變。n E基因琥珀突變（Eam）不能形成任何頭部，積累大量的尾部n D基因琥珀突變（Dam），重組體DNA不能進(jìn)入頭部，成熟作用在頭部前體階段被終止，因而它感染的宿主中有大量頭部前體蛋白積累。n 使用具有c857突變基因的噬菌體

27、的溶源大腸桿菌：BHB2690（Dam）和BHB2685（Eam）菌株培養(yǎng)獲得頭部和尾部n c857是溫度敏感性阻遏基因，32為溶源狀態(tài)，4445誘發(fā)，溶菌的S基因突變，因而不會(huì)溶菌。n 大量收集頭部尾部蛋白，在體外與重組DNA包裝2.由于噬菌體包裝時(shí)，當(dāng)DNA的長度短于野生型的75%或超過105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48KB）的75%105%左右的，要求載體DNA和外源DNA長度上限是51kb，必需基因?yàn)?8kb，外源極限在23kb。三. 柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)1、具有噬菌體的特性； 插入合適長度外源基因后，可以在體外被包裝成噬菌體，可以高效的感染大腸桿菌，進(jìn)

28、入細(xì)胞后環(huán)化，并且不形成子代噬菌體2、具有質(zhì)粒載體的特性； 含有質(zhì)粒復(fù)制子，進(jìn)入寄主后可以象質(zhì)粒一樣復(fù)制， 抗菌素抗性標(biāo)記可以進(jìn)行篩選 3、具有較高容量的克隆能力； 分子量較小，一般4-6kb，因此插入的載體上并且可以被成功包裝的外源可以達(dá)到45kb 最低極限，如果柯斯質(zhì)粒有5kb，外源必需要至少30kb 4、具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力 在同一個(gè)宿主中的柯斯質(zhì)粒和質(zhì)粒會(huì)形成共合體。 四. M13載體系列的優(yōu)點(diǎn)1、在這類載體的基因組中有一條飾變的-半乳糖苷酶基因片段（Hind片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位點(diǎn)的序列；2、M13載體系列是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對(duì)地構(gòu)建的，可有效地克隆

29、雙鏈DNA分子中的每一條鏈。 (1)具有多克隆位點(diǎn)(MCS)，方便克隆。 (2)許多M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的，在克隆位點(diǎn)選擇上更為方便。3、可以定向地克隆DNA片段 克隆在M13 RF DNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。所以如果要同時(shí)分離分子中的雙鏈，則需要兩種獨(dú)立的克隆。根據(jù)M13的生物學(xué)特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源克隆時(shí)的取向。這樣一來，為分別分離外源分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的一個(gè)行之有效的方法就是定向克隆技術(shù)五. 噬菌粒載體的特點(diǎn)n 具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；n 具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體幫助下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。輔助噬菌粒載體特點(diǎn)