構建系統(tǒng)進化樹的詳細步驟參考模板

1、構建系統(tǒng)進化樹的詳細步驟1. 建樹前的準備工作 1.1 相似序列的獲得BLAST BLAST是目前常用的數(shù)據(jù)庫搜索程序，它是Basic Local Alignment Search Tool的縮寫，意矚慫潤厲釤瘞睞櫪廡賴賃軔朧。為“基本局部相似性比對搜索工具”(Altschul et al.,199062;199763)。國際著名生物信息中心聞創(chuàng)溝燴鐺險愛氌譴凈禍測樅。都提供基于Web的BLAST服務器。BLAST算法的基本思路是首先找出檢測序列和目標序列之間相似性程度最高的片段，并作為內(nèi)核向兩端延伸，以找出盡可能長的相似序列片段。 首先登錄到提供BLAST服務的常用網(wǎng)站，比如國內(nèi)的CBI、美

2、國的NCBI、歐洲的EBI和日本的DDBJ。這些網(wǎng)站提供的BLAST服務在界面上差不多，但所用的程序有所差異。它們都有一個大的文本框，用于粘貼需要搜索的序列。把序列以FASTA格式(即第一行為說明行，以“”符號開始，后面是序列的名稱、說明等，其中“”是必需的，名稱及說明等可以是任意形式，換行之后是序列)粘貼到那個大的文本框，選擇合適的BLAST程序和數(shù)據(jù)庫，就可以開始搜索了。如果是DNA序列，一般選擇BLASTN搜索DNA數(shù)據(jù)庫。這里以NCBI為例。登錄NCBI主頁-點擊BLAST-點擊Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)-在Search文本框中粘貼檢測序列

3、-點擊BLAST!-點擊Format-得到result of BLAST。 殘騖樓諍錈瀨濟溆塹籟婭騍東。BLASTN結(jié)果如何分析(參數(shù)意義): gi|28171832|gb|AY155203.1| Nocardia sp. ATCC 49872 16S ribosomal RNA gene, complete 釅錒極額閉鎮(zhèn)檜豬訣錐顧葒鈀。sequence Score = 2020 bits (1019), Expect = 0.0 1 / 14Identities = 1382/1497 (92%), Gaps = 8/1497 (0%) Strand = Plus / Plus 彈貿(mào)攝爾霽斃

4、攬磚鹵廡詒爾膚。Query: 1 gacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagcggaaaggccctttcgggggt 60 謀蕎摶篋飆鐸懟類蔣薔點鉍雜。| | | Sbjct: 1 gacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagcggtaaggcccttc-ggggt 58 廈礴懇蹣駢時盡繼價騷巹癩龔。Query: 61 actcgagcggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctgccttcagctctgggataagc 120 煢楨廣鰳鯡選塊網(wǎng)羈淚鍍齊鈞。| | | | | Sbjct: 59 acac

5、gagcggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgcctcgtactctgggataagc 118 鵝婭盡損鵪慘歷蘢鴛賴縈詰聾。Score :指的是提交的序列和搜索出的序列之間的分值，越高說明越相似; Expect:比對的期望值。比對越好，expect越小,一般在核酸層次的比對，expect小于1e-10，籟叢媽羥為贍僨蟶練淨櫧撻曉。就比對很好了，多數(shù)情況下為0; Identities:提交的序列和參比序列的相似性，如上所指為1497個核苷酸中二者有1382個相同; Gaps:一般翻譯成空位，指的是對不上的堿基數(shù)目; Strand:鏈的方向，Plus / Minus意味著

6、提交的序列和參比序列是反向互補的，如果是Plus / 預頌圣鉉儐歲齦訝驊糴買闥齙。Plus則二者皆為正向。 1.2 序列格式:FASTA格式 由于EMBL和GenBank數(shù)據(jù)格式較為復雜，所以為了分析方便也出現(xiàn)了十分簡單的FASTA數(shù)據(jù)格式。FASTA格式又稱為Pearson格式，該種序列格式要求序列的標題行以大于號“”開頭，下一行起為具體的序列。一般建議每行的字符數(shù)不超過60或80個，以方便程序處理。多條核酸和蛋白質(zhì)序列格式即將該格式連續(xù)列出即可，如下所示:E.coli 1 aaattgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaggccta acac

7、atgcaa 滲釤嗆儼勻諤鱉調(diào)硯錦鋇絨鈔。61 gtcgaacggt aacaggaaga agcttgcttc tttgctgacg agtggcggac 鐃誅臥瀉噦圣騁貺頂廡縫勵羆。AY631071 Jiangella gansuensis YIM 002 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc ggaaaggccc tttcgggggt 擁締鳳襪備訊顎輪爛薔報贏無。61 actcgagcgg cgaacgggtg agtaacacgt gggtaacctg ccttcagctc tgggataagc 贓熱俁閫歲匱閶鄴鎵騷鯛漢鼉。 其中的

8、為Clustal X默認的序列輸入格式，必不可少。其后可以是種屬名稱，也可以是序列在Genbank中的登錄號(Accession No.)，自編號也可以，不過需要注意名字不能太長，一般由英文字母和數(shù)字組成，開首幾個字母最好不要相同，因為有時Clustal X程序只默認前幾位為該序列名稱。回車換行后是序列。將檢測序列和搜索到的同源序列以FASTA格式編輯成為一個文本文件(例:C:tempjc.txt)，即可導入Clustal X等程序進行比對建樹。 2. 構建系統(tǒng)樹的相關軟件和操作步驟 壇摶鄉(xiāng)囂懺蔞鍥鈴氈淚躋馱釣。構建進化樹的主要步驟是比對，建立取代模型，建立進化樹以及進化樹評估。鑒于以上對于構

9、建系統(tǒng)樹的評價，結(jié)合本實驗室實際情況，以下主要介紹N-J Tree構建的相關軟件和操作步驟。 蠟變黲癟報倀鉉錨鈰贅籜葦繯。2.1 用Clustal X構建N-J系統(tǒng)樹的過程 (1) 打開Clustal X程序，載入源文件. File-Load sequences- C:tempjc.txt. (2) 序列比對 Alignment - Output format options - ? Clustal format; CLUSTALW sequence numbers: ON 買鯛鴯譖曇膚遙閆擷凄屆嬌擻。Alignment - Do complete alignment (Output Guid

10、e Tree file, C:tempjc.dnd;Output Alignment file, C:tempjc.aln;) Align ? waiting 綾鏑鯛駕櫬鶘蹤韋轔糴飆鈧麥。等待時間與序列長度、數(shù)量以及計算機配置有關。 (3) 掐頭去尾 File-Save Sequence as Format: ? CLUSTAL GDE output case: Lower CLUSTALW sequence numbers: ON Save from residue: 39 to 1504 (以前后最短序列為準) Save sequence as: C:tempjc-a.aln OK 將開始

11、和末尾處長短不同的序列剪切整齊。這里，因為測序引物不盡相同，所以比對后序列參差不齊。一般來說，要“掐頭去尾”，以避免因序列前后參差不齊而增加序列間的差異。剪切后的文件存為ALN格式。 驅(qū)躓髏彥浹綏譎飴憂錦諑瓊針。(4) File-Load sequences-Replace existing sequences?-Yes- C:tempjc-a.aln 貓蠆驢繪燈鮒誅髏貺廡獻鵬縮。重新載入剪切后的序列。 (5) Trees-Output Format Options Output Files : ? CLUSTAL format tree ? Phylip format tree ? Phyl

12、ip distance matrix Bootstrap labels on: NODE 鍬籟饗逕瑣筆襖鷗婭薔嗚訝擯。CLOSE Trees-Exclude positions with gaps Trees-Bootstrap N-J Tree :構氽頑黌碩飩薺齦話騖門戲鷯。Random number generator seed(1-1000) : 111 Number of bootstrap trails(1-1000): 1000 SAVE CLUSTAL TREE AS: C:tempjc-a.njb SAVE PHYLIP TREE AS: C:tempjc-a.njbphb O

13、K ? waiting 輒嶧陽檉籪癤網(wǎng)儂號澩蠐鑭釃。等待時間與序列長度、數(shù)量以及計算機配置有關。在此過程中，生成進化樹文件*.njbphb，可以用TreeView打開查看。 堯側(cè)閆繭絳闕絢勵蜆贅瀝紕縭。(6) Trees-Draw N-J Trees SAVE CLUSTAL TREE AS: C:tempjc-a.nj SAVE PHYLIP TREE AS: C:tempjc-a.njph SAVE DISTANCE MATRIX AS: C:tempjc-a.njphdst OK 識饒鎂錕縊灩筧嚌儼淒儂減攙。此過程中生成的報告文件*.nj比較有用，里面列出了比對序列兩兩之間的相似度，以及

14、轉(zhuǎn)換和顛換分別各占多少。 凍鈹鋨勞臘鍇癇婦脛糴鈹賄鶚。(7) TreeView File-Open-C:tempjc-a.njbphb Tree- phylogram(unrooted, slanted cladogram，Rectangular cladogram多種樹型) Tree- Show internal edge labels (Bootstrap value)(顯示數(shù)值) 恥諤銪滅縈歡煬鞏鶩錦聰櫻鄶。Tree- Define outgroup ? ingroup outgroup ? OK(定義外群) 鯊腎鑰詘褳鉀溈懼統(tǒng)庫搖飭緡。Tree- Root with outgroup

15、通常需要對進化樹進行編輯，這時首先要Edit-Copy至PowerPoint上，然后Copy至Word上，再進行圖片編輯。如果直接Copy至Word則顯示亂碼，而進化樹不能正確顯示。 2.2 Mega建樹 碩癘鄴頏謅攆檸攜驤蘞鷥膠據(jù)。雖然Clustal X可以構建系統(tǒng)樹，但是結(jié)果比較粗放，現(xiàn)在一般很少用它構樹，Mega因為操作簡單，結(jié)果美觀，很多研究者選擇用它來建樹。 閿擻輳嬪諫遷擇楨秘騖輛塤鵜。(1) 首先用Clustal X進行序列比對，剪切后生成C:tempjc-a.aln文件;(同上) (2) 打開BioEdit程序，將目標文件格式轉(zhuǎn)化為FASTA格式， 氬嚕躑竄貿(mào)懇彈瀘頷澩紛釓鄧。F

16、ile-Open- C:tempjc-a.aln， File-Save As- C:temp jc-b.fas; (3) 打開Mega程序，轉(zhuǎn)化為mega格式并激活目標文件， File-Convert To MEGA Format- C:temp jc-b.fas ? C:temp jc-b.meg， 釷鵒資贏車贖孫滅獅贅慶獷緞。關閉Text Editor窗口-(Do you want to save your changes before closing?-Yes); Click me to activate a data file- C:tempjc-b.meg-OK- 慫闡譜鯪逕導嘯畫長

17、涼馴鴇撟。(Protein-coding nucleotide sequence data?-No); Phylogeny-Neighbor-Joining(NJ) Distance Options-Models-Nucleotide: Kimura 2-parameter; 諺辭調(diào)擔鈧諂動禪瀉類謹覡鸞。?d: Transitions+Transversions; Include Sites-?Pairwise Deletion Test of Phylogeny-?Bootstrap; Replications 1000; Random Seed 64238 嘰覲詿縲鐋囁偽純鉿錈癱懇跡。OK

18、;開始計算,得到結(jié)果; (4) Image-Copy to Clipboard-粘貼至Word文檔進行編輯。 此外，Subtree中提供了多個命令可以對生成的進化樹進行編輯，Mega窗口左側(cè)提供了很多快捷鍵方便使用;View中則給出了多個樹型的模式。下面只介紹幾種最常用的: Subtree-Swap:任意相鄰兩個分支互換位置;熒紿譏鉦鏌觶鷹緇機庫圓鍰緘。-Flip:所選分支翻轉(zhuǎn)180度; -Compress/Expand:合并/展開多個分支; -Root:定義外群; View-Topology:只顯示樹的拓撲結(jié)構; -Tree/Branch Style:多種樹型轉(zhuǎn)換; -Options:關于樹

19、的諸多方面的改動。 2.3 TREECON 打開Clustal X，F(xiàn)ile-Load sequences-jc-a.aln，F(xiàn)ile-Save Sequence as(Format-PHYLIP;Save from residue-1 to 末尾;Save sequence as : C:tempjc.phy); 鶼漬螻偉閱劍鯫腎邏蘞闋簣擇。打開TREECON程序， (1) Distance estimation 點擊Distance estimation-Start distance estimation，打開上面保存的jc.phy文件，Sequence Type-Nuleic Acid

20、Sequence，Sequence format-PHYLIP interleaved，Select ALL，OK; Distance Estimation-Jukes&Cantor(or Kimura)，Alignment positions-All，Bootstrap analysis-Yes，Insertions&Deletions-Not taken into account，OK; 紂憂蔣氳頑薟驅(qū)藥憫騖覲僨鴛。Bootstrap samples-1000，OK;運算，等待 Finished-OK。 (2) Infer tree topology 點擊Infer tree topolo

21、gy-Start inferring tree topology，Method-Neighbor-joining, Bootstrap 穎芻莖蛺餑億頓裊賠瀧漲負這。analysis-Yes，OK.;運算，等待 Finished-OK。 (3) Root unrooted trees 點擊Root unrooted trees-Start rooting unrooted trees，Outgroup opition-single sequence(forced)，Bootstrap analysis-Yes，OK; 濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻減棲綜。Select Root-X89947，OK;運算，

22、等待 Finished-OK。 (4) Draw phylogenetic tree 點擊Draw phylogenetic tree，F(xiàn)ile-Open-(new) tree，Show-Bootstrap values/ Distance scale。 File-Copy，粘貼至Word文檔，編輯。 銚銻縵嚌鰻鴻鋟謎諏涼鏗穎報。TREECON的操作過程看起來似乎較MEGA煩瑣，且運算速度明顯不及MEGA，如果參數(shù)選擇一樣，用它構建出來的系統(tǒng)樹幾乎和MEGA構建的完全一樣，只在細節(jié)上，比如Bootstrap值二者在某些分支稍有不同。在參數(shù)選擇方面，TREECON和MEGA也有些不同，但總體上相

23、差不大。 擠貼綬電麥結(jié)鈺贖嘵類羋罷鴇。2.4 PHYLIP PHYLIP是多個軟件的壓縮包，下載后雙擊則自動解壓。當你解壓后就會發(fā)現(xiàn)PHYLIP的功能極其強大，主要包括五個方面的功能軟件:i，DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)的分析軟件。ii，序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成距離數(shù)據(jù)后，對距離數(shù)據(jù)分析的軟件。 iii，對基因頻率和連續(xù)的元素分析的軟件。iv，把序列的每個堿基/氨基酸獨立看待(堿基/氨基酸只有0和1的狀態(tài))時，對序列進行分析的軟件。v，按照DOLLO簡約性算法對序列進行分析的軟件。vi，繪制和修改進化樹的軟件。在此，主要對DNA序列分析和構建系統(tǒng)樹的功能軟件進行說明。 (1) 生成PHY格式文件 賠荊紳諮侖驟

24、遼輩襪錈極嚕辮。首先用Clustal X等軟件打開剪切后的序列文件C:tempjc-a.aln另存為C:tempjc.phy(使用File-Save Sequences As命令，F(xiàn)ormat項選“PHY”)。用BioEdit或記事本打開(2) 打開Phylip軟件包里的SEQBOOT塤礙籟饈決穩(wěn)賽釙冊庫麩適緄。seqboot.exe: cant find input file infile Please enter a new file name C:tempjc.phy 按路徑輸入剛才生成的 *.PHY文件，顯示如下: 裊樣祕廬廂顫諺鍘羋藺遞燦擾。Bootstrapping algorit

25、hm, version 3.6a3 Settings for this run: D Sequence, Morph, Rest., Gene Freqs? Molecular sequences J Bootstrap, Jackknife, Permute, Rewrite? Bootstrap B Block size for block-bootstrapping? 1 R How many replicates? 100 倉嫗盤紲囑瓏詁鍬齊驁絛鯛鱧。W Read weights of characters? No C Read categories of sites? No F Wr

26、ite out data sets or just weights? Data sets I Input sequences interleaved? Yes 綻萬璉轆娛閬蟶鬮綰瀧恒蟬轅。0 Terminal type none 1 Print out the data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes Y to accept these of type the letter for one to change 驍顧燁鶚巰瀆蕪領鱺賻驃弒綈。R Number of replicates? 1000 0 Se

27、ttings for this run: D Sequence, Morph, Rest., Gene Freqs? Molecular sequences J Bootstrap, Jackknife, Permute, Rewrite? Bootstrap B Block size for block-bootstrapping? 1 R How many replicates? 1000 瑣釙濺曖惲錕縞馭篩涼貿(mào)錒戧。W Read weights of characters? No C Read categories of sites? No F Write out data sets o

28、r just weights? Data sets I Input sequences interleaved? Yes 鎦詩涇艷損樓紲鯗餳類礙穡鰳。0 Terminal type IBM PC 1 Print out the data at start of run No 櫛緶歐鋤棗鈕種鵑瑤錟奧傴輥。2 Print indications of progress of run Yes Y to accept these of type the letter for one to change 轡燁棟剛殮攬瑤麗鬮應頁諳絞。Y Random number seed (must be odd)?

29、5(any odd number)completed replicate number 100 completed replicate number 200 completed replicate number 300 completed replicate number 400 completed replicate number 500 completed replicate number 600 completed replicate number 700 completed replicate number 800 completed replicate number 900 comp

30、leted replicate number 1000 上面的D、J、R、I、O、1、2代表可選擇的選項，鍵入這些字母后敲回車鍵，程序的條件就會發(fā)生改變。D選項無須改變。J選項有三種條件可以選擇，分別是Bootstrap、Jackknife和Permute。R選項讓使用者輸入republicate的數(shù)目。所謂republicate就是用Bootstrap法生成的一個多序列組。根據(jù)多序列中所含的序列的數(shù)目的不同可以選取不同的republicate。當我們設置好條件后，鍵入Y按回車。得到一個文件outfile:C:Program FilesPhylipexe outfile. 峴揚斕滾澗輻灄興渙藺

31、詐機憒。重命名outfile?infile。 (3) 打開dnadist.exe Nucleic acid sequence Distance Matrix program, version 3.6a3 詩叁撻訥燼憂毀厲鋨驁靈韜鰍。Settings for this run: D Distance ? F84 G Gamma distributed rates across sites? No T Transition/transversion ratio? 2.0 C One category of substitution rates? Yes W Use weights for site

32、s? No 則鯤愜韋瘓賈暉園棟瀧華縉輅。F Use emperical base frequencies? Yes L Form of distance matrix? Square 脹鏝彈奧秘孫戶孿釔賻鏘詠繞。M Analyze multiple data sets? No I Input sequences interleaved? Yes 0 Terminal type ? 1 Print out the data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes 鰓躋峽禱紉誦幫廢掃減萵輳慘。Y to accept

33、 these of type the letter for one to change 稟虛嬪賑維嚌妝擴踴糶欏灣鯧。d D Distance ? Kimura 2-parameter m Multiple data sets or multiple weighs? (type D or W) d 陽簍埡鮭罷規(guī)嗚舊巋錟麗鮑軫。How many data sets? 1000 0Settings for this run: D Distance ? Kimura 2-parameter G Gamma distributed rates across sites? No T Transition/

34、transversion ratio? 2.0 溈氣嘮戇萇鑿鑿櫧諤應釵藹紼。C One category of substitution rates? Yes W Use weights for sites? No 鋇嵐縣緱虜榮產(chǎn)濤團藺締崳惲。F Use emperical base frequencies? Yes L Form of distance matrix? Square M Analyze multiple data sets? Yes, 1000 data sets I Input sequences interleaved? Yes 懨俠劑鈍觸樂鷴燼觶騮揚銥鯊。0 Termi

35、nal type ? IBM PC 1 Print out the data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes 謾飽兗爭詣繚鮐癩別瀘鯽礎輪。Y to accept these of type the letter for one to change 咼鉉們歟謙鴣餃競蕩賺趲為練。Y 選項D有四種距離模式可以選擇，分別是Kimura 2-parameter、Jin/Nei、Maximum-likelihood和Jukes-Cantor。選項T一般鍵入一個1.5-3.0之間的數(shù)字。選項M鍵入1000。運行后生成

36、文件C:Program FilesPhylipexe outfile。 瑩諧齷蘄賞組靄縐嚴減籩諏戀。重命名outfile?infile。 (4) 打開 neighbor.exe Neighbor-Joining/UPGMA method version 3.6a3 Settings for this run: N Neighbor-Joining or UPGMA tree? Neighbor-Joining O Outgroup root? No, Use as outgroup species 1 L Lower-triangular data metrix? No 麩肅鵬鏇轎騍鐐縛縟糶爾

37、攤鱘。R Upper-triangular data metrix? No S Subreplication? No J Randomize input order of species? No, Use input order M Analyze multiple data sets? No 納疇鰻吶鄖禎銣膩鰲錟顫階躦。0 Terminal type ? 1 Print out the data at start of run No 2 Print indications of progress of run Yes 3 Print out tree Yes 風攆鮪貓鐵頻鈣薊糾廟誑繃紙。4

38、Write out trees onto tree file? Yes Y to accept these of type the letter for one to change 滅噯駭諗鋅獵輛覯餿藹猙廚憮。m How many data sets? 1000 Random number seed (must be odd)?5 Settings for this run: N Neighbor-Joining or UPGMA tree? Neighbor-Joining O Outgroup root? No, Use as outgroup species 1 L Lower-triangular data metrix? No 鐒鸝餉飾鐔閌貲諢癱騮吶轉(zhuǎn)鮭。R Upper-triangular data metrix? No S S