藥用植物梔子的組織培養(yǎng)

1、植物學報 Chinese Bulletin of Botany 2021, 49 (3): 331336, HYPERLINK :/ chinbullbotany / chinbullbotany doi: 10.3724/SP.J.1259.2021.00331技術方法藥用植物梔子的組織培養(yǎng)張慶紅1, 湯麗云2, 司徒少金3, 王莎3, 何國振1*1廣州中醫(yī)藥大學中藥學院, 廣州 510006; 2華南農業(yè)大學生命科學學院, 廣州 5106423廣州白云山明興制藥, 廣州 510250摘要 梔子(Gardenia jasminoides)為藥用木本植物。以梔子果皮、種子團和種子為外植體, 研

2、究不同激素配比及不同培養(yǎng) 方式對愈傷組織誘導和芽分化的影響。研究結果說明, 培養(yǎng)基成分為MS+0.5 mgL12,4-D+0.25 mgL16-BA較適宜果皮和 種子愈傷組織的誘導, 誘導率分別為83.3%和88.5%; 培養(yǎng)基成分為MS+1.0 mgL12,4-D+1.0 mgL16-BA較適宜種子團愈 傷組織的誘導, 誘導率為78.1%。3種外植體誘導的愈傷組織中, 只有種子愈傷組織能通過液體培養(yǎng)分化出芽; TDZ對芽分化 有明顯的促進作用; 最正確的芽分化培養(yǎng)基為MS+0.05 mgL1NAA+0.10 mgL1TDZ, 其愈傷組織分化率為8.75%。該研究以 梔子種子為外植體, 并獲得

3、了再生植株, 為藥用植物梔子轉基因體系的建立奠定了根底。關鍵詞 愈傷組織, 梔子, 液體培養(yǎng), 再生, 組織培養(yǎng)張慶紅, 湯麗云, 司徒少金, 王莎, 何國振 (2021). 藥用植物梔子的組織培養(yǎng). 植物學報 49, 331336.梔子 (Gardenia jasminoides) 為茜 草科 (Rubia- ceae)常綠灌木, 其枯燥成熟果實具有瀉火除煩、清熱 利尿和涼血解毒等成效(國家藥典委員會, 2021), 是?中華人民共和國藥典?(2021版)(第1部)收錄的臨床 常用中藥材, 也是生產清開靈和安宮牛黃丸等33種 中成藥的重要原料。梔子的活性成分包括梔子苷、西 紅花苷(也是天然色

4、素梔子黃色素的主要成分)和綠原 酸等。培養(yǎng)植物細胞可以獲得次級代謝產物, 滿足人 們日益增長的對中藥材的需求, 且能有效地保護自然 資源和生態(tài)環(huán)境(袁曉凡等, 2005)。然而, 培養(yǎng)的細胞 來源不同, 獲得的次級代謝產物的種類和含量也不一 樣。選擇目的次級代謝產物含量高的植物組織作培養(yǎng) 材料往往可獲得高含量的目的次級代謝產物(姚文兵, 2021)。梔子全果實、種子及果皮中梔子苷和西紅花 苷的含量較高(蔣珍藕, 1995; 王春芳和魯靜, 1997), 以這些器官為外植體進行細胞培養(yǎng), 有可能獲得高含 量的活性成分。迄今為止, 有關梔子組織培養(yǎng)的報道 大致可分為3類: 第1類是以梔子帶腋芽莖段

5、為外植 體, 直接增殖芽獲得無菌苗(George et al., 1993; 馬 文景和米受恩 , 1993; 陸斐等 , 2000; 王育選等, 2021); 第2類是以胚軸、胚根、子葉、花苞、未成熟 果實及成熟果實為外植體, 誘導產生愈傷組織, 未見收稿日期: 2021-05-31; 接受日期: 2021-10-15基金工程: “重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(No.2021ZX09401-404)* 通訊作者。E-mail: HYPERLINK mailto:heguozhenyahoo heguozhenyahoo 對再生植株的研究(鐘青萍等, 1994); 第3類以葉片為 外植體, 誘導愈

6、傷組織并獲得再生植株(Al-Juboory et al., 1998; 肖瀟等, 2005)。本研究以未成熟的果皮、 種子團(由胎座和未成熟種子組成)和種子為外植體, 成功地誘導出愈傷組織, 并從來源于種子的愈傷組織 中分化出芽, 誘導生根, 獲得了再生植株。1植物材料梔子(Gardenia jasminoides Ellis)采自廣東省梅州市 平遠縣中藥材生產基地。將開花后3個月的青色未成 熟新鮮梔子果實分割為果皮、種子團和種子3局部, 用自來水沖洗, 直至色素沖洗干凈(23小時)。在超凈 工作臺上將3種外植體放入70%乙醇中浸泡30秒, 再 用0.1%HgCl2浸泡9分鐘, 之后用無菌水沖

7、洗56次, 轉移至消毒后的無菌濾紙上, 吸干外表水分備用。2培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件2.1培養(yǎng)基成分以MS培養(yǎng)基為根本培養(yǎng)基, 附加濃度為30 gL1的蔗 糖, pH5.86.0。各種培養(yǎng)基是在根本培養(yǎng)基中分別添332 植物學報 49(3) 2021加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)、-萘乙酸(-naphthalene acetic acid, NAA)、 6- 芐 基腺嘌 呤 (6-benzyladenine, 6-BA) 和 N- 苯基 - N-1,2,3-噻二唑-5-脲(N-phenyl-N-1,2,3-thidiazol-5

8、- ylurea, TDZ)等(表1, 表2)。其中, 2,4-D、NAA和6-BA 購自上海阿拉丁化學; TDZ購自上海源聚生 物科技。固體培養(yǎng)基含瓊脂(7.5 gL1), 液體 培養(yǎng)基不含瓊脂。2.2愈傷組織的誘導在無菌條件下將消毒的果皮和種子團切成大小約5 mm 5 mm的小塊; 從種子團中挑出飽滿、白色且大 小約12 mm的未成熟種子, 剝去種皮, 隨機切成2 塊。將3種外植體分別接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中 (表1), 果皮和種子團每瓶接種1塊, 種子每瓶接種5 塊。每種材料各接種20瓶。重復3次。在溫度(252)C、相對濕度40%60%的條件下進行暗培養(yǎng)。30天 后, 篩選出淺黃綠色

9、的愈傷組織, 繼代培養(yǎng)3次, 獲得適合液體培養(yǎng)的淺黃綠色疏松的愈傷組織。2.3 愈傷組織的分化將繼代培養(yǎng)得到的愈傷組織塊接種到液體培養(yǎng)基中 (表2), 培養(yǎng)30天。液體培養(yǎng)條件: 溫度(252)C, 光 周期為13小時光照/11小時黑暗, 光照強度為(20.14.0) molm2s1, 轉速為100 rmin1。2.4 芽的增殖液體培養(yǎng)30天后, 將帶芽愈傷組織塊轉移至芽增殖 培養(yǎng)基中進行固體培養(yǎng)。每瓶接種4塊, 30天繼代1次。 芽增殖培養(yǎng)基為MS+0.05 mgL1NAA+2.0 mgL16- BA。2.5 生根培養(yǎng)將長12 cm的芽從基部切下, 轉接至生根培養(yǎng)基 (MS+0.5 mgL1

10、NAA+2.0 mgL16-BA)中誘導生根。 培養(yǎng)條件: 溫度(252)C, 相對濕度40%60%, 光照表1 不同植物生長調節(jié)劑組合對3種外植體愈傷組織誘導的影響Table 1 Effects of different plant growth regulator combinations on the callus induction from three kinds of explantsMedium2,4-D6-BAPericarpPlacentawith seedsSeed(mgL1)(mgL1)CallusInitial time ofCallusInitial time ofC

11、allusInitial timeinductioncallusinductioncallusinductionof callusrate (%)formation (d)rate (%)formation (d)rate (%)formation (d)MS-A0.50.2583.3912088.51015MS-B1.00.552.51015082.51015MS-C0.750.538.5101520.0172552.91420MS-D1.01.018.6121778.1152043.41420MS-E1.51.5019.120255.51720表2 不同植物生長調節(jié)劑組合對種子愈傷組織芽分

12、化的影響Table 2 Effects of different plant growth regulator combinations on the bud differentiation from seed-derived calliMediumPlant growth regulator concentration (mgL1)Number ofNumber of calliCallus differentiationNAATDZ6-BAcallidifferentiatedrate (%)Y-A0.050.058022.50Y-B0.050.108078.75Y-C0.050.1580

13、33.75Y-D0.058022.50Y-E0.050.58000.00Y-F0.051.08000.00Y-G0.052.08022.50張慶紅等: 藥用植物梔子的組織培養(yǎng) 333強度(33.60.7) molm2s1。2.6 結果統(tǒng)計2.6.1愈傷組織誘導率 分別在外植體培養(yǎng)第10、20、30和40天觀察愈傷組 織的誘導情況, 并統(tǒng)計誘導率(誘導率=(出愈外植體 數(shù)/接種外植體總數(shù))100%)。2.6.2愈傷組織分化率 于液體培養(yǎng)30天統(tǒng)計愈傷組織的分化率(分化率=(分 化出芽的愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù))100%)。2.6.3 芽增殖系數(shù)液體培養(yǎng)后, 將芽轉移至固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30

14、 天, 并繼代1次, 分別統(tǒng)計每次固體培養(yǎng)的全部芽數(shù), 計算芽增殖系數(shù)(芽增殖系數(shù)=全部增殖芽數(shù)/接種芽 數(shù))。3 結果與討論3.1 愈傷組織的誘導不同培養(yǎng)基對3種外植體愈傷組織誘導的結果見表1。 適當濃度的2,4-D和6-BA配比, 對梔子果實各局部愈 傷組織的誘導具有一定的促進作用。MS-A培養(yǎng)基可 使果皮和種子脫分化并形成愈傷組織, 二者的出愈時 間大致相同, 在培養(yǎng)910天后開始從切口邊緣長出 淺黃色的愈傷組織, 誘導率分別為83.3%和88.5%; MS-D培養(yǎng)基可使種子團形成愈傷組織, 種子團的出 愈時間比果皮和種子稍長, 15天后才開始從切口面長 出淺黃色的愈傷組織, 誘導率為7

15、8.1%。3種外植體形 成愈傷組織的質量不同。果皮出愈時間雖短, 但極易 褐化, 較難進行繼代培養(yǎng); 種子出愈時間雖與果皮相 似, 但愈傷組織生長狀態(tài)很好, 且不易褐化; 種子團 出愈時間最遲, 愈傷組織的生長狀態(tài)卻很好, 也不易 褐化(圖1AC)。3.2 愈傷組織的分化將來源于3種外植體的愈傷組織進行芽分化培養(yǎng), 采 用不同的固體培養(yǎng)基進行了屢次實驗, 都沒有分化出 芽。后使用液體培養(yǎng), 僅來自種子的愈傷組織可再生 出芽(圖1D)。種子愈傷組織在不同的植物生長調節(jié)劑組合下進行液體培養(yǎng), 除Y-E和Y-F外, 都能不同程 度地分化出芽, 但愈傷組織的分化率均較低, 說明種 子的愈傷組織較難分化

16、。Y-B培養(yǎng)基上的分化率最高, 為8.75%。在5種可分化的培養(yǎng)基中, 含TDZ的有3種, 含6-BA的有1種, 可見與6-BA相比, TDZ能更好地促 進芽分化, 并呈現(xiàn)出濃度效應(表2)。值得注意的是, 在沒有添加TDZ和6-BA的Y-D培養(yǎng)基中也有一定比 例的芽分化, 但此局部芽在增殖過程中, 生長狀況不 理想。3.3再生芽的增殖為了獲得更多的再生芽, 將芽轉移至固體培養(yǎng)基中繁 殖, 結果見表3。第1次固體培養(yǎng)30天后, 來源于Y-C 和Y-G的芽各有1個枯萎死亡, 芽增殖系數(shù)低于1。繼 代培養(yǎng)后, 來源于不同液體培養(yǎng)基的芽增殖系數(shù)差異 較大。來源于Y-G培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最大, 為7;

17、來源 于Y-D培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最小, 為1.5, 且芽的顏色均 呈黃色, 在進一步的增殖繼代培養(yǎng)中枯萎死亡。來源 于Y-B培養(yǎng)基的芽, 在進一步的增殖繼代培養(yǎng)中生長 良好, 且數(shù)量多(圖1E)。綜合分化率和增殖系數(shù)分析 說明, Y-B培養(yǎng)基是分化和芽增殖的最正確培養(yǎng)基。通過 芽增殖培養(yǎng), 可以彌補愈傷組織分化率低導致的再生 植株少的問題。3.4生根培養(yǎng)增殖培養(yǎng)繼代1次后, 可獲得一定數(shù)量且生長狀況良 好的芽。將芽從基部切下, 轉移至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 15天后, 在切口處出現(xiàn)白色的突起; 30天后, 長成粗 壯的根(圖1F), 獲得再生植株。3.5討論6-BA、TDZ和2,4-D是誘導梔子產生

18、愈傷組織的有效 激素(肖瀟等, 2005)。目前, 只有Al-Juboory等(1998) 和肖瀟等(2005)報道了從梔子葉片的愈傷組織中分 化出芽。本研究使用6-BA和2,4-D有效地從梔子果皮、 種子團和種子中誘導出愈傷組織, 并從來源于種子的 愈傷組織中成功地分化出再生芽, 液體培養(yǎng)和TDZ在 芽分化中起著重要作用。液體培養(yǎng)能促進梔子愈傷組 織分化的原因可能是調整了愈傷組織細胞的狀態(tài), 使 之適宜分化。本研究愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的生長素 含量比分化培養(yǎng)基高10倍, 推測可能由于液體培養(yǎng)334 植物學報 49(3) 2021圖1 梔子愈傷組織的誘導和植株再生(A) 果皮愈傷組織; (B)

19、 種子團愈傷組織; (C) 種子愈傷組織; (D) 種子愈傷組織在懸浮培養(yǎng)中分化的芽; (E) 種子愈傷組織在Y-B培 養(yǎng)基中的增殖芽; (F) 再生植株Figure 1 The callus induction and plant regeneration of Gardenia jasminoides(A) Callus induced from pericarp; (B) Callus induced from placenta with seeds; (C) Callus induced from seed; (D) Buds differentiated from seed call

20、i by liquid culture; (E) Bud proliferation on Y-B medium; (F) Regenerated plantlets表3 不同植物生長調節(jié)劑組合對再生芽增殖系數(shù)的影響Table 3 Effects of different plant growth regulator combinations on the bud proliferation coefficientMediumPlant growth regulator concentration (mgL1)Number of buds onNumber of budsProliferati

21、on coefficient atNumber of buds on solidNumber of budsProliferation coefficient atNAATDZ6-BAsolid culture proliferated onsolid cultureculture 2ndproliferated on solid culture1stsolid culture 1st 1stsolid culture2ndY-A0.050.05221221n0d5Y-B0.050.108818364.5Y-C0.050.15430.75382.7Y-D0.05221231.5Y-G0.052

22、.0210.5177使細胞較充分地接觸培養(yǎng)基, 進而降低了細胞的生長 素含量和固體培養(yǎng)方式下細胞與培養(yǎng)基接觸面累積 的不利于分化的物質。TDZ是一種人工合成的高效生 物調節(jié)劑, 具有生長素和細胞分裂素的雙重作用, 能 誘導外植體從愈傷組織形成到體細胞胚胎發(fā)生的一系列不同反響(王關林等, 1997; 徐曉峰和黃學林, 2003; Baalma et al., 2021)。TDZ對木本植物的再生 最有效(Baker and Bhatia, 1993)。1998年, Al-Juboory 等首次將TDZ用于梔子外植體的再生誘導。本研究結 果說明, 雖然愈傷組織的分化率因TDZ濃度的不同而張慶紅等:

23、藥用植物梔子的組織培養(yǎng) 335有差異, 但均能促進梔子芽的分化, 這與Al-Juboory 等(1998)和肖瀟等(2005)的研究結果一致。一般認為, 從目的次生代謝產物含量高的外植體 誘導出的愈傷組織的次生代謝產物含量也高(李琰等, 2004; 姚文兵, 2021)。梔子的藥效成分是梔子苷(國家藥典委員會, 2021), 其在種子中含量較高(蔣珍藕,1995; 王春芳和魯靜, 1997)。本研究建立的從種子誘 導愈傷組織并分化成苗, 有望構建高藥效成分含量的 轉基因實驗技術平臺。本研究以梔子果皮、種子團和種子為外植體, 在 含有不同植物生長調節(jié)劑配比的MS培養(yǎng)基上誘導愈 傷組織; 并采用固

24、體和液體培養(yǎng)相結合的方法, 誘導 芽及根的分化, 獲得梔子再生苗, 為進一步通過細胞 培養(yǎng)獲得梔子高含量有效成分及其轉基因研究奠定 了根底。參考文獻國家藥典委員會 (2021). 中國藥典(第1部). 北京: 化學工業(yè) 出版社. pp. 231232.蔣珍藕 (1995). 山梔子和水梔子中梔子甙的含量分析. 廣西 中醫(yī)藥 18, 50, 53.李琰, 董娟娥, 姜在民, 唐銳 (2004). 杜仲愈傷組織中次生代 謝產物積累動態(tài)研究. 西北植物學報 24, 20332037.陸斐, 劉寶光, 劉玉波, 張弼弘, 王佰華 (2000). 梔子的組織 培養(yǎng)快速繁殖技術. 北華大學學報(自然科學版

25、) 1, 533535.馬文景, 米受恩 (1993). 梔子組織培養(yǎng)適宜培養(yǎng)基的研究. 甘 肅農業(yè)大學學報 28, 7781.王春芳, 魯靜 (1997). 高效液相色譜法測定梔子中藏紅花素 的含量. 藥物分析雜志 17, 321323.王關林, 方宏筠, 那杰 (1997). 高活性細胞沖動素TDZ在植物 組織培養(yǎng)中的應用. 植物學通報 14, 4753.王育選, 石曉薈, 王玉國 (2021). 梔子組織培養(yǎng)及快速繁殖 研究. 山西農業(yè)大學學報(自然科學版) 28, 260262.肖瀟, 唐琳, 賈勇炯, 陳放 (2005). 懸浮培養(yǎng)促進梔子再生的 研究. 四川大學學報(自然科學版)

26、42, 12431245.徐曉峰, 黃學林 (2003). TDZ: 一種有效的植物生長調節(jié)劑. 植物學通報 20, 227237.姚文兵 (2021). 生物技術制藥概論(第2版). 北京: 中國醫(yī)藥 科技出版社. pp. 121121.袁曉凡, 趙兵, 王玉春 (2005). 稀土元素在藥用植物細胞和 組織培養(yǎng)中的應用. 植物學通報 22, 115120.鐘青萍, 楊寧生, 陳米慧 (1994). 梔子愈傷組織生長和黃色素 合成影響因素的研究. 南昌大學學報(理科版) 18, 256262.Al-Juboory KH, Skirvin RM, Williams DJ (1998). Cal

27、lus induction and adventitious shoot regeneration of gardenia (Gardenia jasminoides Ellis) leaf explants. Sci Hortic 72, 171178.Baker BS, Bhatia SK (1993). Factors effecting adventitious shoot regeneration from leaf explants of quince (Cydonia oblonga). Plant Cell Tissue Organ Cult 35, 273277.Baalma

28、 D, Uranbey S, Mirici S, Kolsarici (2021). TDZ x IBA induced shoot regeneration from cotyledonary leaves and in vitro multiplication in safflower (Carthamus tinctorius L.). Afr J Biotechnol 7, 960966.George PS, Ravishankar GA, Venkataraman LV (1993). Clonal multiplication of Gardenia jasminoides Ell

29、is th- rough axillary bud culture. Plant Cell Rep 13, 5962.336 植物學報 49(3) 2021Tissue Culture of the Medicinal Plant Gardenia jasminoidesQinghong Zhang1, Liyun Tang2, Shaojin Situ3, Sha Wang3, Guozhen He1*1College of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 51

30、0006, China2College of Life Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China3Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Company Limited, Guangzhou 510250, ChinaAbstract Gardenia (Gardenia jasminoides) is a woody medicinal plant with geniposide, chlorogenic acid and crocin-1 as

31、 its bioactive compounds. To establish an experimental system for gene transformation to obtain high-content bioactive compounds, we studied the effects of different plant regulators and cultural modes on the callus induction and shootregeneration from explants of pericarps, placentas with seeds, and seeds of gardenia. The optimal medium for callus induction from pericarp and seed was MS+0.5 mgL12,4-D+0.25 mgL16-BA