白芨組織培養(yǎng)實施計劃方案

1、. .PAGE10 / NUMPAGES10白與組織培養(yǎng)實施方案一、白與簡介白與為蘭科白與屬多年生草本植物，又名甘根、連與草、地螺絲、羊角七、皸口藥、利知子、刀口藥、魚眼蘭等。分布在中國、日本以與緬甸北部，主產(chǎn)于、等地。其味苦、甘、澀,性涼,歸肺、胃、肝經(jīng)。以塊莖供藥用，能收斂止血，消腫生?。恢畏谓Y(jié)核咳血，支氣管擴咯血、胃潰瘍吐血、尿血、便血等癥。外用治外傷出血、燒燙傷、手足皸裂等癥。塊莖含黏液質(zhì)和淀粉等，可作糊料，在生物醫(yī)藥、保健食品、紡織印染、特種涂料和日用化工等方面有巨大的商業(yè)利用價值。又因白與為地生蘭的一種，花開艷麗，被作為庭院、居室與園林景觀綠化苗木大量應用。白與一般生于海拔1103

2、200m的山野、山谷較潮濕處或林下半遮陰地帶，喜溫暖、稍陰濕的環(huán)境，耐陰性強，忌強光直射，需排水良好、富含腐殖質(zhì)的砂質(zhì)土壤，稍耐寒，冬季可在地下越冬。白與能產(chǎn)生大量的種子(每個蒴果1030萬粒)，但這些種子沒有胚乳，自然萌發(fā)率極低，繁殖困難，但白與胚的薄壁細胞貯存大量的蛋白質(zhì)、油脂和碳水化合物，可作為種子萌發(fā)的營養(yǎng)成分，因此白與種子在保濕的情況下可以萌發(fā)，是蘭科植物中種子易萌發(fā)的類型。傳統(tǒng)的白與繁殖方法大多以分株為主，即將塊莖分成小塊種植，但繁殖系數(shù)低，大面積發(fā)展對種源消耗大，不宜推廣且難以滿足市場需求。采用白與組織培養(yǎng)可在短時間大量獲取種苗，且成本相對較低，是提高白與產(chǎn)量的強有力措施。目前，

3、國研究資料報道的白與組織培養(yǎng)方法各異，所采用的外植體各不一樣，且培養(yǎng)基與其中所加的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和規(guī)格也千差萬別。二、白與組織培養(yǎng)技術(shù)路線參照植物組織組織培養(yǎng)獲得再生植株的方式，可通過4種途徑獲得白與再生植株：一是由愈傷組織形成不定芽再生植株；二是愈傷組織產(chǎn)生胚狀體而再生植株；三是由側(cè)芽或頂芽再生植株；四是由莖尖產(chǎn)生原球莖而再生植株。4種方式各有利弊，傳統(tǒng)認為采用側(cè)芽或頂芽發(fā)育途徑獲得的后代性狀較穩(wěn)定，但因為白與原球莖帶有大量共生菌，組培過程中容易出現(xiàn)污染。結(jié)合盧氏當?shù)貙嶋H，探索采用白與無菌播種的技術(shù)路線，通過不同濃度和培方的培養(yǎng)基實現(xiàn)白與組織培養(yǎng)的最佳技術(shù)路線，建立白與快繁體系。白與組織

4、培養(yǎng)完整的技術(shù)路線如下：經(jīng)過試驗優(yōu)化后的技術(shù)路線為：白與種子（采集優(yōu)質(zhì)種源蒴果）表面消毒無菌播種（MS培養(yǎng)基等）原球莖（分化誘導）白與小苗（分株、擴繁）壯苗生根（煉苗）完整小植株煉苗20-25天移栽白與 三、實驗準備：種子：白與的蒴果中有大量的種子，并且蒴果的消毒較方便，污染率低。另一方面用種子作為外植體操作較容易，并且組培過程中萌發(fā)率高，培養(yǎng)的幼苗生長較為迅速，因此，種子作為外植體應用比較廣泛，大部分的組培研究都選用種子。本實驗選取盧氏本地優(yōu)質(zhì)白與（Bletilla striata(Thunb)Reichbf）蒴果，采收時間為8月下旬至9月中旬，此時間段胚齡大約為第8周至第22周。器材：高壓

5、滅菌鍋、超凈工作臺、電子分析天平（精度為千分之一）、電磁爐、接種消毒器、高效能培養(yǎng)架、醫(yī)用小推車、日光燈、加濕器、紫外燈、晾瓶架、酸度計（或PH試紙）、試管、容量瓶、膠頭滴管、試劑瓶、燒杯、試管架、量筒、玻璃漏斗、移液管、三角瓶、廣口培養(yǎng)瓶、稱量紙、毛刷、洗耳球、塑料筐、無菌脫脂棉、無菌濾紙、酒精燈、噴壺、橡膠手套、醫(yī)用白大褂、紫外燈、鑷子、接種針、剪刀、解剖刀、器械架、接種托盤等。（1）通用器械燒杯：用來盛放、溶解化學藥劑等。常用的規(guī)格有50 mL、100mL、250mL、500mL、1000mL。烘箱：用來烘干器械。恒溫水浴：用來溶解瓊脂等物質(zhì)。玻璃攪拌棒：用來配制培養(yǎng)基。洗耳球：用來輔助

6、吸取、轉(zhuǎn)移少量液體。冰箱：用來貯存化學藥劑、植物材料等。牛角勺：用來轉(zhuǎn)移化學藥劑。玻璃漏斗：用來過濾溶液。剪刀：用來修剪外植體或剪切嫩莖。器械架：在無菌操作期間用來放置滅菌的器械。（2）各種盛具搪瓷淺盤：用來承載各種器械容器。塑料盆：用于清洗培養(yǎng)容器。鐵絲筐：用來盛放滅菌容器等物品。純水水桶：用來存放去離子水或蒸餾水。常用的規(guī)格有10L、20L。塑料桶：用來存放洗滌溶液、廢棄溶液。各種規(guī)格的磨砂玻璃瓶：用來盛放培養(yǎng)母液，以與各種植物生長物質(zhì)。（3）計量器械量筒：用來量取一定體積的液體。常用的規(guī)格有25mL、50mL、100mL、500mL、1000mL。容量瓶：用來配制標準溶液。常用的規(guī)格有5

7、0mL、100mL、500mL、1000mL。大肚移液管：用來吸取定量溶液。常用的規(guī)格有1mL、5mL、10mL?？潭纫埔汗埽河脕砦《恐参锷L物質(zhì)溶液。常用的規(guī)格有1mL、5mL、10mL (或可用移液器替換) 。移液管架：用來放置、固定移液管。酸度計：用來檢測培養(yǎng)基的pH。藥物天平：用來稱取配制培養(yǎng)基的藥品。分析天平：用來稱取少量有化學試劑，進行化學分析。（4）滅菌器械磨砂口玻璃瓶：用來對植物材料進行表面滅菌。酒精燈：用來進行接種器材的表面滅菌。細菌過濾器：用來過濾不能進行高溫滅菌的試劑溶液。無菌濾紙：用來汲取器材、植物材料表面的水分。無菌脫脂棉：用來進行器械、植物材料表面的滅菌處理。高

8、壓滅菌鍋：對培養(yǎng)基、接種器材進行滅菌處理。紫外線滅菌燈：用來對接種室、培養(yǎng)室、操作室等工作環(huán)境進行滅菌處理。（5）接種器械超凈工作臺：用來過濾通過接種工作臺面的空氣，以便進行無菌操作。小型噴霧器：裝載滅菌藥液，來給超凈工作臺等處噴霧滅菌。鈍頭鑷子：在接種操作、繼代培養(yǎng)時移取植物材料。尖頭鑷子：用來分離植物材料。解剖刀：用來切割植物材料。接種針：用來轉(zhuǎn)移細胞團、愈傷組織。（6）培養(yǎng)器械試管：用來作為外植體的培養(yǎng)容器。常用的規(guī)格有2cm15cm、3cm15cm。培養(yǎng)皿：用來作為外植體的培養(yǎng)容器。常用的規(guī)格有直徑9cm、12cm。錐形瓶：即三角燒瓶，主要作為培養(yǎng)器材，常用的規(guī)格有50mL、100mL

9、。鋁箔：用于培養(yǎng)容器封口。橡皮筋：用來束緊培養(yǎng)容器的封口材料?？照{(diào)：用來調(diào)節(jié)操作間、培養(yǎng)室的溫度。藥劑：硝酸銨（NH4NO3）、硝酸鉀（KNO3）、氯化鈣（CaCl2）、硫酸鎂（MgSO47H2O）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、碘化鉀（KI）、硼酸（H3BO3）、硫酸錳（MnSO45H2O）、硫酸鋅（ZnSO47H2O）、鉬酸鈉（Na2MoO4）、硫酸銅（CuSO45H2O）、氯化鈷（CoCl26H2O）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA2H2O）、硫酸亞鐵（FeSO47H2O）、甘氨酸（C2H5NO2）、肌醇（C6H12O6）、煙酸（VB5）、鹽酸吡哆醇（VB6）、鹽酸硫胺素（VB1）、6-

10、芐基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、腺嘌呤（AD）、赤霉酸（CA3）、蔗糖、瓊脂環(huán)境：采用組培快繁技術(shù)進行白與的工廠化生產(chǎn)，包括外植體的篩選與獲取、外植體滅菌誘導培養(yǎng)、無菌材料繁殖、繼代擴繁、單株生根、出瓶煉苗、移栽等工藝程序。由于組培苗生產(chǎn)從進瓶到出瓶都是在無菌條件下完成，所以離不開一個無菌環(huán)境，但實驗室的規(guī)模大小需依據(jù)生產(chǎn)規(guī)模來確定。組培實驗室具體設計包括：1、準備室：(1)進行藥品、器具和實驗材料的保存、消毒以與培養(yǎng)基的配制、滅菌、分裝等。(2)器具的洗滌、干燥、消毒、儲藏。(3)生理生化指標的測定等。2、接種室：進行材料的接種，置超凈工作臺，加裝紫外線燈滅菌。外設緩沖間放置拖鞋、

11、工作服、工作帽等。3、培養(yǎng)室：開展白與幼苗的無菌生長提供場所，室需要有培養(yǎng)架與控制溫度、濕度、光照的各種設備。四、實驗流程1.準備階段查閱相關文獻，結(jié)合實際制訂白與組織培養(yǎng)實施方案，根據(jù)實驗方案配制實驗所需的消毒劑和各類母液，確定不同培養(yǎng)階段培養(yǎng)基配方。MS培養(yǎng)基與其它培養(yǎng)基的基本成分相比，硝酸鹽、鉀和銨的含量高，有較高的無機鹽濃度，無機養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿足植物細胞在營養(yǎng)上和生理上的需要，對保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)和加速愈傷組織的生長十分有利。MS固體培養(yǎng)基可用來誘導愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖與花藥培養(yǎng)，是目前普遍使用的培養(yǎng)基。白與組培選取的培養(yǎng)基即為MS培養(yǎng)基。配制培養(yǎng)基

12、可分為以下幾步：（1）制備母液為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對幾十種化學藥品進行稱量，應該將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量10倍、100倍或1000倍稱量，配成母液。這樣，每次配制培養(yǎng)基時，取其總量的1/10、1/100、1/1000，加以稀釋，即成培養(yǎng)液。MS培養(yǎng)基主要包含5種主要成分：大量元素：大量元素包括硝酸銨等用量較大的幾種化合物。制備時，按表中排列的順序，以其10倍的用量，分別稱出并進行溶解，以后按順序混在一起，最后加蒸餾水，使其總量達到1L，此即大量元素母液。微量元素：因用量少，為稱量方便和精確起見，應配成100倍或1000倍的母液。配制時，每種化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解

13、并混在一起，制成微量元素母液。鐵鹽：鐵鹽要單獨配制。由硫酸亞鐵(FeSO47H2O)5.57g和乙二胺四乙酸二鈉(NaEDTA)7.45g溶于1L水中配成。每配1L培養(yǎng)基，加鐵鹽5mL。有機物質(zhì)：主要指氨基酸和維生素類物質(zhì)。它們都是分別稱量，分別配成所需的濃度(0.11.0 mg/mL)，用時按培養(yǎng)基配方中要求的量分別加入。植物激素：最常用的有生長素和細胞分裂素。這類物質(zhì)使用濃度很低，一般為0.0110 mg/L?？砂从昧康?00倍或1000倍配制母液，配制時要單個稱量，分別貯藏。配制植物生長素時，應先按要求濃度稱好藥品，置于小燒杯或容量瓶中，用1 mol/L氫氧化鈉溶解，再加蒸餾水稀釋至所需

14、濃度。配制細胞分裂素時，應先用少量1mol/L的鹽酸溶解，然后加蒸餾水至所需量。以上各種混合液(母液)或單獨配制藥品，均應放入冰箱中保存，以免變質(zhì)、長霉。至于蔗糖、瓊脂等，可按配方中要求，隨稱隨用。（2）配制培養(yǎng)基的具體操作根據(jù)配方要求，用量筒或移液管從每種母液中分別取出所需的用量，放入同一燒杯中，并用粗天平稱取蔗糖、瓊脂放在一邊備用。將中稱好的瓊脂加蒸餾水300400mL，加熱并不斷攪拌，直至煮沸溶解呈透明狀，再停止加熱。將中所取的各種物質(zhì)(包括蔗糖)，加入煮好的瓊脂中，再加水至L，攪拌均勻，配成培養(yǎng)基。用1 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸，滴入中的培養(yǎng)基里，每次只滴幾滴，滴后攪拌均勻，并用PH

15、試紙（或酸度計）測其PH值，直到將培養(yǎng)基的PH值調(diào)到5.8-6.0。將配好的培養(yǎng)基，分裝到組培瓶中，蓋好瓶蓋并做好標記，瓶中培養(yǎng)基的量約為20-25mL。培養(yǎng)基的成分比較復雜，為避免配制時忙亂而將一些成分漏掉，可以準備一份配制培養(yǎng)基的成分單，將培養(yǎng)基的全部成分和用量填寫清楚。配制時，按表列容順序，按項按量稱取，就不會出現(xiàn)差錯。（3）培養(yǎng)基的滅菌與保存培養(yǎng)基配制完畢后，應立即滅菌。培養(yǎng)基通常應在高壓蒸汽滅菌鍋，在壓力0.1-0.15Mpa、溫度122條件下，滅菌1520min。期間需排出滅菌鍋的冷空氣，具體操作方法為：通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出冷空氣，待壓力表指針歸零

16、后，再關閉放氣閥。滅菌后的組培瓶取出后整齊擺放在室，2h后即可冷卻凝固成白色半透明狀固體，經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基要在配制后的一周使用完，在多數(shù)情況下，應在滅菌后兩周用完。2.外植體選擇與消毒選擇合適的部位作為外植體，采回后經(jīng)過適當?shù)念A處理，如清除殘留的莖稈、剪去干枯的花序、分類篩選等，然后進行消毒處理。白與組織培養(yǎng)采用白與種子無菌播種的方法，因此要采集無雜菌感染、無病蟲害、生長健壯的優(yōu)良白與品種種子。實驗選取白與種植基地的白與蒴果備用,蒴果采收時間為8月下旬至9月上旬。白與蒴果采回后，先用清水洗凈，洗衣粉溶液浸泡10min再用清水沖刷洗凈，在超凈工作臺上采用70%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞消毒

17、10-15min，用無菌水沖洗3-4次，在濾紙上吸干水分，從果實中部撥開，快速接種到培養(yǎng)基上。無菌播種培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 0.05 mg/L +NAA 0.1-0.5mg/L，其中含蔗糖3%、瓊脂粉0.7%、PH5.8。種子萌發(fā)條件為晝溫20-25，夜溫18-20，暗培養(yǎng)7d再轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)。觀察種子萌發(fā)情況，以周圍統(tǒng)計單位，統(tǒng)計萌發(fā)個數(shù)與生長情況，發(fā)現(xiàn)染菌需與時清理。如白與蒴果采集數(shù)量較多，無法一次性保存，可用報紙逐個包裹后放入冰箱，每周更換報紙避免發(fā)霉，在4左右可長期保存。3.叢生芽誘導無菌播種培養(yǎng)基中種子萌發(fā)出現(xiàn)圓球狀綠色芽點，與時轉(zhuǎn)入誘導培養(yǎng)基中，萌發(fā)大量叢生芽。誘導叢生芽培養(yǎng)基

18、為：MS+6-BA 0.1 mg/L，其中含蔗糖3%、瓊脂粉0.7%、PH5.8。4.生根壯苗培養(yǎng)剛形成的白與芽苗往往比較弱小，多數(shù)無根，此時可降低細胞分裂素濃度或不加，提高生長素濃度，促進小苗生根，提高其健壯度。待白與叢生芽長到2cm高后分離成單株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，以每瓶20-30株為最佳。培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.05 mg/L，其中含蔗糖2%、瓊脂粉0.7%、PH5.8。由于分化形成的芽、原球莖數(shù)量有限，為了大量獲取幼苗，可采用適當?shù)睦^代培養(yǎng)基（本實驗采用MS+ NAA 0.10.5mg/L，其中含蔗糖2%、瓊脂粉0.7%、PH5.8），經(jīng)多次分割轉(zhuǎn)接，當芽苗繁殖到一定數(shù)量后，再將一

19、部分用于壯苗生根，另一部分保存或繼續(xù)擴繁。采用此方法工序較多，產(chǎn)生的人工成本和材料成本較大，故在本實驗中不采用。（5）煉苗移栽當白與組培小苗在培養(yǎng)瓶中長到3-5cm高時,即可出瓶。一般來說，春季氣溫逐漸回升,有利試管苗適應自然環(huán)境,最宜移栽。為使試管苗移栽后適應自然環(huán)境,移栽前要先揭開瓶蓋，放在室自然光下煉苗3-7d，以提高小苗的抗性和適應性。在組培瓶中時間不宜超過2個月，時間過長出瓶取苗要小心操作，盡量不要折斷根部，可用鑷子輕夾根部拔出（鑷子頭部可用棉花捆綁），用軟毛刷洗凈根部培養(yǎng)基，正常組培苗先在自來水中洗凈培養(yǎng)基，特別要洗掉瓊脂，以免瓊脂發(fā)霉引起爛根，再換自來水清洗一次，然后用800-1

20、000倍百菌清或多菌靈液浸泡根部0.2h，待幼苗放在通風陰涼處晾半天，用濕潤毛巾蓋住葉片，只把根部裸露，至根部發(fā)白時即可栽植，移栽前用1000倍生根劑溶液蘸根，植入土壤基質(zhì)中。深度不宜過深，以入土3-5cm深為宜，使根部自然伸展，輕輕壓實，株行距5*5cm。栽好后，澆足定根水，置于陰涼處。注意保持較高的空氣濕度(80%-90%)和適當通風，并使環(huán)境溫度維持在20-25。當移栽小苗新葉展開、苗根伸長后, 每月用MS大量元素1000 倍稀釋液或花寶一號1000倍稀釋液噴施追肥，促進生長發(fā)育。待小苗成活后，再移栽到大田。馴化時間3-5個月后等外界氣溫逐漸回升,有利組培苗適應自然環(huán)境，最宜移栽。因白與喜濕潤，怕積水，積水會使根莖腐爛，葉片脫落而死。因此,移栽過程中基質(zhì)的透氣性和保濕性直接決定了白與苗成活率的高低。對白與組培苗移栽基質(zhì)可以使用珍珠巖30%+膨化蛭石3