氣相色譜儀使用方法及實(shí)驗(yàn)操作步驟

1、液相色譜儀、氣相色譜儀、原子吸收分光光度計、紅外光譜儀、核磁共振、原子發(fā)射光譜等分析儀器氣相色譜儀使用方法及實(shí)驗(yàn)操作步驟： A、打開氮?dú)?、氫氣、空氣發(fā)生器的電源開關(guān)(或氮?dú)怃撈靠傞y)，調(diào)整輸出壓力穩(wěn)定在0.4Mpa左右（氣體發(fā)生器一般在出廠時已調(diào)整好，不用再調(diào)整）。 B、打開色譜儀氣體凈化器的氮?dú)忾_關(guān)轉(zhuǎn)到“開”的位置。注意觀察色譜儀載氣B的柱前壓上升并穩(wěn)定大約5分鐘后，打開色譜儀的電源開關(guān)。C、設(shè)置各工作部溫度。TVOC分析的條件設(shè)置：(a)柱箱：柱箱初始溫度50、初始時間10min、升溫速率5/min、終止溫度250、終止時間10min; (b)進(jìn)樣器和檢測器：都是250。脂肪酸分析時的色譜

2、條件：(a)柱箱：柱箱初始溫度140、初始時間5min、升溫速率4/min、終止溫度240、終止時間15min; (b)進(jìn)樣器溫度是260，檢測器溫度是280。 D、點(diǎn)火：待檢測器（按“顯示、換檔、檢測器”可查看檢測器溫度）溫度升到150以上后，打開凈化器上的氫氣、空氣開關(guān)閥到“開”的位置。觀察色譜儀上的氫氣和空氣壓力表分別穩(wěn)定在0.1Mpa和0.15Mpa左右。按住點(diǎn)火開關(guān)（每次點(diǎn)火時間不能超過68秒鐘）點(diǎn)火。同時用明亮的金屬片靠近檢測器出口，當(dāng)火點(diǎn)著時在金屬片上會看到有明顯的水汽。如果在68秒時間內(nèi)氫氣沒有被點(diǎn)燃，要松開點(diǎn)火開關(guān)，再重新點(diǎn)火。在點(diǎn)火操作的過程中，如果發(fā)現(xiàn)檢測器出口內(nèi)白色的聚

3、四氟帽中有水凝結(jié)，可旋下檢測器收集極帽，把水清理掉。在色譜工作站上判斷氫火焰是否點(diǎn)燃的方法：觀察基線在氫火焰點(diǎn)著后的電壓值應(yīng)高于點(diǎn)火之前。 E、打開電腦及工作站（通道一分析脂肪酸，通道二分析碘），打開一個方法文件：脂肪酸分析方法或碘分析方法。顯示屏左下方應(yīng)有藍(lán)字顯示當(dāng)前的電壓值和時間。接著可以轉(zhuǎn)動色譜儀放大器面板上點(diǎn)火按鈕上邊的“粗調(diào)”旋鈕，檢查信號是否為通路(轉(zhuǎn)動“粗調(diào)”旋鈕時，基線應(yīng)隨著變化)。待基線穩(wěn)定后進(jìn)樣品并同時點(diǎn)擊“啟動”按鈕或按一下色譜儀旁邊的快捷按鈕，進(jìn)行色譜數(shù)據(jù)分析。分析結(jié)束時，點(diǎn)擊“停止”按鈕，數(shù)據(jù)即自動保存。 F、關(guān)機(jī)程序：首先關(guān)閉氫氣和空氣氣源，使氫火焰檢測器滅火。在氫

4、火焰熄滅后再將柱箱的初始溫度、檢測器溫度及進(jìn)樣器溫度設(shè)置為室溫（20-30），待溫度降至設(shè)置溫度后，關(guān)閉色譜儀電源。最后再關(guān)閉氮?dú)狻８?效 液 相 色 譜我國藥典收載高效液相色譜法項(xiàng)目和數(shù)量比較表：方法項(xiàng)目數(shù)量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鑒別934150檢查1240160含量測定760117387鑒于HPLC應(yīng)用在藥品分析中越來越多，因此每一個藥品分析人員應(yīng)該掌握并應(yīng)用HPLC。三、色譜法分類3四、色譜分離原理3II基本概念和理論5一、基本概念和術(shù)語5二、塔板理論8三、速率理論（又稱隨機(jī)模型理論）9IIIHPLC系統(tǒng)10一、輸液泵11二、進(jìn)樣器13三、色譜柱14四

5、、檢測器17五、數(shù)據(jù)處理和計算機(jī)控制系統(tǒng)20六、恒溫裝置20IV固定相和流動相20一、基質(zhì)（擔(dān)體）20二、化學(xué)鍵合固定相22三、流動相231流動相的性質(zhì)要求232流動相的選擇243流動相的pH值244流動相的脫氣255流動相的濾過256流動相的貯存267鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問題268HPLC用水26VHPLC應(yīng)用27一、樣品測定27二、方法研究27附件：高效液相色譜法（HPLC）復(fù)核細(xì)則28一、對起草單位的要求：28二、對復(fù)核單位的要求：28二、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)HPLC有以下特點(diǎn)：高壓壓力可達(dá)150300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。高速流速為0.110.0

6、ml/min。高效可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達(dá)100種。高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：速度快通常分析一個樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。柱子可反復(fù)使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。三、色譜法分類按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC

7、根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。（此外還有電泳。）按操作形式可分為紙色譜法(PC)、

8、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。四、色譜分離原理高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。1液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度510m。適用于分離分子量2001000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。2液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離

9、。分離過程是一個分配平衡過程。涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留

10、時間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜法一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.57.5（28），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使

11、鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.510范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法反相色譜法固定相極性高中中低流動相極性低中中高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。3離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。緩沖液常用作離子交換

12、色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。4離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸

13、也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測組分保時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。5排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。II基本概

14、念和理論一、基本概念和術(shù)語1色譜圖和峰參數(shù)色譜圖(chromatogram)樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。基線(base line)經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達(dá)到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時間軸。噪音(noise)基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。色譜峰(peak)組分流經(jīng)檢測器時響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的

15、曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。拖尾因子(tailing factor，T)T，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。中國藥典規(guī)定T應(yīng)為0.951.05。T0.95為前延峰，T1.05為拖尾峰。峰底基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。峰高(peak height，h)峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。峰寬(peak width，W)峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個交點(diǎn)間的

16、距離。W4半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)峰高一半處的峰寬。Wh/22.355標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，)正態(tài)分布曲線x1時（拐點(diǎn)）的峰寬之半。正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。峰面積(peak area，A)峰與峰底所包圍的面積。Ah2.507 h1.064 Wh/2 h2定性參數(shù)（保留值）死時間(dead time，t0)不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測

17、定死時間。死體積(dead volume，V0)由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測器流動池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0Ft0（F為流速）保留時間(retention time，tR)從進(jìn)樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。保留體積(retention volume，VR)從進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VRFtR調(diào)整保留時間(adjusted retenti

18、on time，tR)扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retention time)。在實(shí)驗(yàn)條件（溫度、固定相等）一定時，tR只決定于組分的性質(zhì)，因此，tR（或tR）可用于定性。tRtRt0調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，VR)扣除死體積后的保留體積。VRVRV0或VRFtR3柱效參數(shù)理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對稱并符合正態(tài)分布，N可近似表

19、示為：N()216()25.54()2N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計算理論塔數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應(yīng)注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用調(diào)整保留時間(tR)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。理論塔板高度(theoretical plate height，H)每單位柱長的方差。H。實(shí)際應(yīng)用時往往用柱長L和理

20、論塔板數(shù)計算：H，H有效。4相平衡參數(shù)分配系數(shù)(distribution coefficient，K)在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。K。分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)（或稱交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很小）時，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，

21、隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達(dá)到分離的目的。容量因子(capacity factor，k)化合物在兩相間達(dá)

22、到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。k。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。分配系數(shù)、容量因子與保留時間之間有如下關(guān)系：kK，tRk t0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（tR）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，tR0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)是：K取決于組分、流動相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于tR、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。選擇性因子(select

23、ivity factor，)相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。 （設(shè)k2k1）。因ktR/t0，則，所以又稱為相對保留時間（美國藥典）。要使兩組分得到分離，必須使1。與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。5分離參數(shù)分離度(resolution，R)相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R。當(dāng)W1W2時，R。當(dāng)R1時，稱為4分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R1.5時，稱為6分離，裸露峰面積為99

24、.7%。R1.5稱為完全分離。中國藥典規(guī)定R應(yīng)大于1.5?；痉蛛x方程分離度與三個色譜基本參數(shù)有如下關(guān)系：R其中稱為柱效項(xiàng)，為柱選擇性項(xiàng)，為柱容量項(xiàng)。柱效項(xiàng)與色譜過程動力學(xué)特性有關(guān)，后兩項(xiàng)與色譜過程熱力學(xué)因素有關(guān)。從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加選擇性。當(dāng)1時，R0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。改變?nèi)萘恳蜃印＿@常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成來實(shí)現(xiàn)。k2

25、趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在110范圍內(nèi)，最好為25，窄徑柱可更小些。二、塔板理論1塔板理論的基本假設(shè)塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程。塔板理論的基本假設(shè)為：1） 色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達(dá)到分配平衡。2） 樣品加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。3） 流動相在色譜柱內(nèi)間歇式流動，每次進(jìn)入

26、一個塔板體積。4） 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關(guān)。雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態(tài)過程，很難達(dá)到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的。但是塔板理論導(dǎo)出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點(diǎn)的位置，能夠評價色譜柱柱效。2色譜流出曲線方程及定量參數(shù)（峰高h(yuǎn)和峰面積A）根據(jù)塔板理論，流出曲線可用下述正態(tài)分布方程來描述：Ce或Ce由色譜流出曲線方程可知：當(dāng)ttR時，濃度C有極大值，Cmax。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明：當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時（即一定），峰高h(yuǎn)與組分的量C0（進(jìn)樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。當(dāng)進(jìn)樣量一定時

27、，越?。ㄖг礁撸?，峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。由流出曲線方程對V(0) 求積分，即得出色譜峰面積ACmaxC0?？梢夾相當(dāng)于組分進(jìn)樣量C0，因此是常用的定量參數(shù)。把Cmaxh和Wh/22.355代入上式，即得A1.064Wh/2h，此為正常峰的峰面積計算公式。三、速率理論（又稱隨機(jī)模型理論）1液相色譜速率方程1956年荷蘭學(xué)者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學(xué)因素結(jié)合起來，提出了色譜過程的動力學(xué)理論速率理論。它把色譜過程看作一個動態(tài)非平衡過程，研究過程中的動力學(xué)因素對峰展寬（即柱效）的影響。后來Giddings和Snyder等人在V

28、an Deemter方程（HAB/uCu，后稱氣相色譜速率方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）：H2dpsup 5(2psup 5(2psup 5(2f2影響柱效的因素1）渦流擴(kuò)散（eddy diffusion）。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴(kuò)散項(xiàng)A2dp，dp為填料直徑，為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻越大。HPLC常用填料粒度一般為310m，最好35m，粒度分布RSD5%。但粒度太小難于填充均勻（大），且會使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，越小。總的說來，應(yīng)采用細(xì)

29、而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細(xì)管無填料，A0。2）分子擴(kuò)散（molecular diffusion）。又稱縱向擴(kuò)散。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u2Dm/u。u為流動相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時間越長（u?。?，展寬越嚴(yán)重。在低流速時，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-410-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計。是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對Dm進(jìn)行校正。一般在0.60.7左右，毛細(xì)管柱的1。3）傳質(zhì)阻抗（mass

30、 transfer resistance）。由于溶質(zhì)分子在流動相、靜態(tài)流動相和固定相中的傳質(zhì)過程而導(dǎo)致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動相和固定相中的擴(kuò)散、分配、轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達(dá)到平衡，實(shí)際傳質(zhì)速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項(xiàng)Cu又分為三項(xiàng)。流動相傳質(zhì)阻抗HmCmd2pu/Dm，Cm為常數(shù)。這是由于在一個流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗HsmCsmd2pu/Dm，Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)

31、入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對峰展寬的影響在整個傳質(zhì)過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p 成正比，與擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比。因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大Dm，但用有機(jī)溶劑作流動相時，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。固定相傳質(zhì)阻抗HsCsd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數(shù)，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與

32、吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學(xué)鍵合固定相時Hs可以忽略。從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：進(jìn)樣時間要短。填料粒度要小。改善傳質(zhì)過程。過高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。適當(dāng)?shù)牧魉?。以H對u作圖，則有一最佳線速度uopt，在此線速度時，H最小。一般在液相色譜中，uopt很?。ù蠹s0.030.1mm/s），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。較小的檢測器死體積。3柱外效應(yīng)速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實(shí)際在柱外

33、還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應(yīng)（色譜峰在柱外死空間里的擴(kuò)展效應(yīng)）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：22柱內(nèi)2柱外2其它柱外效應(yīng)主要由低劣的進(jìn)樣技術(shù)、從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應(yīng)，首先應(yīng)盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內(nèi)腔體積應(yīng)盡可能小。研究表明柱外死體積之和應(yīng)VR/。其次，希望將樣品直接進(jìn)在柱頭的中心部位，但是由于進(jìn)樣閥與柱間有接頭，柱外效應(yīng)總是存在的。此外，要求進(jìn)樣體積VR/2。柱外效應(yīng)的直觀標(biāo)志是容量因子k小的組分（如k2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC

34、的特殊條件，當(dāng)柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時，柱外效應(yīng)越顯得突出。而在經(jīng)典LC中則影響相對較小。IIIHPLC系統(tǒng)HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進(jìn)行梯度洗脫，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測

35、器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測器。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計算機(jī)、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng)。目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。一、輸液泵1泵的構(gòu)造和性能輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)0.5%，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.110 ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型

36、應(yīng)能達(dá)到100 ml/min；輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150300 kg/cm2；液缸容積?。幻芊庑阅芎?，耐腐蝕。泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達(dá)400 kg/cm2。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好

37、（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.20.3%），但出故障的機(jī)會較多（因多一單向閥），價格也較貴。各品牌輸液泵的基本參數(shù)：項(xiàng)目Waters 515型HP 1100型LC-10ATvp型Elite P200 II型檢定要求流速范圍0.001100.001100.0019.9990.014.99調(diào)節(jié)精度0.0010.0010.0010.01流量精密度RSD 0.1%0.15%（0.3%）0.3%0.5%1.5%流量準(zhǔn)確度2.0%5.0%2.0%最高壓力4000 Psi40 MPa39.2 MPa40.0 MPa密封圈壽命流動相的脈沖2泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，

38、必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操作：防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2m或0.45m）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗

39、后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障：沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因

40、是密封環(huán)磨損，需更換。壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯@時，可卸下砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應(yīng)逐段進(jìn)行。3梯度洗脫HPLC有等強(qiáng)度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是

41、在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。在進(jìn)行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例

42、內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強(qiáng)溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產(chǎn)生氣泡?；旌先軇┑恼扯瘸ｋS組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進(jìn)行

43、再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓1030倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達(dá)到完全平衡。二、進(jìn)樣器早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動進(jìn)樣。1隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)

44、性只能達(dá)到12%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。2停流進(jìn)樣。可避免在高壓下進(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)“鬼峰”；另一缺點(diǎn)是保留時間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。3閥進(jìn)樣。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降510%左右），但耐高壓（3540MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。用部分

45、裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬。用完全裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的510倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)：樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45m濾膜過濾，以減少微粒對進(jìn)樣閥的磨損。轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣

46、閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。4自動進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。三、色譜柱色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10m等，柱效理論值可達(dá)516萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般1030cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。柱效受柱內(nèi)

47、外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。1柱的構(gòu)造色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不

48、銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.220m(510m)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑25mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長1030cm；窄徑柱（narrow bore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑12mm，柱長1020cm；毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.20.5mm；半制備柱，內(nèi)徑5m

49、m；實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑2040mm，柱長1030cm；生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。2柱的發(fā)展方向因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長310cm，填料粒徑23m。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)省流動相；靈敏度增加；樣品量少；能使用長柱達(dá)到高分離度；容易控制柱溫；易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如

50、下性能：輸液泵能精密輸出1100l/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。3柱的填充和性能評價色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度20m時，干法填充制備柱較為合適；顆粒20m時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；徑向加壓法，Waters專利；軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性

51、能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在5%或10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。一份合格的色譜柱評價報告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。4柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在

52、色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩（如前所述）。應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被

53、硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要5075ml。下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、

54、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時重復(fù)注射100200l四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）、甲醇、水依次沖洗。保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。

55、絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。在后兩種情況發(fā)生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出12mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（530mm），可以起到保護(hù)、延長柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH29范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。每次工作完后，最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔45天開機(jī)沖洗15分鐘。四、檢測器檢