電壓鉗制和膜片鉗制技術

1、Voltage clamp technique 利用微電極技術，雖然記錄到細胞內的電利用微電極技術，雖然記錄到細胞內的電變化過程，但不能闡明這種變化的原因。要闡變化過程，但不能闡明這種變化的原因。要闡明跨膜電變化機制，必須應用明跨膜電變化機制，必須應用電壓鉗制技術電壓鉗制技術。這一技術首先是由這一技術首先是由ColeCole及其同事設計，在經及其同事設計，在經HodgkinHodgkin等人加以改進，用于神經電生理研究，等人加以改進，用于神經電生理研究，弄清了神經纖維在興奮時離子流的情況。弄清了神經纖維在興奮時離子流的情況。 一、細胞膜的生物物理特性(Biophysical propertie

2、s of cell membrane) 細胞膜上以脂質雙分子層為支架，鑲嵌著不同細胞膜上以脂質雙分子層為支架，鑲嵌著不同特性的蛋白質。細胞膜的電緊張及其擴布規(guī)律，膜的特性的蛋白質。細胞膜的電緊張及其擴布規(guī)律，膜的極化狀態(tài)及其形成過程中等都是細胞膜極化狀態(tài)及其形成過程中等都是細胞膜電纜性質電纜性質(cable properties)(cable properties)的反映。的反映。( (軸漿電阻與膜電阻、軸漿電阻與膜電阻、膜電容的組合，使電流對膜電位的影響起著依距離而膜電容的組合，使電流對膜電位的影響起著依距離而衰減以及在時間上的延緩作用衰減以及在時間上的延緩作用神經的神經的“電纜電纜”性性質

3、質) )。細胞膜的電纜特性從它的等效電路及其時間常細胞膜的電纜特性從它的等效電路及其時間常數(shù)和空間常數(shù)得到證實。數(shù)和空間常數(shù)得到證實。 (一) 細胞膜的等效電路 從電學特點上分析，細胞膜可等效地模擬為從電學特點上分析，細胞膜可等效地模擬為電阻電容器。它具備電阻電容器。它具備細胞漿電阻細胞漿電阻（縱向電阻，（縱向電阻，RoRo），），膜電阻膜電阻（橫向電阻，（橫向電阻，RmRm），），膜電容膜電容（CmCm）和和膜電位膜電位（EmEm）四方面的電學特性，根據(jù)這四）四方面的電學特性，根據(jù)這四方面特性即可構成其方面特性即可構成其等效電路等效電路（Equivalent Equivalent Circu

4、itCircuit）。）。outsideinside膜電位等效電路的簡化圖膜電位等效電路的簡化圖Cm Cm 膜電容膜電容RmRm 膜電阻膜電阻EmEm 離子平衡電位離子平衡電位Ro Ro 細胞外液的縱向電阻（細胞外液的縱向電阻（/cm/cm） RiRi 軸漿的縱向電阻（軸漿的縱向電阻（/cm/cm）RoCmRmEm+-離子通道等效電路 細胞膜的細胞膜的等效電路等效電路是一個并聯(lián)的阻容是一個并聯(lián)的阻容電路，膜活動時既有電壓的改變，同時又電路，膜活動時既有電壓的改變，同時又有電流的改變。有電流的改變。電位的改變可引起電容器電位的改變可引起電容器的充、放電，也可用于電阻器上的電流流的充、放電，也可用

5、于電阻器上的電流流動。動。通過電容器的電流為通過電容器的電流為IcIc ，通過電阻，通過電阻的電流為的電流為IrIr。1 縱向電阻縱向電阻（Ro、Ri） 由胞漿的性質所決定由胞漿的性質所決定，具有較高的電阻率，具有較高的電阻率，它與直徑呈反比關系它與直徑呈反比關系（直徑大、電阻小，直（直徑大、電阻小，直徑小，電阻大）。徑小，電阻大）。由于它的存在，使生物電由于它的存在，使生物電的傳導主要沿細胞膜所包圍的容積導體進行。的傳導主要沿細胞膜所包圍的容積導體進行。它是單位長度的電阻，單位是它是單位長度的電阻，單位是/cm /cm ，細胞細胞外間質的容積很大，其單位長度電阻（外間質的容積很大，其單位長度

6、電阻（RoRo）較較RiRi小。小。 2.橫向電阻（橫向電阻（redial resistance） 即即細胞膜本身具有的膜電阻細胞膜本身具有的膜電阻。細胞膜。細胞膜由雙層脂質構成，厚度很薄，但具有很高由雙層脂質構成，厚度很薄，但具有很高的電阻，即絕緣性。的電阻，即絕緣性。膜電阻表示離子通過膜電阻表示離子通過膜的有限能力。膜的有限能力。 膜電阻反映了離子是否膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電阻（容易通透膜的情況。膜電阻（RmRm）的大?。┑拇笮》从沉四そY構電學方面的差異。反映了膜結構電學方面的差異。2.橫向電阻（橫向電阻（redial resistance） 膜電位、膜電流膜電位、膜電流

7、和和膜電阻膜電阻的關系遵循的關系遵循歐姆定律歐姆定律： Em = Im . RmEm = Im . Rm I = V/R I = V/R 膜電阻越大，對電流的導通能力越小。膜電阻越大，對電流的導通能力越小。 膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電阻（阻（RmRm）的倒數(shù)）的倒數(shù)膜電導膜電導（G G，g g）。）。I = g VI = g V（膜電位（膜電位恒定的情況下，膜電導越大，膜電流也越大。恒定的情況下，膜電導越大，膜電流也越大。 不同的離子有不同的電導不同的離子有不同的電導。 電導的單位是電導的單位是Siemens( S ).Siemens(

8、 S ).3.膜電容膜電容（capacity） 表示膜的絕緣及儲存電荷的性質表示膜的絕緣及儲存電荷的性質。任何一任何一種裝置使兩個導體中間插入一個絕緣體并安排種裝置使兩個導體中間插入一個絕緣體并安排在一起，稱為電容器。在一起，稱為電容器。細胞外液及細胞內液均細胞外液及細胞內液均為含電解質的溶液，可看作為兩個導體；細胞為含電解質的溶液，可看作為兩個導體；細胞膜是含脂質的膜，可視作為絕緣體。細胞外液膜是含脂質的膜，可視作為絕緣體。細胞外液- -細胞膜細胞膜- -細胞內液三者組成了電容。細胞內液三者組成了電容。3.膜電容膜電容（capacity） 電容大小與細胞體積和細胞膜表面積有關。電容大小與細胞

9、體積和細胞膜表面積有關。膜電容和膜面積呈正比，與膜的厚度呈反比。膜電容和膜面積呈正比，與膜的厚度呈反比。 電容的單位是法拉第（電容的單位是法拉第（F F）。）。 膜電容的測量可用于膜電容的測量可用于細胞膜表面積細胞膜表面積的測定，的測定，對推算某種對推算某種離子通道在單位膜面積上的密度離子通道在單位膜面積上的密度有有一定幫助。一定幫助。4 膜電位膜電位 （membrane potential） 當膜上離子通道開放而引起帶電離子跨膜流當膜上離子通道開放而引起帶電離子跨膜流動時，就相當于在電容器上充電或放電而產生電動時，就相當于在電容器上充電或放電而產生電位差，即跨膜電位。位差，即跨膜電位。膜電位

10、的高低決定于跨膜電膜電位的高低決定于跨膜電化學梯度；膜電位的高低與膜兩側的電荷成正比化學梯度；膜電位的高低與膜兩側的電荷成正比。 在膜兩側離子濃度不變的情況下，膜電位則在膜兩側離子濃度不變的情況下，膜電位則取決于膜電導的改變（離子通透性的改變）。反取決于膜電導的改變（離子通透性的改變）。反過來，膜電導的大小又受到膜電位的控制（離子過來，膜電導的大小又受到膜電位的控制（離子通透性的電壓依賴性）。通透性的電壓依賴性）。5 膜電流膜電流（membrane current） 任何電流都是電容電流（任何電流都是電容電流（IcIc）和電阻）和電阻電流（電流（IrIr）兩種形式通過細胞膜，）兩種形式通過細胞

11、膜，前者導前者導致膜電荷的改變，后者實際上是由離子攜致膜電荷的改變，后者實際上是由離子攜帶流經細胞膜的。帶流經細胞膜的。 I m = Ic + IrI m = Ic + Ir5 膜電流膜電流（membrane current） 電位的變化引起膜電容的充電或放電，電位的變化引起膜電容的充電或放電，而電流的變化則表現(xiàn)在膜電阻上的電流流而電流的變化則表現(xiàn)在膜電阻上的電流流動。動。IcIc只在膜電位發(fā)生變化的一瞬間出現(xiàn)，只在膜電位發(fā)生變化的一瞬間出現(xiàn)，若將膜電位固定在一定水平，記錄到的僅若將膜電位固定在一定水平，記錄到的僅為為IiIi（IrIr），這是電壓鉗制技術的電學基），這是電壓鉗制技術的電學基礎

12、之一。礎之一。(二) 細胞膜的時間常數(shù)細胞膜的時間常數(shù)（time constant） 時間常數(shù)是指膜電壓隨時間而改變的過程，用一時間常數(shù)是指膜電壓隨時間而改變的過程，用一常數(shù)表示之。它反映膜電位在細胞膜上隨時間而改常數(shù)表示之。它反映膜電位在細胞膜上隨時間而改變的（緩慢）程度。也就是變的（緩慢）程度。也就是膜電位通過膜電阻和膜膜電位通過膜電阻和膜電容充電到電容充電到63%63%或放電到或放電到37 %37 %所需的時間。所需的時間。 = Rm = Rm Cm Cm = = 膜的時間常數(shù)膜的時間常數(shù) (ms(ms）;Rm;Rm= =膜電阻（膜電阻（kk） Cm=Cm=膜電容（膜電容（FF）的大小與

13、膜的電學性質有關，與膜的形狀無關。的大小與膜的電學性質有關，與膜的形狀無關。 (三) 細胞膜的空間常數(shù)細胞膜的空間常數(shù)（space constant）空間常數(shù)，是度量電壓的空間衰減，即標志電壓依距離而衰減的程度的一個常數(shù)。即:膜電位通過膜電阻和縱向電阻所組成的分流電路隨距離的增大而按指數(shù)曲線規(guī)律衰減的速度.或表示膜電位按指數(shù)曲線規(guī)律衰減到37%所需要的距離。細胞直徑越大，空間常數(shù)越大。 (一)、定義定義 利用負反饋原理將膜電位在空間和時間上固定利用負反饋原理將膜電位在空間和時間上固定于某一恒定的測定值，以研究動作電位產生過程中于某一恒定的測定值，以研究動作電位產生過程中的離子通透性與膜電位之間

14、的依從關系的技術。的離子通透性與膜電位之間的依從關系的技術。 電壓鉗制術是利用負反饋電路，在一定時間內電壓鉗制術是利用負反饋電路，在一定時間內將跨膜電位（將跨膜電位（TransmembraneTransmembrane Potential Potential， V Vm m），），保持在某個選定的電位水平，此電位稱為保持在某個選定的電位水平，此電位稱為保持電位保持電位（Holding potentialHolding potential，V Vh h），或者使保持電位突然），或者使保持電位突然變到某個特定的幅值的方波電位，稱為變到某個特定的幅值的方波電位，稱為鉗制電位鉗制電位（Clamping

15、 potentialClamping potential）或）或指令電位指令電位（Command Command potentialpotential，VcVc）。 (二)電壓鉗方法 電容器電流 Ic=d（CmV）/dt電阻器上電流 IR流過膜的電流總量 Idv / dt = 0 所有的電流將都是流過膜電阻的，這種電流將能反映離子的流動。 電壓源（SG）使膜電位固定在特定的水平，并以放大器（AV）記錄，該放大器與一個反饋放大器（AFB）連接，這一反饋電流通過膜，正好抵消因加電壓而引起的離子電流，通過電流監(jiān)視器測量電流。（三）電壓鉗技術的優(yōu)缺點： 很容易將膜電容電流與離子電流分開；很容易將膜電容

16、電流與離子電流分開； 可將膜電流分成不同的成分一可將膜電流分成不同的成分一I INaNa、I IK K、 Ica Ica 等（在灌流液中加入或去除某種離子）等（在灌流液中加入或去除某種離子） 能精確反映由離子通道的開放和關閉，引起能精確反映由離子通道的開放和關閉，引起的膜電導的改變，能把離子通透性變化的時間關的膜電導的改變，能把離子通透性變化的時間關系加以描述。系加以描述。 能分析離子通透性變化與膜電位的關系，在能分析離子通透性變化與膜電位的關系，在研究電壓調節(jié)通道的行為方面有很大價值。研究電壓調節(jié)通道的行為方面有很大價值。 1 1 優(yōu)點優(yōu)點 必須在細胞內插入兩個電極，對細胞必須在細胞內插入兩

17、個電極，對細胞損傷很大；損傷很大； 對體積小的細胞，實驗難以實現(xiàn)；對體積小的細胞，實驗難以實現(xiàn)； 對形態(tài)復雜的細胞，很維保持細胞膜對形態(tài)復雜的細胞，很維保持細胞膜各處電位一致；各處電位一致； 只研究一個細胞上眾多通道的綜合活只研究一個細胞上眾多通道的綜合活動規(guī)律，無法反映單個通道活動的特點動規(guī)律，無法反映單個通道活動的特點。 2 缺點缺點 :蛙坐骨神經元單個蛙坐骨神經元單個Ranvier結的電壓鉗記錄結的電壓鉗記錄（四）幾種電壓鉗方法 雙微電極法雙微電極法 單蔗糖間隙（單蔗糖間隙（Singe Sucrose Gap Singe Sucrose Gap ）法）法 雙蔗糖間隙（雙蔗糖間隙（Doub

18、le Sucrose GapDouble Sucrose Gap）法）法 雙微電極法雙微電極法 單蔗糖間隙（單蔗糖間隙（Singe Sucrose Gap Singe Sucrose Gap ）法）法 雙蔗糖間隙（雙蔗糖間隙（Double Sucrose GapDouble Sucrose Gap）法）法 圖1-2 心肌雙微電極 電壓鉗法示意圖Em ：膜電位； Ec：控制電位； Vo：鉗制電位； I：輸出電流雙微電極法雙微電極法 單蔗糖間隙（單蔗糖間隙（Singe Sucrose Gap Singe Sucrose Gap ）法）法 雙蔗糖間隙（雙蔗糖間隙（Double Sucrose Gap

19、Double Sucrose Gap）法）法 圖1-3 單蔗糖間隙法原理圖 圖1-4 雙蔗糖間隙法原理圖 Em ：膜電位； Ec：控制電位； Em ：膜電位； Ec：控制電位； Vc：鉗制電位； I：輸出電流 Vc：鉗制電位； I：輸出電流電極接觸細胞電極接觸細胞負壓吸引形成負壓吸引形成形膜囊泡形膜囊泡提起電極，囊泡與細胞脫離提起電極，囊泡與細胞脫離ABCD第三節(jié)第三節(jié) 膜片鉗制技術膜片鉗制技術 膜片鉗制技術膜片鉗制技術（patch clamp technique)patch clamp technique)是對一塊單獨的細胞膜片（或整個細胞）的是對一塊單獨的細胞膜片（或整個細胞）的電位進行鉗

20、制的一項電生理技術。電位進行鉗制的一項電生理技術。 通過對膜電位的鉗制可以觀察通過離子通過對膜電位的鉗制可以觀察通過離子通道的電流，膜片鉗放大器正是通過維持電通道的電流，膜片鉗放大器正是通過維持電壓的恒定而測出這種電流。運用膜片鉗技術壓的恒定而測出這種電流。運用膜片鉗技術記到的最小電流可達到記到的最小電流可達到pApA級級(10(10-12-12 A) A)。一一 基本原理基本原理 膜片鉗的本質屬于電壓鉗范疇，其基本膜片鉗的本質屬于電壓鉗范疇，其基本工作原理是：工作原理是：采用經典的負反饋放大技術作采用經典的負反饋放大技術作電壓固定，但改用細胞外微吸管作電極，將電壓固定，但改用細胞外微吸管作電

21、極，將微電極管尖端與細胞膜表面接觸，經負壓抽微電極管尖端與細胞膜表面接觸，經負壓抽吸，形成具極高阻抗的緊密封接，其電阻值吸，形成具極高阻抗的緊密封接，其電阻值高達高達10-10010-100千歐（即千歐（即G=10G=109 9）。只有在這）。只有在這種封接存在時，通過膜電極引導記錄的電流種封接存在時，通過膜電極引導記錄的電流才是通過該膜的離子通道電流。才是通過該膜的離子通道電流。 膜片鉗技術原理示意圖 Rs是膜片阻抗相串聯(lián)的局部串聯(lián)電阻（輸入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常為15M，如果Rseal高達10G（1010）以上時，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可為

22、在IV轉換器（點線）內的高阻抗負反饋電阻(Rf)的電壓降而被檢測出。 膜片鉗與電壓鉗的區(qū)別 膜電位鉗制的方法不同；膜電位鉗制的方法不同； 電位固定的細胞面積不同；電位固定的細胞面積不同； 研究的離子通道數(shù)目不同；研究的離子通道數(shù)目不同； (1)測量部分： (2)串聯(lián)電阻補償部分： (3)電容補償部分： (4)指令信號控制部分： (5)電源部分：膜片鉗放大器主要組成:電極電流監(jiān)視器、靈敏度開關、濾波器開關、方式選擇開關 。用于校正全細胞記錄時，由于電極和細胞內之間的通路電阻所造成的膜電位誤差 。用來補償電壓突然改變 時引起的電容電流 。將一定的電壓加入到刺激信號中，形成一指令信號的保持電壓。進行

23、電壓鉗制時，它決定膜電位值，作電流鉗制時，則決定電流值 。貼附式貼附式全細胞記錄模式全細胞記錄模式負壓吸負壓吸內面向外式內面向外式外面向外式外面向外式拉拉細胞細胞細胞細胞細胞細胞細胞細胞拉并暴露于空氣中拉并暴露于空氣中四種經典記錄模式四種經典記錄模式 (Cell-attached or On cell mode) 細胞貼附式膜片（細胞貼附式膜片（cell-attached patch） 優(yōu)點優(yōu)點：不破壞細胞的完整性，不需要胞內灌流，不影響細胞質且調制系統(tǒng)完整。可研究通過細胞對單通道的調制，也可在正常離子環(huán)境中研究遞質和電壓激活的單通道活動。 缺點缺點： 不能改變細胞內成分，也不能精確測定膜電位

24、。同時由于許多細胞膜上存在有牽張激活的離子通道，細胞膜與電極間輕微的張力變化往往會增加記錄的背景噪聲。 于細胞牢固貼附于微管電極的尖由端而得名。它可用于記錄各種細胞的單通道電流，而且是在細胞完整無損的狀態(tài)下研究通道的活動。 細胞細胞電極電極細胞膜細胞膜胞外液胞外液胞內液內面向外式膜片 (inside-out patch) 細胞貼附式膜片形后，提起電極時，與電極尖端相接的細胞膜被撕脫下來開成小泡，將電極尖端在空氣中暴露幾秒鐘后小泡很快破裂，形成胞漿側向外的內面向外式膜片。 特點特點：較易改變細胞內的離子或物質濃度，也能把酶等直接加入膜的內側面，適宜研究胞內物質對通道活動的影響。但實驗中改變膜外側

25、物質困難，且需侵入低鈣液中，以免小泡形成。應用：應用：可研究胞內信使物質cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等對受體型通道的調節(jié)，以及胞內激素對通道的調節(jié)。這種方式可使通道與細胞的調節(jié)機制脫耦聯(lián)，使第二信使直接作用于膜內，引起通道開閉。 電極脂質雙分子層的脂質雙分子層的內內面面向浴液面面向浴液 外面向外式膜片(outside out patch) 細胞貼附式膜片形成后，向微管電極內給予較強的負壓將膜片吸破，再將電極從細胞膜上拔起，但不暴露于空氣中，被撕脫下來的膜便形成外面向外式膜片。優(yōu)點：優(yōu)點： 缺點：缺點： 應用：應用： 可以任意改變胞外物質的濃度，有利于研究遞質對膜離子通道外

26、側面的作用。 實驗中難以改變胞內成分，電極管必須充以低鈣溶液以防小泡形成。 可研究腺苷酸環(huán)化酶、蛋白激酶C等活性變化，以及細胞膜上信使物質二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等對受體型的離子通道研究。 Patch-pipette脂質雙分子層的脂質雙分子層的外外面面向浴液面面向浴液全細胞記錄構型 (whole cell recording) 記錄的電流屬于宏觀電流（macroscopical current），是整個細胞離子通道活動形成的總和電流。若采用膜片鉗放大器內的電流鉗模式，還可以記錄細胞的靜息電位和動作電位。 特點：特點： 電極管內與細胞之間彌散交換與平衡快，因而容易控制細胞內液的成分

27、；記錄的是許多通道的綜合電流，需改變內部介質以分離電流；適合于對小細胞的電壓鉗位，對直徑大于30m的細胞很難實現(xiàn)鉗制；該方法使電生理研究的重點從無脊椎動物大細胞中解脫出來，而向人類和哺乳類細胞發(fā)展。細胞細胞電極電極細胞膜細胞膜 膜片鉗制技術記錄方式膜片鉗制技術記錄方式 穿孔膜片記錄技術（perforated patch recording technique） HomHom和和MartyMarty于于19881988年首次建立了一種對年首次建立了一種對傳統(tǒng)全細胞記錄法改進的方法，該方法是基傳統(tǒng)全細胞記錄法改進的方法，該方法是基于某些抗生素如于某些抗生素如制霉菌素制霉菌素（NystatinNys

28、tatin），），兩兩性霉素性霉素B B（AmphotericinAmphotericin B B）等具有在生物）等具有在生物膜上形成通透性孔道的特性，將這類抗生素膜上形成通透性孔道的特性，將這類抗生素充灌在電極液中，在形成高阻封接后，可使充灌在電極液中，在形成高阻封接后，可使電極液與細胞內液在電學上相通，因而稱作電極液與細胞內液在電學上相通，因而稱作穿孔膜片記錄技術。穿孔膜片記錄技術。 穿孔膜片及穿孔囊泡記錄模式穿孔膜片及穿孔囊泡記錄模式（Perforated patch and perforated vesicle mode）制霉菌素制霉菌素形成的孔道形成的孔道電極電極受體受體離子通道離子

29、通道提起電極提起電極胞漿胞漿穿孔囊泡穿孔囊泡(外面向外式外面向外式) 穿孔膜片穿孔膜片(緩慢全細胞式緩慢全細胞式)技術點的優(yōu)缺點優(yōu)點：與全細胞記錄相比，該技術相比有如下優(yōu)點 由抗生素形成的孔道對于等于或大于葡萄糖的分子均不能通過。因此，在全細胞記錄時可避免對胞內重要物質的滲析影響，通道電流衰減現(xiàn)象顯著減慢，那些對細胞內通訊及通道調控具有重要作用的第二信使物質仍可正常運行。 因抗生素形成的孔道對多價離子不通透，故胞內的這些離子的濃度就不受電極液的影響。因此可在全細胞電流記錄的同時用Ca2+染料測定胞內游離的Ca2+水平 對細胞的損傷作用明顯小于微電極細胞內記錄及膜片鉗全細胞記錄，記錄時間可持續(xù)3

30、小時。 高阻封接不易被破壞，而全細胞記錄的負壓脈動式抽吸和電壓脈沖易致高阻封接破壞。電極串聯(lián)電阻較低，膜電容更易補償。缺點： 無法使電極液中的大分子與胞內物質交換。因此研究大分子物質對胞內機制的作用就不能進行。 由于電極液與胞內液之間存在Donnan平衡，因此電極液內必須有與細胞內相同濃度的不通透陰離子和Cl-，否則將導致Cl-流出或流入細胞，使陰離子和水重新平衡，最終導致細胞體液變化。 穿孔所需時間較全細胞法長。 濃度鉗（concentration clamp） 用改變灌流液的方法來改變細胞內液或外用改變灌流液的方法來改變細胞內液或外液中某種化學成分和濃度。人工地控制膜內液中某種化學成分和濃

31、度。人工地控制膜內或膜外的溶液成分，并在瞬間階梯式地改變或膜外的溶液成分，并在瞬間階梯式地改變某種化學物質的濃度，這種技術就是某種化學物質的濃度，這種技術就是濃度鉗濃度鉗，也稱為也稱為化學鉗化學鉗（chemical clamipchemical clamip）, ,或稱或稱濃濃度跳變度跳變(concentration jump)(concentration jump)。 人工脂膜的膜電流記錄人工脂膜的膜電流記錄 把構成細胞膜的脂質分子散布于水表面時，很容易形成親水端向下脂質單分子層，將單分子層背靠背地折疊起來，就形成類似細胞膜結構的人工脂質雙層。純的脂質雙層幾乎是絕緣的，但是將含有通道蛋白的脂

32、質小泡融入人工脂膜或將水溶性通道蛋白直接插入人工脂質雙層，便可利用膜片鉗技術記錄到單通道電流。 三三 膜片鉗記錄的基本步驟膜片鉗記錄的基本步驟 （一）、液體配制（一）、液體配制 主要根據(jù)研究通道的不同，所用細胞的主要根據(jù)研究通道的不同，所用細胞的不同，配制相應的液體，基本原則是保持不同，配制相應的液體，基本原則是保持2 2個個平衡，滲透壓平衡和酸堿平衡。另外，所有平衡，滲透壓平衡和酸堿平衡。另外，所有液體在使用前必須過濾，以保持液體潔凈。液體在使用前必須過濾，以保持液體潔凈。 （二）、標本制備 膜片鉗實驗一般是在單個細胞上進行。實驗用單細胞主要來自培養(yǎng)細胞或急性酶分離的細胞，也可來自腦片細胞中

33、的原位細胞。常用的酶是膠原酶和蛋白酶，單獨或聯(lián)合使用，有些組織還要加用其它酶，如彈性纖維酶等。v 豚鼠心室肌細胞急性酶分離方法 v 腸系膜動脈平滑肌細胞分離 （三）、微管電極的制備（三）、微管電極的制備 一般采用常規(guī)二步法完成，電極尖端直徑在12m之間，拋光與涂布液體硅酮樹酯后，充灌電極液。1 1、微管電極拉制、微管電極拉制 2 2、電極熱拋光、電極熱拋光 3 3、緣樹脂涂抹、緣樹脂涂抹 4 4、電極液充灌、電極液充灌 （四）、高阻抗封接形成（四）、高阻抗封接形成 1在恒溫條件下，將細胞貼壁良好的載玻片移入有浴液的浴槽中。浴槽不能太深，以盡量減少電極進入浴液的深度，從而減少浮游電容；2倒置相差

34、顯微鏡下選擇立體感強、活性好的細胞進行實驗；3使用新拉制的微管電極，用細塑料管以反充灌方式灌電極液入電極尖端，若含有氣泡，可手持微電極使其尖端朝下，用手指敲彈幾下管壁即可排除，然后再將微電極安裝在探頭上。4 4 當微管電極在微推進器幫助下進入浴液時，當微管電極在微推進器幫助下進入浴液時，用注射器向電極施加一正壓（用注射器向電極施加一正壓（12cm12cmH H2 2O O），），以防液氣表面顆粒堵塞微管電極尖端；調節(jié)放以防液氣表面顆粒堵塞微管電極尖端；調節(jié)放大器上大器上pipette offsetpipette offset旋鈕，將電極電壓補償旋鈕，將電極電壓補償?shù)搅?。同時由膜片鉗放大器向微管

35、電極發(fā)放到零。同時由膜片鉗放大器向微管電極發(fā)放電壓為電壓為5mV5mV、波寬、波寬40ms40ms的方波脈沖信號，用于的方波脈沖信號，用于觀察封接過程；觀察封接過程；5 5微推進器將微管電極送入到即將接觸細胞時，撤微推進器將微管電極送入到即將接觸細胞時，撤去正壓，并繼續(xù)向選定的細胞表面推進，當電極尖去正壓，并繼續(xù)向選定的細胞表面推進，當電極尖端輕觸到細胞表面時其應答電流變小，這時只要給端輕觸到細胞表面時其應答電流變小，這時只要給微管電極尖端管腔內施加一負壓（微管電極尖端管腔內施加一負壓（1020cm H1020cm H2 2O O），），若在計算機屏幕上看到應變電流突然下降至零，電若在計算機屏

36、幕上看到應變電流突然下降至零，電流噪聲隨之減少，則提示微管電極尖端與細胞形成流噪聲隨之減少，則提示微管電極尖端與細胞形成近似電絕緣，其阻抗約近似電絕緣，其阻抗約10100G10100G，說明，說明高阻抗封接高阻抗封接（gigagiga seal seal）形成，這時的膜片為細胞貼附式膜片。）形成，這時的膜片為細胞貼附式膜片。在此基礎上，根據(jù)不同的實驗要求，再制成不同類在此基礎上，根據(jù)不同的實驗要求，再制成不同類型的膜片構型。型的膜片構型。保證高阻封接要點：保證高阻封接要點： 電極電阻適當；電極電阻適當； 電極尖端清潔；電極尖端清潔； 負壓抽吸系統(tǒng)密閉；負壓抽吸系統(tǒng)密閉； 電極與細胞相貼適度；電

37、極與細胞相貼適度； 細胞膜清潔，活性好。細胞膜清潔，活性好。 膜片鉗記錄系統(tǒng)示意圖膜片鉗記錄系統(tǒng)示意圖灌流槽In bathPushed against cellMore pressure against cellSealGo whole cell（五）、數(shù)據(jù)采集與分析（五）、數(shù)據(jù)采集與分析 實驗中通道電流信號經膜片鉗放大器放大后再經實驗中通道電流信號經膜片鉗放大器放大后再經1212位位A/DA/D、D/AD/A轉換器輸入計算機用于電流信號采集，轉換器輸入計算機用于電流信號采集，系統(tǒng)連接如下圖所示：系統(tǒng)連接如下圖所示： 分析的內容分析的內容 1 1、宏觀電流的分析、宏觀電流的分析 宏觀電流（宏觀

38、電流（macroscopicalmacroscopical current current）是指）是指膜上許多通道同時開放形成的離子電流膜上許多通道同時開放形成的離子電流，是，是由許多單通道電流總和形成的。應用電壓鉗由許多單通道電流總和形成的。應用電壓鉗技術在單細胞或多細胞標本上記錄的電流和技術在單細胞或多細胞標本上記錄的電流和膜片鉗全細胞模式記錄的電流都屬宏觀電流。膜片鉗全細胞模式記錄的電流都屬宏觀電流。（1 1）、通道的藥理學特性）、通道的藥理學特性 通道的藥理學特性是通道分類的重要依據(jù)，許通道的藥理學特性是通道分類的重要依據(jù)，許多通道具有多通道具有特異性阻滯劑特異性阻滯劑和和激動劑激動劑

39、（或開放劑）。（或開放劑）。TTXTTX鈉通道特異性阻滯劑，鈉通道特異性阻滯劑，TEATEA鉀通道特異性阻滯劑，鉀通道特異性阻滯劑，CromakilinCromakilinATPATP敏感鉀通道特異性開放劑敏感鉀通道特異性開放劑 利用它們可以區(qū)分膜電流的成分，有助于確利用它們可以區(qū)分膜電流的成分，有助于確認通道的種類。認通道的種類。 （2 2）、通道的門控特性）、通道的門控特性 通道的通道的門控性門控性主要是指主要是指電壓門控通道的激活與失電壓門控通道的激活與失活對電壓和時間的依賴性?；顚﹄妷汉蜁r間的依賴性。典型的電壓門控通道的典型的電壓門控通道的活動包括激活過程和失活過程?；顒影せ钸^程和

40、失活過程。鈉通道門控的H-H模型 （3 3）、通道的電流）、通道的電流電壓關系電壓關系 通道的電流通道的電流電壓關系（電壓關系（current-voltage current-voltage relationship, relationship, 簡稱簡稱I-VI-V曲線曲線）是反映離子通道）是反映離子通道動力學性質的重要參數(shù)動力學性質的重要參數(shù), ,可分析通道的激活過程、可分析通道的激活過程、反轉電位、整流特性和離子選擇性等。反轉電位、整流特性和離子選擇性等。 要獲得要獲得I-VI-V曲線，需要給予連續(xù)變化的階躍曲線，需要給予連續(xù)變化的階躍式脈沖電壓。式脈沖電壓。、通道整流特性的分析、通道整

41、流特性的分析 通道通道I-VI-V關系曲線與橫坐標的交點是該通道電關系曲線與橫坐標的交點是該通道電流的流的反轉電位反轉電位V Vrevrev或稱或稱零電流電位零電流電位。通道的整流特。通道的整流特性則是指通道電流對膜電位的依賴性，通?？捎眯詣t是指通道電流對膜電位的依賴性，通常可用I-I-V V關系予以判斷。關系予以判斷。通道的電流電壓關系曲線 l 整流（Rectification） 電流和電壓的關系不滿足歐姆定律的直線關系。原因是離子通道的開放導致膜電阻迅速降低。整流現(xiàn)象是許多離子通道的特點。有整流有整流無整流無整流V=IRcV=IRv離子通道不開放時離子通道不開放時膜的被動反應膜的被動反應離

42、子通道開放時離子通道開放時膜的主動反應膜的主動反應v 外向整流外向整流隨膜電位的去極化，隨膜電位的去極化，I-V曲線明顯向曲線明顯向Y軸（電流軸）軸（電流軸）靠近靠近。如。如IK電流。電流。v 內向整流內向整流隨膜電位的去極化，隨膜電位的去極化，I-V曲線明顯向曲線明顯向X軸（電壓軸）軸（電壓軸）靠近靠近。如煙堿電流。如煙堿電流。 IK電流的外向整流電流的外向整流煙堿電流的內向整流煙堿電流的內向整流去極化方向去極化方向去極化方向去極化方向、通道離子選擇性的分析、通道離子選擇性的分析 如果通道的離子選擇性很高，只能或主要如果通道的離子選擇性很高，只能或主要通過一種離子，則通過一種離子，則V Vr

43、evrev應等于或接近該離子的應等于或接近該離子的平衡電位。平衡電位。如果通道通過多種離子，則可利用如果通道通過多種離子，則可利用改變膜兩側某種離子濃度差以后的改變膜兩側某種離子濃度差以后的V Vrevrev變化來變化來判斷膜電流中是否的該離子成分。例如判斷膜電流中是否的該離子成分。例如I If f通道通道的的I-VI-V曲線隨曲線隨NaNa。的增高而右移，。的增高而右移，V Vrevrev相應變相應變正，說明正，說明I If f通道對鈉離子有通透性。通道對鈉離子有通透性。2 2、單通道電流的分析、單通道電流的分析（1 1）、通道門控動力學的分析）、通道門控動力學的分析 典型的單通道電流（典型

44、的單通道電流（single channel currentsingle channel current）呈一種振幅相同而持續(xù)時間不等的脈沖樣變化。呈一種振幅相同而持續(xù)時間不等的脈沖樣變化。它有兩個電導水平，即它有兩個電導水平，即0 0和和1 1，分別對應關閉和開，分別對應關閉和開放狀態(tài)。放狀態(tài)。 A：豚鼠心室肌內向整流鉀通道的單通道電流； B：同一膜片上通道開放（上）和關閉（下）時間頻數(shù)分布直方圖。 （2 2）、單通道電導的測定）、單通道電導的測定 在幾個不同的鉗制電位下記錄膜片上單在幾個不同的鉗制電位下記錄膜片上單通道電流，右圖為得到單通道的通道電流，右圖為得到單通道的I-VI-V曲線，曲曲線，曲線斜率即單通道電導。線斜率即單通道電導。 蛙骨骼肌細胞貼附式膜片的記錄 A：不同鉗制電位下記錄的N2型乙酰膽堿受體陽離子通道電流，左側數(shù)字為膜電位（mV）。B：單通道電流的IV關系，膜電導32pS。l I-V曲線（曲線（Current-voltage curve）電流電流-電壓關系曲線?？煞从惩ǖ赖娜缦聞恿W參數(shù)：電壓關系曲線。可反映通道的如下動力學參數(shù)：v 激活過程激活過程v 閾電位閾電位v 反轉電位反轉電位v 整流特性整流特性 I(nA)Ca2+o =5.0mM-8-6