微生物學(xué)：第五章微生物培養(yǎng)與生長第三節(jié)

1、第三節(jié) 微生物生長規(guī)律 微生物的生長表現(xiàn)在微生物的個(gè)體生長與群體生長兩個(gè)水平上。 微生物個(gè)體生長表現(xiàn)為個(gè)體質(zhì)量和體積的增加。 微生物群體生長是以微生物細(xì)胞的數(shù)量或微生物群體細(xì)胞物質(zhì)量的增加作為生長的指標(biāo)。 因而要了解微生物的生長規(guī)律，就要了解微生物的個(gè)體生長和群體生長兩個(gè)方面。單細(xì)胞微生物個(gè)體生長表現(xiàn)為細(xì)胞體積的增加 和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量的增加兩個(gè)方面, 當(dāng)細(xì)胞生長到一定時(shí)期，就分裂成為兩個(gè)子細(xì)胞。多細(xì)胞微生物個(gè)體生長則反映在構(gòu)成個(gè)體的細(xì)胞數(shù)目增加和每個(gè)細(xì)胞個(gè)體生長兩個(gè)方面。一、微生物的個(gè)體生長 （一）微生物個(gè)體生長的測定方法 細(xì)菌個(gè)體細(xì)胞一般太小，通常采用電子顯微鏡觀測，但無法觀測到整個(gè)生長的動

2、態(tài)過程。 真菌細(xì)胞相對體積較大，可采用顯微鏡觀測和記錄活細(xì)胞的整個(gè)生長過程，如使用微分干涉相差顯微鏡、相差顯微鏡和熒光顯微鏡等進(jìn)行。 （二）細(xì)菌細(xì)胞的生長 1、細(xì)菌細(xì)胞生長的兩種類型： 根據(jù)細(xì)胞是否在分裂發(fā)生之前就啟動新一輪DNA復(fù)制而將細(xì)菌細(xì)胞生長分為快速生長和慢速生長兩種類型。 復(fù)制區(qū)圖 4-1 細(xì)菌細(xì)胞生長分裂蛋白和 橫隔前體成分橫隔形成細(xì)胞分裂間隙期G染色體復(fù)制期C分裂期D2、細(xì)菌細(xì)胞分裂周期過程：間隙期G（gap phase）、染色體復(fù)制期C（chromosome replication phase）、分裂期D （division phase）3、細(xì)胞周期各期啟動機(jī)制（以大腸桿菌為例

3、）： DNA復(fù)制啟動：細(xì)胞必須達(dá)到某一閾值體積或起始物質(zhì)量。細(xì)胞分裂期D啟動：只有當(dāng)細(xì)胞達(dá)到某一閾值長度后才能進(jìn)行染色體分離，分裂成為兩個(gè)細(xì)胞。 DNA復(fù)制啟動達(dá)到生物量閾值DNA復(fù)制與分離 達(dá)到長度閾值分開的DNA拷貝細(xì)胞分裂過程啟動時(shí)間（min）4、細(xì)胞壁的合成方式“背靠背合成” 方式：如鏈球菌和某些G+球菌 “分散合成”方式：大腸桿菌等G-桿菌 橫隔形成區(qū)圖4-2 細(xì)菌細(xì)胞壁的合成方式（三）酵母細(xì)胞的生長1、細(xì)胞二分裂生長圖 4-3 粟酒裂殖酵母的二分裂生長2、細(xì)胞出芽生長圖 4-4 釀酒酵母的出芽生長（四）絲狀真菌細(xì)胞的頂端生長圖 4-6 絲狀真菌菌絲細(xì)胞頂端生長模型圖4-5 Sapr

4、olegnia ferax 菌絲的頂端生長0:001:00為什么要研究微生物群體生長? 因?yàn)榻^大多數(shù)微生物個(gè)體微小，個(gè)體質(zhì)量和體積的變化不易觀察，所以常是以微生物的群體作為研究對象，以微生物群體細(xì)胞的數(shù)量或群體細(xì)胞物質(zhì)量的增加作為生長的指標(biāo)。二微生物的群體生長（一）微生物群體生長的測定方法測定群體微生物細(xì)胞數(shù)目的增加測定群體微生物細(xì)胞物質(zhì)量的增加（1）總細(xì)胞計(jì)數(shù)法1、微生物細(xì)胞數(shù)目 的檢測方法 血球計(jì)數(shù)板法薄膜過濾丫叮橙染色熒光鏡檢法平皿菌落計(jì)數(shù)法（2）活細(xì)胞計(jì)數(shù)法薄膜過濾平皿計(jì)數(shù)法2、微生物生物量的測定方法（1）濕重法 收集微生物菌體，或?qū)⑽⑸锱囵B(yǎng)液離心，收集細(xì)胞沉淀物，然后稱重。（2）干

5、重法 將微生物菌體或離心得到的細(xì)胞沉淀物置100105的烘箱中干燥至水份去除，然后再稱重。（3）細(xì)胞成分含量法 如蛋白質(zhì)、還原糖、總糖、核酸等含量的測定。因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞成分的含量是一定的，單位體積培養(yǎng)液中微生物群體細(xì)胞數(shù)目越多，總的細(xì)胞成分的含量就越多。3、比濁法微生物生長測定方法比較測定細(xì)胞數(shù)目方法特點(diǎn)與應(yīng)用總細(xì)胞數(shù)血球計(jì)數(shù)板法 較快速簡便，但較費(fèi)時(shí)薄膜過濾染色法 快速簡便，適于含菌數(shù)很低的空氣、水等中的總菌計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù) 平皿菌落計(jì)數(shù)法 簡易價(jià)廉，但花費(fèi)時(shí)間較長，不能立刻知道結(jié)果薄膜過濾平皿法 靈敏度高, 不用于高密度培養(yǎng)物，不能立刻知道結(jié)果測定物質(zhì)量比濁法 快速簡便，敏感度低，適于不發(fā)酵液或

6、液體中的快速 總細(xì)胞數(shù)估計(jì)，但需事先標(biāo)定細(xì)胞濕重法 較為簡便，但含水量不定，準(zhǔn)確度差細(xì)胞成分含量法 如測定蛋白質(zhì)、核酸、還原糖的含量等細(xì)胞干重法 較為費(fèi)時(shí)，易受顆粒雜質(zhì)干擾，敏感度低（二）無分支單細(xì)胞微生物的群體生長 無分支單細(xì)胞微生物主要包括原核生物的細(xì)菌和真核生物的酵母菌，它們的群體生長是以群體中微生物細(xì)胞數(shù)量的增加來表示的，因而其生長速率就是指單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞生物量的增加。 細(xì)胞呈指數(shù)增長示例特征:每經(jīng)歷一個(gè)代時(shí)，細(xì)胞的數(shù)目就增加1倍，呈指數(shù)增加，因而被稱為指數(shù)生長，這就是無分支單細(xì)胞微生物的群體生長特征。 1. 無分支單細(xì)胞微生物群體生長的特征 細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)與生長時(shí)間呈正比直

7、線關(guān)系指數(shù)生長公式：Nt= N02n lgNt=lgN0+nlg2 n = lgNt-lgN0 = lgNt-lgN0 lg2 0.301式中N0為起始細(xì)胞數(shù)目，Nt為指數(shù)生長某個(gè)時(shí)刻t時(shí)的細(xì)胞數(shù)目，n為世代數(shù)。N0、Nt和t可由實(shí)驗(yàn)獲得，n可通過上式計(jì)算得出。 世代：由1個(gè)細(xì)胞分裂成為2個(gè)細(xì)胞的間隔被稱為世代。代時(shí)：就是一個(gè)世代所需的時(shí)間，因而也就是群體細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)大1倍所需的時(shí)間，有時(shí)也被稱為倍增時(shí)間。 2、微生物生長曲線1）延滯期延滯期特點(diǎn) 生長速率等于零細(xì)胞合成新的成分 補(bǔ)充消耗的材料 適應(yīng)新的培養(yǎng)基或別的培養(yǎng)條件 細(xì)胞形態(tài)變大或變長 對外界不良環(huán)境敏感影響延滯期長短的因素與實(shí)踐意義 接

8、種齡: 對數(shù)期“種子”，延滯期較短； 延滯期或衰亡期“種子”,延滯期 較長； 接種量： 接種量大，延滯期較短； 接種量小，延滯期較長； 培養(yǎng)基成分:培養(yǎng)基成分豐富的， 延滯期較 短； 培養(yǎng)基成分與種子培養(yǎng)基一致, 延滯期較短；2）指數(shù)期特點(diǎn) 生長速率最快，細(xì)胞呈指數(shù)增長 生長速率恒定 代謝旺盛，細(xì)胞成分平衡發(fā)展 群體的生理特性較一致影響指數(shù)期的因素 菌種： 不同菌種的代時(shí)差異極大 營養(yǎng)成分：營養(yǎng)越豐富，代時(shí)越短 營養(yǎng)物濃度：影響微生物的生長速率和總生長量 培養(yǎng)溫度：影響微生物的生長速率指數(shù)期的實(shí)踐意義 是代謝、生理研究的良好材料 是增殖噬菌體的最適宿主菌齡 是發(fā)酵生產(chǎn)中用作“種子”的最佳種齡

9、G+染色鑒定時(shí)采用此期微生物3）穩(wěn)定期特點(diǎn)： 活細(xì)胞總數(shù)維持不變，即新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，菌體總數(shù)達(dá)到最高點(diǎn)。細(xì)胞生長速率為零細(xì)胞生理上處于衰老，代謝活力鈍化，細(xì)胞成分合成緩慢， G+染色發(fā)生變化。為什么細(xì)胞總數(shù)不再增加？ 營養(yǎng)物質(zhì)被消耗不能滿足生長需要 代謝廢物或有害物質(zhì)積累到抑制生長水平 pH、氧化還原勢等物化條件越來越不適應(yīng)穩(wěn)定期的實(shí)踐意義 是發(fā)酵生產(chǎn)中以菌體為終產(chǎn)品的最佳收獲期； 某些代謝產(chǎn)物特別是次生代謝產(chǎn)物發(fā)生在此階段，某些細(xì)菌的芽孢也發(fā)生在此階段，故又稱作代謝產(chǎn)物合成期； 導(dǎo)致了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝技術(shù)的改進(jìn)。4）衰亡期特點(diǎn)： 細(xì)胞以指數(shù)速率死亡， 有時(shí)細(xì)胞死亡速

10、率降低是由于抗性細(xì)胞的積累； 細(xì)胞變形退化，有的發(fā)生自溶，G+染色發(fā)生變化。影響衰亡期的因素及實(shí)踐意義與菌種的遺傳特性有關(guān): 有些細(xì)菌的培養(yǎng)經(jīng)歷所有的各個(gè)生長時(shí)期，幾天以后死亡, 有些細(xì)菌培養(yǎng)幾個(gè)月乃至幾年以后仍然有一些活的細(xì)胞；與是否產(chǎn)芽孢有關(guān)：產(chǎn)芽孢的細(xì)菌更易于幸存下來；與營養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)有關(guān)：補(bǔ)充營養(yǎng)和能源，以及中和環(huán)境毒性，可以減緩死亡期細(xì)胞的死亡速率，延長細(xì)菌培養(yǎng)物的存活時(shí)間。Fig.1. A time course of induced cultivation of Comamonas testosteroni JA1. The cultivation was conducted

11、 in a 250-mL flask containing 50mL of medium I with 1 % (w/v) of nicotinic acid(煙酸）). (), cell growth (OD610nm); (),6-hydroxynicotinic acid; and (), nicotinic acid were assayed with time.（三）絲狀微生物的群體生長 絲狀微生物包括具分支的原核生物放線菌和真核生物絲狀真菌。 1. 絲狀微生物群體生長的特征這類微生物在液體培養(yǎng)基中雖然也可以幾乎均勻分布的菌絲懸浮液的方式生長（絲狀生長）。但大多數(shù)情況下是以分散的沉淀

12、物方式在發(fā)酵液中出現(xiàn)（沉淀生長），沉淀物形態(tài)從松散的絮狀沉淀到堆集緊密的菌絲球不等。 起始培養(yǎng)時(shí)菌絲體培養(yǎng)18小時(shí)后的菌絲體圖示絲狀真菌的沉淀生長影響因素：接種體積的大小、接種物是否凝集、以及菌絲體是否易于斷裂等因素的綜合作用決定著絲狀微生物是絲狀生長還是沉淀生長。工業(yè)發(fā)酵意義：絲狀微生物在液體培養(yǎng)中的生長方式在工業(yè)生產(chǎn)中很重要，因?yàn)樗绊懓l(fā)酵過程的通氣性、生長速率、攪拌能耗及菌絲體與發(fā)酵液的分離難易等。2. 絲狀微生物群體生長曲線絲狀微生物的群體生長有著與單細(xì)胞微生物類似的規(guī)律。三、 連續(xù)培養(yǎng)（一）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)分批培養(yǎng)，就是指將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲的

13、培養(yǎng)方式。連續(xù)培養(yǎng)，基本上說來就是在一個(gè)恒定容積的流動系統(tǒng)中培養(yǎng)微生物，一方面以一定速率不斷地加入新的培養(yǎng)基，另一方面又以相同的速率流出培養(yǎng)物（菌體和代謝產(chǎn)物），以使培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)保持恒定，即處于穩(wěn)態(tài)。 （二）連續(xù)培養(yǎng)類型 恒化培養(yǎng)裝置恒濁培養(yǎng)裝置四、微生物的同步生長與同步培養(yǎng) 在微生物生長研究中，常常需要了解單個(gè)細(xì)胞在生長的不同階段（主要是指細(xì)胞分裂周期）所發(fā)生的生理生化變化，以便搞清微生物個(gè)體生長的規(guī)律。這就需要使被研究的微生物群體處于相同的生長階段，以便所得到的結(jié)果能反映出單個(gè)細(xì)胞在不同生長階段的生理特征。同步生長：就是指在培養(yǎng)物中所有微生物細(xì)胞都處于同一生長階段，并都能同時(shí)分裂的生長方式。同步培養(yǎng)法：就是能使培養(yǎng)物中所有微生物細(xì)胞都處于相同的生長階段的培養(yǎng)方法。(一) 誘導(dǎo)法誘導(dǎo)法：是采用物理、化學(xué)因子使微生物細(xì)胞生長進(jìn)行到某個(gè)階段而停下來，使先期到達(dá)該階段的微生物細(xì)胞不能進(jìn)入下一生長階段，待全部群體細(xì)胞都到達(dá)該生長階段后，再除去該因子，使全部群體細(xì)胞同時(shí)進(jìn)入下一個(gè)生長階段，以達(dá)到誘導(dǎo)微生物細(xì)胞同步生長的目的。 例，