生物化學(xué)與分子生物學(xué)：過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定

1、1過(guò)氧化氫酶Km的測(cè)定2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握Km值的概念，作圖法求Km的常用方法。2.掌握過(guò)氧化氫酶Km測(cè)定的原理和操作方法。 v為反應(yīng)速度 S為底物濃度vmax為最大反應(yīng)速度Km為米氏常數(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理（1.Hanes-Woolf作圖法）米氏方程表示底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的速度有很大的影響。米氏常數(shù)KmKm等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。Km表示酶和底物之間的親和能力， Km值越大，親和能力越弱，反之亦然。對(duì)于每一個(gè)酶促反應(yīng)，在一定條件下都有其特定的Km值，因此可用于鑒別酶。 問(wèn)題：如何測(cè)定酶的Km值? 1 Km 1 1 =

2、. + v Vmax S Vmax S Km S = + v Vmax Vmax 兩邊取倒數(shù)兩邊乘以S 令S/v=y, S=x y=b+axS VSS v-Km0Km VmaxHanes-Woolf 作圖法二、實(shí)驗(yàn)原理（2.過(guò)氧化氫酶Km測(cè)定）過(guò)氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分子氧，鐵起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫既是氧化劑又是還原劑。 2H2O2 2H2O+O2CAT8 H2O2濃度可用KMnO4在硫酸存在下滴定測(cè)知。2KMnO45H2O23H2SO4 2MnSO4K2SO45O28H2O 求出反應(yīng)前后H2O2的濃度差即為反應(yīng)速度（V）。雙倒數(shù)作圖法求出過(guò)氧

3、化氫酶的米氏常數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理（2.過(guò)氧化氫酶Km測(cè)定）三、實(shí)驗(yàn)步驟 l血液稀釋?zhuān)何⌒迈r（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸餾水稀釋至10ml。取1ml，用磷酸鹽緩沖液(pH7.0，0.2mol/L)稀釋至10ml，得1:1000稀釋血液。2H2O2濃度的標(biāo)定：取潔凈錐形瓶?jī)芍?，各加濃度約為0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分別用0.004mol/L KMnO4滴定至微紅色。從滴定用去KMnO4ml數(shù)，求出H2O2的mol濃度，求平均值。加入物(ml) 12345H2O2(約0.05mol/L) 0.51.01.52.02.5蒸餾水 3.02.52.01.

4、51.0血液稀釋液0.5(0min)0.5(1min)0.5(2min)0.5(3min)0.5(4min)37度保溫5分鐘25硫酸2.0(5min)2.0(6min)2.0(7min)2.0(8min)2.0(9min)0.004mol/L高錳酸鉀3反應(yīng)速度的測(cè)定：取干燥潔凈50ml錐形瓶5只，編號(hào)，按下表操作。依次加入1：1500稀釋血液每瓶0.5ml，邊加邊搖，反應(yīng)時(shí)間確保5min，按順序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，邊加邊搖，使酶促反應(yīng)立即終止。最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微紅色（5個(gè)反應(yīng)瓶的滴定標(biāo)準(zhǔn)要統(tǒng)一?。?，記錄KMnO4消耗量(ml)。 H2O2標(biāo)定的

5、濃度：0.004 高錳酸鉀消耗的ml數(shù)(5/2)/22. 反應(yīng)速度的計(jì)算：以反應(yīng)消耗的H2O2 mmol數(shù)表示。反應(yīng)速度=加入的H2O2 mmol數(shù)剩余的H2O2 mmol數(shù)即：H2O2 mol濃度加入的毫升數(shù)KMnO4 0.004 mol/L消耗的KMnO4毫升數(shù) 5/2（式中：5/2為KMnO4與H2O2反應(yīng)中mol換算系數(shù)）四、結(jié)果計(jì)算計(jì)算程序12345加人H2O2數(shù)0.501.001.502.002.50加人H2O2mmol=0.080.040.080.120.160.20底物濃度S=50.010.020.030.040.05酶作用后，KMnO4滴定ml1.353.706.409.8013.20剩余H2O2mmol=0.0045/20.01350.0370.0640.0980.132反應(yīng)速度V=一0.02650.0430.0560.0620.068按前述方法作圖求得Km3.210-2mol/L。3求Km值：己知KMnO4為0.004mo1/L，標(biāo)定出H2O2濃度為0.08mol/L，列表計(jì)算如下：五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 l過(guò)氧化氫標(biāo)定濃度的計(jì)算：寫(xiě)出高錳酸鉀的用量以及計(jì)算過(guò)程2. P132 表3. 根據(jù)底物濃度、反應(yīng)速率，利用Hanes-Woolf作圖法作圖，并求出Km。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)論 l. 分析結(jié)果2. 思考題P133（1），（2