7 高等動物基因工程

1、7 高等動物基因工程1世界上第一只成年體細(xì)胞克隆羊“多利 2多利的基因母親 普通白綿羊 乳腺細(xì)胞 細(xì)胞核 剔除了細(xì)胞核的蘇格蘭黑臉羊的卵子科學(xué)家當(dāng)時一共培育了277個胚胎,最后只有多利成功出生。體細(xì)胞克隆技術(shù)的低成功率,一直到現(xiàn)在也沒有明顯改善。克隆動物是否會早衰,是否可能有先天缺陷,是否應(yīng)當(dāng)允許科學(xué)家進(jìn)行以培育完成人類個體為目標(biāo)的克隆人研究,都是當(dāng)前爭論的熱點問題。多利的健康狀況因此受備關(guān)注。多利簡介移植到第三頭羊融合、分裂、發(fā)育成胚胎3全球首只人羊嵌合體。英國媒體24日報道說,科研人員已經(jīng)創(chuàng)造出全球首只人羊嵌合體,有望給需要器官移植的患者帶來福音。英國每日郵報報道說,美國內(nèi)華達(dá)大學(xué)教授伊斯

2、梅爾。贊賈尼歷經(jīng)7年研究,最終利用向綿羊胚胎注射人體干細(xì)胞的技術(shù),成功培育出一只含有15人體細(xì)胞的綿羊。贊賈尼表示,這項技術(shù)的最終目的,就是要在綿羊身上培育出可向人體移植的器官。此前,贊賈尼已經(jīng)成功培育出一個人體細(xì)胞占較大比例的羊肝。但有人擔(dān)憂,如果人體細(xì)胞和動物細(xì)胞最終結(jié)合到一起,就可能產(chǎn)生人羊“混血兒,引發(fā)社會倫理危機(jī)。重慶晨報 4動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的根本概念動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用轉(zhuǎn)基因的重組子構(gòu)建技術(shù),重組分子導(dǎo)入動物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化技術(shù),轉(zhuǎn)基因在受體細(xì)胞染色體上的穩(wěn)定整合及可控制性表達(dá)技術(shù)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物 指以實驗方法導(dǎo)入外源基因,在染色體組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。1981年,

3、第一次成功地將外源基因?qū)雱游锱咛?創(chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)。 5根據(jù)不同的目的,轉(zhuǎn)基因動物操作可以簡單地劃分為四種類型：（l）疾病型轉(zhuǎn)基因動物；（2）利用轉(zhuǎn)基因動物制藥；（3）動物改進(jìn)型；（4）根底生物學(xué)研究。672、動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)程序?qū)⒖寺〉耐庠椿蜃⑸涞揭粋€受精卵的細(xì)胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮,使其順利完成胚胎發(fā)育；移植后的受精卵發(fā)育生長為后代,其中的局部后代其細(xì)胞中都攜帶有轉(zhuǎn)入的外源基因；利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動物作為種畜或種禽,培育新的純合系。893、動物轉(zhuǎn)基因的效率 動物基因轉(zhuǎn)移的起點和終點分別為受精卵和含有整合轉(zhuǎn)基因的動物子代。在這個過程中,轉(zhuǎn)基因的效率極低。以小鼠

4、轉(zhuǎn)基因為例：注射外源基因后受精卵的存活率為86；將受精卵移殖到母鼠子宮內(nèi)后受精卵的存活率為25,母鼠的懷孕率為80, 轉(zhuǎn)基因在基因組上的整合率為24, 因此小鼠轉(zhuǎn)基因的總有效率約為4.10影響因素轉(zhuǎn)基因性質(zhì)轉(zhuǎn)基因的程序外源基因的大小11動物轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)基因組片段：分子量大,保持完整的基因結(jié)構(gòu)小基因：同一基因的某一或假設(shè)干區(qū)域融合基因：結(jié)構(gòu)基因,非編碼序列以及表達(dá)調(diào)控序列的來源不同靶基因：結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控序列經(jīng)過誘變或定向突變處理,然后重新輸入回動物體內(nèi)插入基因：在動物染色體上隨機(jī)或特異性插入的位點,根據(jù)需要也可以加裝標(biāo)記基因置換基因；兩側(cè)含有其他的同源序列,用于動物基因的定位別離與克隆12動物轉(zhuǎn)

5、基因的表達(dá)特性轉(zhuǎn)基因的時空特異性表達(dá)相關(guān)基因的時序特異性和組織特異性轉(zhuǎn)基因的可控性表達(dá)根據(jù)受體細(xì)胞的性質(zhì)和啟動子類型來摸索誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)基因的表達(dá)控制條件轉(zhuǎn)基因的共抑制效應(yīng)共抑制效應(yīng)：當(dāng)受體細(xì)胞染色體上含有轉(zhuǎn)基因的同源伙伴時,轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源性同源基因的表達(dá)將同時受到抑制13共抑制效應(yīng)的特征共抑制只發(fā)生在轉(zhuǎn)基因與同源的內(nèi)源性基因之間,對其他基因的表達(dá)不產(chǎn)生影響如果轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源性發(fā)生體內(nèi)重組,則共抑制效應(yīng)隨之消失,基因表達(dá)恢復(fù)正常共抑制現(xiàn)象的發(fā)生與結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)有關(guān),但不依賴于啟動子的來源和性質(zhì)兩個相同的轉(zhuǎn)基因之間也能發(fā)生共抑制效應(yīng)14轉(zhuǎn)基因?qū)雱游矬w內(nèi)的方法151617 胸苷激酶基因的選擇系統(tǒng) 胸苷激酶

6、(thymidine kinase, TK)是核苷酸合成代謝途徑中的一種酶,能夠?qū)⑿剀辙D(zhuǎn)換為胸苷一磷酸. 在單純皰疹病毒(HSV)中發(fā)現(xiàn)的tk基因,幾乎在所有的真核細(xì)胞中都能有效地表達(dá),所以選擇為遺傳標(biāo)記基因. 該系統(tǒng)中, 首先要建立TK-表型的細(xì)胞株. 采用誘變加選擇的方法: 在細(xì)胞培養(yǎng)時加胸苷類似物5-溴尿嘧啶脫氧核苷BUdR, TK催化其摻入細(xì)胞的DNA分子中,導(dǎo)致DNA復(fù)制出現(xiàn)錯誤. 具有BUdR- DNA的細(xì)胞對UV特別敏感,迅速被殺死,而少數(shù)TK-表型的細(xì)胞株存活. 目前最常用的是小鼠L細(xì)胞的TK-突變株(優(yōu)點: 產(chǎn)生回復(fù)突變的頻率低,而且容易被外源DNA所轉(zhuǎn)化). 18HAT選擇

7、法1962年E.H. Szybalska 和 W. Szybalski 設(shè)計的,由于選擇TK+細(xì)胞的培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(hypoxanthine), 氨基蝶呤(aminopterin, APT), 胸苷(thymidine), 所以叫HAT選擇法. 1920根本原理:加氨基蝶呤APT, 二氫葉酸復(fù)原酶被抑制, 從而阻斷dTTP, dATP, dGTP的重新合成途徑;加次黃嘌呤, 啟動dATP, dGTP的補(bǔ)救合成途徑;加胸苷, TK+細(xì)胞能通過胸苷激酶的作用合成dTTP, 細(xì)胞繼續(xù)存活;TK-細(xì)胞則死亡.所以, 使用HAT培養(yǎng)基能夠選擇出由tk基因轉(zhuǎn)化而來的TK+細(xì)胞.21222324C 高

8、等哺乳動物的載體系統(tǒng)8 外源基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV4400）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA252627282930313233動物病毒的特點1、有能夠被真核細(xì)胞識別的有效的啟動子；2、在感染周期中能夠持續(xù)地復(fù)制使基因 到達(dá)相當(dāng)高濃度,并實現(xiàn)有效的表達(dá)；3、病毒能具有效控制自己復(fù)制的順式元件和反式作用因子,改造后可開展成為能夠在細(xì)胞內(nèi)長時間的保持高拷貝的外源基因的復(fù)制型質(zhì)粒載體；34動物病毒的特點4、能高效穩(wěn)定地整合到染色體,可提高外源基因?qū)爰闹骷?xì)胞染色體的效率；5、病毒外殼蛋白能夠識別細(xì)胞接受器,能夠?qū)⑼庠吹鞍赘咝У貙?dǎo)入宿主細(xì)胞(假病毒粒

9、子法)。35363738394041424344454647二 反轉(zhuǎn)錄病毒載體類型1. 簡介: Retroviruses, 是一類含有單鏈RNA的動物病毒.基因組含有2條相同的正鏈RNA分子,包裝成二倍體病毒顆粒.此外, 顆粒內(nèi)還含有tRNA引物分子, 反轉(zhuǎn)錄酶,RNaseH, 整合酶等.2. 分3個類群: 泡沫病毒(foamy viruses )類群, 慢病毒(entiviruses)類群(如HIV-I,II型), 致癌病毒onco viruses類群.483. 反轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點 (1) 大多數(shù)情況下,反轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤基因都能在正常細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄,利用之作為天然轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,改建成載體. (2)寄主

10、范圍廣, 包括無脊椎和脊椎動物; (3)具有強(qiáng)啟動子,有效表達(dá)外源基因; (4) 不但感染率高,而且不會導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡, 且形成感染性病毒顆粒.49反轉(zhuǎn)錄病毒的一般生物學(xué)特性1 生命周期第一時相從病毒顆粒脫殼到整合到寄主基因染色體上,成為原病毒(provirus);第二時相原病毒開始轉(zhuǎn)錄, 合成并加工成mRNA, 進(jìn)而轉(zhuǎn)譯蛋白,組裝顆粒,釋放病毒.50反轉(zhuǎn)錄病毒的一般生物學(xué)特性2 基因組特點 有4條RNA鏈, r序列, U3(轉(zhuǎn)錄加尾信號)和U5(轉(zhuǎn)錄起始信號)序列.3 編碼讀框 核心局部有3個開放讀框,兩側(cè)是控制表達(dá)的信號區(qū).515253545. 反轉(zhuǎn)錄病毒載體類型1、輔助病毒互補(bǔ)的重組的

11、反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體；2、無需輔助病毒互補(bǔ)的重組的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒 載體；3、廣寄主范圍的反轉(zhuǎn)錄病毒載體；4、反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體.551、輔助病毒互補(bǔ)的重組的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體構(gòu)建: 從原病毒DNA上移去gag, pol, env等3個基因的全部或大局部序列, 保存下5-LTR, 3-LTR以及pBS+ve, PBS+ve和包裝位點psi. 然后參加選擇標(biāo)記基因構(gòu)成重組載體. 標(biāo)記基因的ATG要恰好插在gag基因的原來位置.56572、無需輔助病毒互補(bǔ)的重組的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體利用包裝細(xì)胞株, 在它的染色體基因組DNA的某個位點整合有缺失了psi序列的原病DNA. 因此可以合成全部蛋白質(zhì),但不能包

12、裝自己的基因組, 而包裝反轉(zhuǎn)錄病毒載體.58利用動物轉(zhuǎn)基因研究基因的表達(dá)與功能目的：基因?qū)雱游锸荏w細(xì)胞后在體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控特征以及相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)研究發(fā)育過程中相關(guān)基因的表達(dá)順序,調(diào)控開關(guān)以及表達(dá)的時空特異性59利用轉(zhuǎn)報告基因探測動物基因組的調(diào)控序列作為報告基因,在遺傳選擇和篩選檢測方面必須具有以下幾個條件：(1)已被克隆和全序列已測定；(2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中不存在,即無背景,在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物；(3)其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測定。 60轉(zhuǎn)基因動物6162報告基因(reporter gene)一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因,一個其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼

13、序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因,或與其它目的基因相融合,在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá),從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控,篩選得到轉(zhuǎn)化體。 6364常用的報告基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、-半乳糖苷酶基因、二氫葉酸復(fù)原酶基因、熒光酶基因等。cat基因,檢測可通過放射自顯影觀察。熒光酶基因,具有檢測速度快、靈敏度比cat基因高301000倍、費用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點。 65分析教材341342圖77轉(zhuǎn)報告基因及生物學(xué)效應(yīng)分析66利用同源基因滅活細(xì)胞內(nèi)源基因同源重組重組(recombination) 的本質(zhì) 基因的重排或交換.即2個DNA分子間或一個DNA分子的不同

14、部位間,通過斷裂和重接,交換DNA片段從而改變基因的組合和序列. 同源重組(Homologous recombination) 指DNA同源序列間的重組,常發(fā)生于兩個較長的同源DNA片段或同源染色體之間。 可通過同源重組將外源基因定位整合到細(xì)胞基因組中. 67利用同源基因滅活細(xì)胞內(nèi)源基因68利用同源基因滅活細(xì)胞內(nèi)源基因一方面可序列特異性滅活細(xì)胞內(nèi)源基因,直接構(gòu)建功能喪失型缺陷株,說明內(nèi)源基因的生物學(xué)效應(yīng)另一方面可將外源基因置換細(xì)胞內(nèi)源基因或染色體區(qū)域,形成功能獲得型突變體,用于改進(jìn)動物物種和人體基因治療69利用反義基因抑制細(xì)胞基因表達(dá)目的阻斷其mRNA的翻譯而不是破壞基因本身途徑一從細(xì)胞中別離

15、靶基因的mRNA,并以此為模板由細(xì)菌7071動物細(xì)胞高效表達(dá)異源蛋白的根本原理7273747576777879利用動物乳腺組織生產(chǎn)蛋白藥物乳腺作為生物反響器的優(yōu)點乳汁是可連續(xù)合成并分泌的機(jī)體液體頻繁采集不會對轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)成危害轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物只局限在乳腺細(xì)胞中表達(dá),不會干擾動物整個機(jī)體的正常生理狀態(tài)在動物體內(nèi)表達(dá)后對人體不容易產(chǎn)生免疫反響動物乳汁中蛋白組分不多,且性質(zhì)和含量已知,大規(guī)模別離純化十分方便80轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動物遺傳性狀改進(jìn)中的應(yīng)用8182基因治療 第一次白色革命是建立公共健康設(shè)施及衛(wèi)生制度； 第二次白色革命是將麻醉技術(shù)用于外科手術(shù)； 第三次白色革命是疫苗和抗生素的出現(xiàn)與使用；第四次白色革命

16、是分子水平上的基因療法它可以治療許多不治之癥。83基因治療的歷史 1990年9月14日,美國政府首次批準(zhǔn)了一項基因治療臨床研究方案： 對一臺患有腺苷脫氨酶（ADA）缺陷的重度聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID）4歲女童進(jìn)行基因治療并獲得成功。該患者今年已經(jīng)10歲了。從而開創(chuàng)了醫(yī)學(xué)界的新紀(jì)元。 在1980年,cline等人就對兩名重度地中海貧血癥患者進(jìn)行了基因治療,未獲成功。84基因治療的概念在某一個體的細(xì)胞中導(dǎo)入新基因,利用該基因的表達(dá)產(chǎn)物治療疾病. 用正?；蛉〈∪思?xì)胞中的缺陷基因,到達(dá)戰(zhàn)勝分子病的目的 在基因治療中,目的基因被導(dǎo)入到靶細(xì)胞,它們或者與宿主細(xì)胞染色體整合成為宿主遺傳物質(zhì)的一局部,或不

17、與宿主染色體整合而位于染色體外,但都能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因治療的對象：基因病或分子病患者85根據(jù)病變基因所處的細(xì)胞類型可分為：遺傳性分子病,病變基因位于生殖細(xì)胞中,可遺傳后代。如血友病。非遺傳性分子病,病變基因位于體細(xì)胞中。如癌癥,病毒感染癥。根據(jù)病變基因的數(shù)目,可分為：單基因病,如家族性高膽固醇血癥、囊狀纖維變性癥、神經(jīng)肌肉癥多基因病,如癌癥、艾滋病、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)變性病。86基因治療的內(nèi)容基因診斷、基因別離、載體構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)移四項根本內(nèi)容?；蛟\斷：基因發(fā)生缺陷的主要原因如基因突變、基因缺失、基因插入、基因重排等；缺陷基因的定位方法很多。如：限制性片段長度多態(tài)性分析（RPLE）；PC

18、R擴(kuò)增靶序列及序列分析（PCR）；單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析（PCR-SSCP）；HGP序列庫搜尋。87基因別離：用于治療的基因的克隆、重組、鑒定、擴(kuò)增、純化?；蜉d體構(gòu)建：用于治療的基因可通過載體導(dǎo)入體內(nèi),也可以將基因直接注入體內(nèi)。載體可分為病毒類或非病毒類二種,病毒類載體一般都需要重新構(gòu)建,去除其復(fù)制區(qū)和感染區(qū),并將治療基因插入其中。基因轉(zhuǎn)移：將基因通過載體或直接導(dǎo)入病變細(xì)胞中,這存在著兩種方式：生殖細(xì)胞或胚胎細(xì)胞：這種治療方法面臨倫理學(xué)和法學(xué)方面的問題,目前無人敢去碰它。體細(xì)胞：它又有兩種方法：體內(nèi)療法：將基因直接導(dǎo)入病變細(xì)胞內(nèi)；體外療法：將病變細(xì)胞取出體外,在體外將基因?qū)?并經(jīng)體外增殖,再將細(xì)胞輸回體內(nèi)。88基因轉(zhuǎn)移的根本方式分別適用于基因治療的體外療法和體內(nèi)療法：用于體內(nèi)療法的基因轉(zhuǎn)移方式重組病毒顆粒的直接注射、組織、器官、血液 重組DNA分子直接注射橫紋肌,如骨骼肌、心肌。 呼吸通氣溶膠：重組基因包裹在脂質(zhì)體中,做成氣溶膠,通過呼吸作用進(jìn)入機(jī)體呼吸道的上皮細(xì)胞。 粒子轟擊基因轉(zhuǎn)移技術(shù)基因槍：將治療基因或涂抹在金顆粒外表或包在金顆粒內(nèi)。然后采用高壓電極產(chǎn)生的動力將金顆粒打入器官、組織或細(xì)胞內(nèi)。 電穿孔技術(shù)：將質(zhì)粒DNA皮下注射,使之暴露于真