生殖發(fā)育毒性作用和機(jī)理

1、生殖發(fā)育毒性作用和機(jī)理第一節(jié) 生殖毒性生殖毒性（reproduction toxicity） 是指對(duì)雄性和雌性生殖功能的損害和對(duì)后代的影響。故包括對(duì)父母雙方和對(duì)胚胎/胎兒、新生兒的損害。1.外源化學(xué)物對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損害對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的直接影響 棉酚、重金屬、有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑、有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑、殺線蟲(chóng)劑和工業(yè)污染物 干擾睪丸的功能及結(jié)構(gòu)。對(duì)內(nèi)分泌功能的影響 干擾下丘腦垂體睪丸軸的正常功能，主要影響促性腺釋放激素的釋放。 2.外源化學(xué)物對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的損害對(duì)卵巢的直接影響：CS2導(dǎo)致卵巢萎縮干擾下丘腦垂體性腺軸：苯及同系物干擾下丘腦，作用于垂體卵巢系統(tǒng)，引起雌性生殖系統(tǒng)功能異常。第二節(jié) 發(fā)育毒性發(fā)育毒性

2、（developmental toxicity）：指出生前經(jīng)父體和/或母體接觸外源性理化因素引起的在子代到達(dá)成體之前出現(xiàn)的有害作用。 包括 結(jié)構(gòu)畸形 （structural abnormality） 生長(zhǎng)遲緩 （growth retardation） 功能障礙 （functional deficiency） 胚胎死亡（embryo death）一、基本概念 胚胎毒性(embryotoxicity)：通常是指外源性理化因素造成的孕體著床前后直到器官形成期結(jié)束的所有的毒性。 表現(xiàn)為：胚胎期染毒而出現(xiàn)畸胎、生長(zhǎng)遲緩、著床數(shù)減少和吸收胎，也偶有晚死胎。 胎兒毒性(fetotoxicity) ：指器官形

3、成期結(jié)束后的因素引發(fā)的任何毒性表現(xiàn)(包括死亡、體重降低、骨化遲緩、功能缺陷以及結(jié)構(gòu)異常，甚至腫瘤)。 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)育毒性試驗(yàn)中，通常不去區(qū)分胎兒與胚胎，所以使用胚胎-胎兒毒性更恰當(dāng)。 出生缺陷 （birth defect）：是指嬰兒出生前即已形成的發(fā)育障礙。 包括： 形態(tài)結(jié)構(gòu)異常：畸形 功能缺陷：如智力低下，代謝 和行為的異常 畸形(malformation) ：指出生前因素引起發(fā)育生物體的嚴(yán)重的解剖學(xué)上形態(tài)結(jié)構(gòu)的缺陷(異常)，對(duì)發(fā)育、生長(zhǎng)、生理功能、生育力和（或）壽命可產(chǎn)生有害影響，可以存活也可能不能存活。 致畸作用(teratogenic effect)：均指在妊娠期（出生前）接觸外源性理

4、化因素引起后代結(jié)構(gòu)畸形的特性或作用。 致畸作用所表現(xiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，在出生后立即可被發(fā)現(xiàn)。 致畸物(teratogen)：凡在一定劑量下，能通過(guò)母體對(duì)胚胎或胎兒正常發(fā)育過(guò)程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物稱為致畸物或致畸原。 發(fā)育毒物（developmental toxicant）:能造成發(fā)育毒性的物質(zhì)，發(fā)育毒物應(yīng)是在未誘發(fā)母體毒性的劑量下產(chǎn)生發(fā)育毒性的物質(zhì)二、發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點(diǎn)包括：（一）著床前期 （二）器官形成期 （三）胎兒期 （四）圍生期和出生后的發(fā)育期卵子受精后一直至出生為止，都稱為孕體(conceptus) 著床前期發(fā)育毒性從受精算起，到完成著床之前（人類為11-12

5、天，嚙齒類動(dòng)物為前6天）； 通常是未分化細(xì)胞受化學(xué)毒物損傷而致胚泡死亡，即著床前丟失 ；也有著床前接觸毒物導(dǎo)致畸形的例子，如環(huán)氧己烷、甲基亞硝脲等。器官形成期（胚胎發(fā)育期）在致畸作用中，對(duì)致畸物最敏感的階段是器官發(fā)生期，一般稱為危險(xiǎn)期(critical period)或關(guān)鍵期 。人是3-8周；在常用試驗(yàn)動(dòng)物中，自受精日計(jì)算，大鼠器官發(fā)生期約為917天，小鼠器官發(fā)生期為16天，家兔為1120天。在器官發(fā)生期中，致畸物與胚胎接觸可能造成形態(tài)結(jié)構(gòu)異常；也有可能發(fā)生胚胎死亡、生長(zhǎng)遲緩。發(fā)育中的胚胎對(duì)致畸作用的敏感期雖然主要在器官發(fā)生期，但在此期間，各種不同器官還各有特別敏感的時(shí)間，即“靶窗”(targ

6、et window)。 如大鼠器官發(fā)生期為受精后917天，但眼的最敏感期為受孕后9天，心臟和主動(dòng)脈弓約為910天之間。同一劑量的一種致畸物在敏感期中與胚胎接觸，可因胚胎所處發(fā)育階段不同而出現(xiàn)不同的畸形 。 如將大量維生素A在受精后第8天給予大鼠，主要出現(xiàn)骨骼畸形；如在第12天給予，則誘發(fā)腭裂 。 胎兒期 器官形成結(jié)束后(以硬顎閉合為標(biāo)志)即進(jìn)入胎兒期(人類從56-58天起) ，直到分娩。 特點(diǎn)：以組織分化、生長(zhǎng)和生理學(xué)的成熟為主 最容易表現(xiàn)的發(fā)育毒性是生長(zhǎng)遲緩、特異的功能障礙（如神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫系統(tǒng)機(jī)能的改變）、經(jīng)胎盤(pán)致癌和偶見(jiàn)死胎。 胎仔或胎兒對(duì)胚胎致死作用的易感性雖較胚胎為低，但仍有一

7、定數(shù)目的死產(chǎn)胎發(fā)生。圍生期和出生后的發(fā)育期發(fā)育免疫毒性 妊娠期或圍生期接觸某些外源性化合物，會(huì)嚴(yán)重影響出生后T細(xì)胞、B細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的發(fā)育、遷移、歸巢和功能。 發(fā)育神經(jīng)毒性 妊娠期飲酒造成的乙醇綜合癥胎兒； 妊娠期安定暴露對(duì)F1 代大鼠有一定的發(fā)育及神經(jīng)行為毒性,表現(xiàn)為早期生理發(fā)育和神經(jīng)行為發(fā)育滯后等。兒童期腫瘤 圍生期是一生中對(duì)致癌物最敏感的時(shí)期，例如許多兒童期高發(fā)的腫瘤（急性淋巴細(xì)胞性白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骶骨前畸胎瘤、胚性腺瘤等）都可能與出生前因素有關(guān)，因?yàn)檫@一時(shí)期細(xì)胞增殖快，藥物代謝酶的個(gè)體發(fā)生不全，免疫監(jiān)視功能低。三、母體毒性母體毒性作用(maternal toxicity) 母體毒

8、性作用是指外來(lái)化合物在一定劑量下，對(duì)受孕母體產(chǎn)生的損害作用。具體表現(xiàn)包括體重減輕、出現(xiàn)某些臨床癥伏、直至死亡 輕度母體中毒的表現(xiàn)應(yīng)限于母體體重下降，正常增長(zhǎng)受到抑制。抑制程度，不超過(guò)不接觸受試物對(duì)照組動(dòng)物的10%。 嚴(yán)重母體中毒可出現(xiàn)體重增長(zhǎng)大幅度抑制、持久性嘔吐、過(guò)度安靜或活動(dòng)過(guò)度、呼吸困難、生育機(jī)能明顯受損及其它中毒癥狀，甚至死亡。母體毒性作用可分為母體毒性作用與致畸作用關(guān)系 1.具有致畸作用，但無(wú)母體毒性出現(xiàn)，稱為非共效應(yīng)致畸物(non-coeffective teratogen) 此種外源化學(xué)物的致畸作用具有特定的作用機(jī)理，與母體毒性無(wú)關(guān)。如反應(yīng)停致畸作用較強(qiáng)，應(yīng)特別注意。2.出現(xiàn)致畸

9、作用的同時(shí)也表現(xiàn)母體毒性。稱為共效應(yīng)致畸物(coeffective teratogen) 此種受試物可能既對(duì)胚胎有特定的致畸機(jī)理，同時(shí)也對(duì)母體具有損害作用，但二者并無(wú)直接聯(lián)系 3.僅具有母體毒性，但不具有致畸作用 4.在一定劑量下，既不呈現(xiàn)母體毒性，也未見(jiàn)致畸作用 應(yīng)在動(dòng)物可能耐受條件下，最大限度地增加劑量，使其遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人類或其它動(dòng)物實(shí)際可能接觸的水平，如仍未出現(xiàn)致畸作用，才可做出結(jié)論。 母體毒性與致畸作用的劑量關(guān)系之間，并無(wú)固定比值；一般情況下，致畸作用劑量較母體毒性作用劑量為低第六節(jié) 發(fā)育毒性和致畸作用 試驗(yàn)與評(píng)價(jià)一、一般生殖毒性試驗(yàn)為FDA提出的“三段試驗(yàn)”中的I段：雌雄性交配前分別給藥

10、14天和60天 (分別相當(dāng)于卵子和精子發(fā)育的一個(gè)多周期),雌鼠受孕后繼續(xù)給藥至器官發(fā)生期末,孕期20天處死孕鼠,剖腹檢查子宮和胎鼠.研究對(duì)成年雌雄性生殖功能、配子的發(fā)生及成熟、交配行為、受精、著床前的發(fā)育和著床的影響。二、 傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗(yàn)（致畸試驗(yàn)）相當(dāng)于美國(guó)FDA致畸和繁殖毒性三階段試驗(yàn)的第二段(phase II)； 傳統(tǒng)致畸試驗(yàn)是評(píng)價(jià)孕體在胚胎發(fā)育期(器官形成期)接觸受檢物的有害影響。致畸作用是發(fā)育毒性中最重要的一種表現(xiàn)，所以外來(lái)化合物發(fā)育毒性的評(píng)定，主要是通過(guò)致畸試驗(yàn)； 在致畸試驗(yàn)中除可觀察到出生幼仔畸形外，也可同時(shí)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和胚胎致死； 傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗(yàn)是評(píng)定外源化學(xué)物是否具有

11、致畸作用的標(biāo)準(zhǔn)方法。試驗(yàn)設(shè)計(jì)動(dòng)物選擇 劑量和分組 給藥時(shí)期 給藥途徑 其他(一)動(dòng)物選擇1.選擇動(dòng)物原則最好能符合以下標(biāo)準(zhǔn) (1)胎盤(pán)的結(jié)構(gòu)和功能盡可能與人或其它生產(chǎn)實(shí)踐中的動(dòng)物一致 (2)妊娠過(guò)程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多 (3)自發(fā)畸形率低2.選擇動(dòng)物的種類致畸試驗(yàn)通常選用兩種哺乳動(dòng)物 一種是嚙齒類，一般首先考慮大鼠，其次是小鼠；另一種是家兔 雌性用性成熟的，未交配過(guò)的動(dòng)物3.動(dòng)物數(shù)量每組動(dòng)物數(shù)足以對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行有意義的解釋 對(duì)大鼠、小鼠，一般是每個(gè)劑量組用16-20只； 家兔，一般是每個(gè)劑量組用8-12只； 對(duì)較大的動(dòng)物，如狗、靈長(zhǎng)類動(dòng)物，則每組動(dòng)物數(shù)可少些。(二)劑量和分組應(yīng)最少設(shè)3個(gè)劑量組

12、，另設(shè)對(duì)照組 最高劑量組：可以引起母體輕度中毒，即進(jìn)食量減少、體重減輕、死亡不超過(guò)10%； 最低劑量組：不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀； 中間劑量組：可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級(jí)數(shù)關(guān)系。 亞急性毒性試驗(yàn)的最大耐受劑量作為致畸試驗(yàn)的最高劑量，以其1/30為最低劑量 以LD50的1/2-1/3為最高劑量，LD50的1/30-1/50為最低劑量 人體或?qū)嵺`中動(dòng)物實(shí)際接觸量可供劑量設(shè)計(jì)參考的數(shù)據(jù)有3方面：(三)給藥時(shí)期 給藥時(shí)期的正確與否是致畸試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一。不同物種的動(dòng)物，器官形成期不同。給藥時(shí)期應(yīng)包括器官形成期的主要階段。大鼠小鼠兔交配90d 120d60d 90

13、d成年未交配過(guò)著床期孕 d4 d5孕 d5 d6孕 d7 d8染毒期孕 d7 d16孕 d6 d15孕 d6 d18處死期孕 d20孕 d28孕 d29致畸試驗(yàn)日程(四)給藥途徑 原則上是依據(jù)受檢物的性質(zhì)及人類和其它動(dòng)物可能接觸的方式等情況而定，可經(jīng)呼吸道、經(jīng)口、經(jīng)皮、腹腔注射或靜脈注射等 致畸試驗(yàn)，一般應(yīng)在春秋兩季進(jìn)行。因?yàn)樵谶@兩個(gè)季節(jié)氣候比較適宜，動(dòng)物受孕率較高，其他季節(jié)在保持恒溫和光線適宜的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)合籠，受孕率也可能較高。 (五)其他六、觀察指標(biāo)外觀檢查：頭部、軀干部和四肢骨骼檢查：茜素紅染色，囟門(mén)大小，頭骨、脊柱骨、四 肢骨、肋骨、胸骨等內(nèi)臟檢查：Bouins液固定2周后檢查取出子

14、宮，稱取子宮、胎盤(pán)和活胎的重量，記錄黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)及吸收胎數(shù)（大鼠和家兔）（七）結(jié)果分析與評(píng)價(jià)畸胎總數(shù)：每一活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)一種或一種以上畸形均作為一個(gè)畸胎 ；畸形總數(shù)：在同一幼仔每出現(xiàn)一種畸形，即作為一個(gè)畸形；如出現(xiàn)二種或二個(gè)畸形，則作為二個(gè)畸形計(jì)，并依此類推； 計(jì)算時(shí)還要對(duì)劑量效應(yīng)（反應(yīng)）關(guān)系加以分析。 即根據(jù)出現(xiàn)的畸形總數(shù)，計(jì)算每個(gè)活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)的畸形平均數(shù)。對(duì)較為重要的畸形，還可分別單獨(dú)進(jìn)行計(jì)數(shù)。 （1）活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)畸形總數(shù)活產(chǎn)幼仔總數(shù)=100% 即作為畸胎的幼仔在活產(chǎn)幼仔總數(shù)中所占的百分率 。 （2）畸形出現(xiàn)率畸胎出現(xiàn)率出現(xiàn)畸形的胎仔總數(shù)活產(chǎn)

15、胎仔總數(shù)=100% 即出現(xiàn)畸形胎仔的母體在妊娠母體總數(shù)中所占的百分率。計(jì)算出現(xiàn)畸形母體數(shù)時(shí)，同一母體無(wú)論出現(xiàn)多少畸形胎仔或多少種畸形，一律按一個(gè)出現(xiàn)畸胎的母體計(jì)算 （3）母體畸胎出現(xiàn)率母體畸胎出現(xiàn)率出現(xiàn)畸胎的母體數(shù)妊娠母體數(shù)=100%三、圍生期毒性試驗(yàn) 即美國(guó)的III段試驗(yàn)，目的是評(píng)價(jià)藥物于孕后期至斷乳之間給予孕鼠、哺乳鼠和胎兒潛在的不良作用。 試驗(yàn)大鼠于孕期15天開(kāi)始給藥至生產(chǎn)后28天為止。圍生期試驗(yàn)其它方面與一般生殖毒性試驗(yàn)大致相同，但孕鼠處死時(shí)間是在斷乳期末（大鼠產(chǎn)后28天），故只檢查新生仔。 觀察指標(biāo)：出生存活率、4天存活率、21天存活率，出牙、開(kāi)眼、睪丸下降、陰道開(kāi)口；行為反射指標(biāo)：平面翻正、懸崖回避、負(fù)趨地性、聽(tīng)覺(jué)驚愕、空中翻正、視覺(jué)定向等。對(duì)新藥品的評(píng)價(jià)以上三個(gè)試驗(yàn)是必須的。交配前交配孕期哺乳期斷乳后一般生殖毒性試驗(yàn)圍生期毒性試驗(yàn)致畸試驗(yàn)三段生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)給藥時(shí)間比較（顏色部位為給藥時(shí)期）四、繁殖試驗(yàn) 評(píng)價(jià)化學(xué)物