消疹止癢膠囊有效成分的定性鑒別和含量測定方法研究

1、PAGE PAGE 5消疹止癢膠囊有效成分的定性鑒別和含量測定方法研究紅 梅1，王 棟2，張 勇1*，包麗麗1（010010 呼和浩特，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院藥劑科1；010010 呼和浩特，內(nèi)蒙古食品藥品檢驗所中藥科2）摘要目的：建立消疹止癢膠囊中藥材的定性鑒別方法和指標(biāo)成分的含量測定方法。方法：采用薄層色譜法對方中的訶子、麻黃進行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）測定川芎中阿魏酸的含量。結(jié)果：該鑒別方法專屬性強，薄層色譜斑點清晰，陰性對照無干擾；阿魏酸的HPLC色譜峰與其他色譜峰分離良好，進樣量在0.05380.3228g范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.999 9），平均加樣回收率為10

2、0.30%，RSD=0.96%（n=9）。結(jié)論：本方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于消疹止癢膠囊的質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞 消疹止癢膠囊；阿魏酸；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Identification of active ingredients and content determination in xiaozhenzhiyangHong Mei1, Wang Dong2, Zhang Yong1, Bao Lili1(1Department of pharmacy, Mongola Hospital, 2Departmant of Chinese Medicine, Mongola for

3、 Food and Drug control, Huhhot, 010010, China)AbstractObjective: To identify two active ingredients and determine the content of ferulic acid in xiaozhenzhiyang capsules. Methods: Thin layer chromatography (TLC) was used for qualitative identification of chebula Fructus, Ephedrae Herbap; The content

4、 of Ferulic acid from chuanxiong Rhizoma was determined by HPLC. Results: The identification method was highly specific with clear TLC spots. The negative control did not impose any disturbance. In HPLC, the chromatographic peah of ferulic acid was well isolated from othe peahs. There was a good lin

5、ear relationship between the sample size and the peak area of piperine in a range of 0.0538g - 0.3228g(r=0.9999). The average recovery of ferulic acid was 100.30%(n=9), RSD=0.96%. Conclusion The method is simple accurade and good reproducibility. lt can be used for the quality control of xiaozhenzhi

6、yang capsules.Key words xiaozhezhiyang capsules；Ferulic acid；thin layer chromatography；high performance liquid chromatography；quality standardSupported by Project of the science and Technology Departmeat of Inner Mongoloia（20010214）.Corresponding author: Zhang Yong. Tel:86-471-6620378,E-mail:基金項目 內(nèi)蒙

7、古科技廳計劃項目 （20010214） 通信作者 張勇，電話：（0471）6620378， E-mail:消疹止癢膠囊是在我院名老中醫(yī)傳統(tǒng)方的基礎(chǔ)上研制而成的純中藥制劑，廣泛用于血虛風(fēng)熱所致的各種皮膚疾患，尤其對于急、慢性蕁麻疹的療效甚佳1。該方由川芎、生地、桑白皮、地骨皮、白鮮皮、麻黃、蟬蛻、訶子八位中藥組成，具有養(yǎng)血疏風(fēng)、清熱止癢之功效前言引用一條文獻，注意文獻順序。為了控制該制劑質(zhì)量，本研究運用薄層色譜法（thin layer chromatography,TLC）對訶子、麻黃進行定性鑒別；并用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,

8、HPLC），對膠囊中川芎的主要活性成分阿魏酸進行含量測定。材料與方法1.1儀器與試藥 LC-10ATvp 泵，SCL-10Avp 型控制器，SPA-10Avp型檢測器，CLASS-VP 色譜工作站。普析通用TU-1901型紫外分光光度儀，硅膠G薄層板自制（10cm20cm）。阿魏酸對照品（含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，批號：0773-9910 )；沒食子酸對照品（薄層鑒別用，中國藥品生物制品檢定所提供，批號：0831-9501）； 鹽酸麻黃對照品（薄層鑒別用，中國藥品生物制品檢定所提供。批號：1241-20001）。消疹止癢膠囊3批（批號061026、061027、061028，規(guī)格 0

9、.4g/粒），甲醇為色譜純， 水為高純水，其它試劑均為分析純。硅膠G（薄層色譜用）：青島海洋化工廠。1.2 薄層色譜鑒別1.2.1訶子TLC鑒別 取本品1g，加乙醇20ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇3ml使溶解，作為供試品溶液。按處方比例，制備缺訶子樣品，并同法制備缺訶子陰性對照溶液。另取沒食子酸對照品，加乙醇制成每1毫升含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典附錄 B）實驗，吸取上述供試品溶液和缺訶子陰性對照溶液各10l、對照品溶液3l，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲酸（6：4：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液

10、，斑點顯色清晰。1.2.2 麻黃TLC鑒別 取本品2g，加濃氨試液1ml，再加氯仿20ml，加熱回流1h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。按處方比例，制備缺麻黃樣品，并同法制備缺麻黃陰性對照溶液。另取鹽酸麻黃堿對照品，加甲醇制成每1毫升含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典附錄 B）實驗，吸取上述供試品溶液和缺麻黃陰性對照溶液各10l、對照品溶液5l，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（20：5：0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，105加熱至斑點顯色清晰。1.3 阿魏酸的含量測定1.3.1色譜條件 色譜柱：色譜柱填充

11、劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，采用 phenomen C18柱（ 250mm4.6mm，5m）；流動相：甲醇-1%冰醋酸（30：70）；柱溫：35；檢測波長：為316nm，理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計不得低于3000。1.3.2對照品溶液的制備 稱取阿魏酸對照品適量，精密稱定,置棕色量瓶中，加甲醇稀釋，定容，得濃度為10g/ml對照品溶液。1.3.3供試品溶液的制備 取本品0.5g，研細(xì)，精密稱定，加0.5%碳酸鈉溶液20ml，超聲處理30min，離心，上清液置分液漏斗中，藥渣用0.5%碳酸鈉溶液洗滌3次，每次10ml、離心，洗液并入分液漏斗中，用HCl調(diào)節(jié)pH值至12，用乙醚25、25、20、20、2

12、0ml萃取5次，乙醚液蒸干，用30%甲醇溶液微熱使溶解，定量轉(zhuǎn)移至10ml棕色量瓶中，并用30%甲醇溶液稀釋至刻度，離心，取上清液，備用。1.3.4陰性對照溶液的制備 按照本品處方組成（缺川芎）并以相同工藝制備空白對照，依照供試品溶液制備法得陰性樣品溶液。1.3.5專屬性考察 精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10l ，分別注入液相色譜儀按上述色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。1.3.6線性關(guān)系考察 精密稱取阿魏酸對照品2.5mg，置50ml 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1、2、3、4、5、6 ml溶液分別置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得濃度分別為5.38、

13、10.76、16.14、21.52、26.9、32.28g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，各取10l 進樣，按上述色譜條件測定,以峰面積對進樣濃度進行回歸分析。 1.3.7精密度實驗 取同一份供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值。1.3.8穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、24、32 h進樣10l，測定阿魏酸峰面積積分值的RSD。1.3.9重復(fù)性實驗 取同一批號（批號061026）供試品6份，精密稱定，分別按1.3.3法操作制備供試品溶液，依照1.3.1項下色譜條件進行重復(fù)性試驗，測定峰面積，計算每份供試品含量

14、。1.3.10加樣回收實驗 取供試品(批號061026，含量0.212mg/g) 約0.25g 9份，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入阿魏酸對照品溶液（阿魏酸濃度為0.0236mg/ml）1.6、1.6、1.6、2.0、2.0、2.0、2.4、2.4、2.4ml，按1.3.3方法平行制備供試品溶液和1.3.1項下色譜條件，測定每份供試品含量，計算回收率。1.3.11樣品含量測定 取3批樣品（批號061026、061027、061028）。分別按1.3.3方法制得供試品溶液，按1.3.1項下方法測定，計算樣品中阿魏酸的含量。2.結(jié)果2.1薄層色譜鑒別2.1.1訶子TLC鑒別 結(jié)果顯示供試品色譜中，在與對照

15、品色譜相應(yīng)的位置比移值（Rf）約為0.67上，顯相同顏色的斑點；陰性對照（缺訶子）在相應(yīng)的Rf值處無干擾，表明該方法具較好專屬性。見圖1。1 2 3 4 5 6 1：陰性對照；2：沒食子酸對照品；3：訶子對照藥材；4-6：供試品（061026、061027、061028）圖1 訶子的TLC鑒別結(jié)果2.1.2麻黃TLC鑒別 結(jié)果顯示供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置（Rf值約為0.43）上，顯相同顏色的斑點；且相同工藝、同法制備的陰性對照（缺麻黃）在相應(yīng)的Rf值處無干擾，表明該方法具專屬性。見圖2。 1 2 3 4 5 6 1：陰性對照；2：鹽酸麻黃堿對照品；3：麻黃對照藥材；4-6：供試品

16、（061026、061027、061028）圖2 麻黃的TLC鑒別結(jié)果2.2含量測定2.2.1專屬性考察 從色譜圖中可見，陰性對照在與阿魏酸對照品以及供試品相應(yīng)的峰位處無吸收峰出現(xiàn)，表明其他組分對阿魏酸的含量測定沒有影響，基線穩(wěn)定，此法可行。見圖3-5。峰強度出峰時間（t/min）圖3 阿魏酸對照品HPLC圖譜出峰時間（t/min）峰強度圖4 消疹止癢膠囊供試品HPLC圖譜峰強度出峰時間（t/min） 圖5 消疹止癢膠囊陰性對照（缺川芎）HPLC圖譜2.2.2線性關(guān)系考察 將阿魏酸對照品標(biāo)準(zhǔn)系列，依次進樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程Y=7515745.48X

17、-735.49 r=0.9999。結(jié)果表明：阿魏酸在0.0538 0.3228g 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.2.3精密度 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測得的RSD值為1.13%，表明儀器精密度良好。2.2.4穩(wěn)定性 取同一供試品溶液在不同時間進樣分析，測得RSD值為1.10%，結(jié)果表明阿魏酸在32h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.2.5重復(fù)性 結(jié)果見表1，表明該方法重現(xiàn)性良好。表1 阿魏酸含量重復(fù)性實驗結(jié)果樣品號標(biāo)示量（g）峰面積值(n=2)測得含量（mg/g）平均含量（mg/g）RSD（%）10.50348106660.2160.2121.4320.50027852610.21130.4989778

18、0420.21040.50047728470.20850.50218022380.21560.50998036590.2122.2.6加樣回收率 從測定數(shù)據(jù)可見：加樣回收率符合要求。結(jié)果見表2。表2 阿魏酸加樣回收實驗結(jié)果序號取樣量（g）供試品含量（mg）加入對照品量（mg）測得量（mg）回收率（%）平均（%）RSD（%）10.25020.05300.03780.090398.57100.30 0.9620.24890.05280.03780.090399.2930.24590.05210.03780.0902100.7140.25120.05330.04720.100399.6750.247

19、80.05250.04720.1002100.9960.24960.05290.04720.1005100.8270.25990.05510.05660.1117100.0080.25010.05300.05660.1103101.2090.24990.05300.05660.1104101.452.2.7樣品含量 將3批樣品依次進行含量測定，計算阿魏酸的平均含量，結(jié)果見表3。表 3 樣品中阿魏酸含量測定結(jié)果 批號 平均裝量平均裝量單獨排成一列,核對 （g/粒）取樣量為什么取樣量的值有6個呢？含量（mg/g）平均含量（mg/g）每粒含量（mg） 061026 0.4201 0.50120.50

20、010.2060.1980.2020.0848061027 0.4213 0.51250.51380.1960.1960.1960.0825061028 0.4239 0.51440.52150.1780.1840.1810.07673 討論急慢性蕁麻疹是皮膚出現(xiàn)風(fēng)團時隱時現(xiàn)伴有瘙癢反復(fù)發(fā)作的一種皮膚病，屬于中醫(yī)風(fēng)疹塊、隱疹等范疇，為過敏性皮膚疾患。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為皮膚瘙癢是因肌表衛(wèi)氣虛弱，勞汗當(dāng)風(fēng)，或風(fēng)寒，或風(fēng)熱，或風(fēng)濕之邪入侵肌膚，不得疏泄所致，亦可風(fēng)、燥、濕、熱久留體內(nèi)化火生燥，以致津血枯澀，肌膚失養(yǎng)而致，故采用涼血潤燥，調(diào)和營衛(wèi)，清熱燥濕法則治療。隨著社會現(xiàn)代化進程的加速，微生物、物理、化學(xué)

21、、精神、內(nèi)分泌失調(diào)等致病因素，使本病發(fā)病率逐年增加。目前臨床用藥，西藥多采用祛除病因、抗組胺藥、皮質(zhì)激素、鈣劑、擬腎上腺素藥等治療，但療效并不十分理想，并有一定副作用且易復(fù)發(fā)2-3；中醫(yī)藥通過調(diào)節(jié)整體功能，提高機體自身免疫力往往能夠收到顯著療效4，此方臨床運用達(dá)40余年療效甚佳，深受廣大患者的認(rèn)可。消疹止癢膠囊是由8位中藥組成的純中藥制劑，中藥中所含成分較多，陰性干擾大，參考有關(guān)對中成藥研究文獻的方法5，筆者對膠囊中訶子、麻黃兩種活性成分做定性鑒別并對川芎中的阿魏酸進行含量測定。參照中國藥典2005年版訶子、麻黃項下的薄層鑒別方法以及結(jié)合有關(guān)文獻，經(jīng)反復(fù)試驗優(yōu)選了提取溶劑和展開劑，對方中訶子、

22、麻黃進行了薄層色譜鑒別6-9。結(jié)果顯示在3批供試品色譜中與其對照品和對照藥材相應(yīng)的位置上斑點明顯且清晰，分離效果較理想，陰性對照未見干擾，表明：該方法專屬性強、簡便、快速，用于消疹止癢膠囊的定性鑒別能全面評價產(chǎn)品的質(zhì)量。本制劑中川芎為方中主藥，其中含有川芎嗪、阿魏酸等成分，川芎嗪易升華，在工藝制備過程中損失較大，成品中轉(zhuǎn)移率較低，測定其含量無實際意義10，故選擇阿魏酸為指標(biāo)性成分，運用高效液相色譜對制劑中川芎的阿魏酸進行含量測定，根據(jù)阿魏酸溶于熱水、乙醇及乙酸乙酯，易溶于乙醚的性質(zhì)，曾用甲醇直接超聲處理制備供試品溶液，但干擾成分太多，色譜分離效果很差，結(jié)合文獻方法，采用堿水提取，酸化后用乙醚萃

23、取的方法可以除去大部分干擾成分，得到較理想的色譜峰。并對堿水洗滌次數(shù)、乙醚萃取次數(shù)和超聲時間進行了考察，將0.5%碳酸鈉溶液洗滌次數(shù)定為3次；萃取次數(shù)定為5次；超聲時間選定為30min。經(jīng)過多次試驗摸索確定了較理想的色譜條件11-16，結(jié)果顯示色譜峰分離良好，陰性未見干擾，重現(xiàn)性、精密度、回收率、穩(wěn)定性等方法學(xué)考察結(jié)果較理想，且操作簡單，重現(xiàn)性好，專屬性強，故該法可作為本制劑的含量測定方法。從樣品含量測定結(jié)果可見，阿魏酸的含量最低為0.0767mg/粒, 實驗中用相同方法對上述3批樣品生產(chǎn)用川芎藥材進行了含量測定，測得阿魏酸含量為0.436mg/g，按理論值折算，成品每粒應(yīng)含阿魏酸0.209m

24、g，但實際測得含量結(jié)果偏低。阿魏酸遇熱遇光易分解17，在制劑工藝過程中損失較大，是造成成品轉(zhuǎn)移率低的原因。所以考慮到不同產(chǎn)地的藥材阿魏酸含量有所不同，并結(jié)合3批樣品的實際含量，暫定本品每粒含阿魏酸（C10H10O4）不得少于0.07mg。綜上所述，本研究采用TLC法對其活性成分訶子、麻黃進行定性鑒別；HPLC法對阿魏酸進行定量分析，可為消疹止癢膠囊提供簡便可靠、安全的鑒別方法，故可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻:1 李鳳林.臨證實踐M.內(nèi)蒙古人民出版社,1980:106-109.2 解其偉,孫焱,趙桂云,等.4種抗組胺藥治療慢性蕁麻疹的療效比較J.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2010,26(3):

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