抗原抗體免疫膠體金技術(shù)手冊(cè)

1、抗原抗體免疫膠體金技術(shù)手冊(cè)原理 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于

2、免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。膠體金的制備 根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒的方法如下。1枸櫞酸三鈉還原法 （1）10nm膠體金粒的制備：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min，冷卻至4，溶液呈紅色。（2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混勻即可。（3）15nm、18nm20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01HAuCl4水溶液

3、100ml，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、1820nm、30nm和50nm。2鞣酸枸櫞酸鈉還原法A液：1HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。B液：1枸櫞酸三鈉4ml，1鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入雙餾水至20ml。將A液、B液分別加熱至60，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍(lán)，繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。如需要制備其它直徑的金顆粒，則按表15-1所列的數(shù)字調(diào)整鞣酸及K2CO3

4、的用量。制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。（2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45m）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。（5）氯金酸配成1水溶液在4可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時(shí)，最好將整

5、個(gè)小包裝一次性溶解。膠體金標(biāo)記蛋白的制備 膠體金對(duì)蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。1待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4離心1h，去除聚合物。2待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時(shí)，調(diào)至9.0；標(biāo)記McAb時(shí),調(diào)至8.

6、2；標(biāo)記親和層析抗體時(shí)，調(diào)至7.6；標(biāo)記SPA時(shí)，調(diào)至5.96.2；標(biāo)記ConA時(shí)，調(diào)至8.0；標(biāo)記親和素時(shí)，調(diào)至910。由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測(cè)定為宜。3膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定（1）根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml。（2）將標(biāo)記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5g/ml50g/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液。（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。（4）結(jié)果觀察，對(duì)照管

7、（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加1020。4膠體金與蛋白質(zhì)（IgG）的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5胎牛血清（BSA）和1聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5BSA使溶液終濃度為1；1聚乙二醇加至總?cè)芤旱?10。5膠體金標(biāo)

8、記蛋白的純化（1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g，4離心1h；20nm40nm膠體金結(jié)合物，14 000g，4離心1h。仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1BSA的PB液（含0.02NaN3），將沉淀重懸為原體積的110，4保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50甘油可貯存于-18保存一年以上。為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用1030

9、蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。（2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的15110。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm20cm，加樣量為床體積的110，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內(nèi)含0.1BSA，0.05NaN3，pH8.2者用IgG標(biāo)記物），流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時(shí)略混濁，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為

10、純化的膠體金蛋白結(jié)合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過濾除菌、分裝,4保存。最終可得到7080的產(chǎn)量。6膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定（1）膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察?；蛴么姿徕檹?fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。（2）膠體金溶液的OD520nm值測(cè)定：膠體金顆粒在波長510nm550nm之間出現(xiàn)最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1BSA，0.02NaN3）將膠體金蛋白試劑作120稀釋，OD5200.25左右。一般應(yīng)用液的

11、OD520應(yīng)為0.20.4。（3）金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MFIGSSA）。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標(biāo)記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體，對(duì)金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。（四） 膠體金標(biāo)記技術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用 膠體金標(biāo)記技術(shù)由于標(biāo)記物的制備簡便，方法敏感、特異，不需要使用放射性同位素，或有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物，也不要熒光顯微鏡，它的應(yīng)用范圍廣，除應(yīng)用于光鏡或電鏡的免疫組化法外，更廣泛地應(yīng)用于各種液相免疫測(cè)定和固相免疫分析以及流式細(xì)胞術(shù)等。1液相免疫測(cè)定：將膠體金與抗

12、體結(jié)合，建立微量凝集試驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)的抗原，如間接血凝一樣，用肉眼可直接觀察到凝集顆粒。利用免疫學(xué)反應(yīng)時(shí)金顆粒凝聚導(dǎo)致顏色減退的原理，建立均相溶膠顆粒免疫測(cè)定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地應(yīng)用于PCG的檢測(cè)，直接應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。2金標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)：膠體金可以明顯改變紅色激光的散射角，利用膠體金標(biāo)記的羊抗鼠Ig抗體應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)，分析不同類型細(xì)胞的表面抗原，結(jié)果膠體金標(biāo)記的細(xì)胞在波長632nm時(shí)，90度散射角可放大10倍以上，同時(shí)不影響細(xì)胞活性。而且與熒光素共同標(biāo)記，彼此互不干擾。3膠體金固相免疫測(cè)定法（1）斑點(diǎn)免疫金銀染色法（DotIGSI

13、GSS）是將斑點(diǎn)ELISA與免疫膠體金結(jié)合起來的一種方法。將蛋白質(zhì)抗原直接點(diǎn)樣在硝酸纖維膜上，與特異性抗體反應(yīng)后，再滴加膠體金標(biāo)記的第二抗體，結(jié)果在抗原抗體反應(yīng)處發(fā)生金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)，此稱為斑點(diǎn)免疫金染色法（DotIGS）。此反應(yīng)可通過銀顯影液增強(qiáng)，即斑點(diǎn)金銀染色法（DotIGSIGSS）。（2）斑點(diǎn)金免疫滲濾測(cè)定法（dot immunogold filtration assay,DIGFA）此法原理完全同斑點(diǎn)免疫金染色法，只是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強(qiáng)的墊料，即為滲濾裝置。在加抗原（抗體）后，迅速加抗體（抗原），再加金標(biāo)記第二抗體，由于有滲濾裝置，反應(yīng)很快，在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯

14、出顏色反應(yīng)。此方法已成功地應(yīng)用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測(cè)。免疫膠體金(Immune colloidal gold)原理 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等

15、。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。膠體金的制備 根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來制備膠體金顆粒的方法如下。1枸櫞酸三鈉還原法（1）10nm膠體金粒的制備：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min，冷卻至4，溶液呈紅色。（2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K2CO3

16、0.5ml，混勻即可。（3）15nm、18nm20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、1820nm、30nm和50nm。2鞣酸枸櫞酸鈉還原法A液：1HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。B液：1枸櫞酸三鈉4ml，1鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入雙餾水至20ml。將A液、B液分別加熱至60，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍(lán)，繼續(xù)加熱攪拌至

17、溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。如需要制備其它直徑的金顆粒，則按表所列的數(shù)字調(diào)整鞣酸及K2CO3的用量。鞣酸枸櫞酸鈉還原法試劑配制表3制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。（2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45m）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2

18、）較好。（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。（5）氯金酸配成1水溶液在4可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時(shí)，最好將整個(gè)小包裝一次性溶解。膠體金標(biāo)記蛋白的制備 膠體金對(duì)蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。1待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4離心1h，去除聚合物。2待標(biāo)膠

19、體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時(shí)，調(diào)至9.0；標(biāo)記McAb時(shí),調(diào)至8.2；標(biāo)記親和層析抗體時(shí)，調(diào)至7.6；標(biāo)記SPA時(shí)，調(diào)至5.96.2；標(biāo)記ConA時(shí)，調(diào)至8.0；標(biāo)記親和素時(shí)，調(diào)至910。由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測(cè)定為宜。3膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定（1）根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml。（2）將標(biāo)記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5g/ml50g/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，

20、混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液。（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。（4）結(jié)果觀察，對(duì)照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加1020。4膠體金與蛋白質(zhì)（IgG）的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀

21、。常用穩(wěn)定劑是5胎牛血清（BSA）和1聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5BSA使溶液終濃度為1；1聚乙二醇加至總?cè)芤旱?10。5膠體金標(biāo)記蛋白的純化（1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g，4離心1h；20nm40nm膠體金結(jié)合物，14 000g，4離心1h。仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1BSA的PB液（含0.02NaN3），將沉淀重懸為原體

22、積的110，4保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50甘油可貯存于-18保存一年以上。為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用1030蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。（2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的15110。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm20cm，加樣量為床體積的110，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內(nèi)含0.1BSA，0.05NaN3，

23、pH8.2者用IgG標(biāo)記物），流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時(shí)略混濁，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過濾除菌、分裝,4保存。最終可得到7080的產(chǎn)量。6膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定（1）膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察?；蛴么姿徕檹?fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。（2）膠體金溶液的OD520nm值測(cè)定：膠體金顆粒在波長510nm550nm之間出現(xiàn)最大吸收值峰

24、。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1BSA，0.02NaN3）將膠體金蛋白試劑作120稀釋，OD5200.25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.20.4。（3）金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MFIGSSA）。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標(biāo)記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體，對(duì)金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。免疫金試紙膜和試劑盒檢測(cè)法 因?yàn)槟z體金具有肉眼可觀察的紅色，所以為不需要任何儀器的試紙膜或試劑盒法的免疫檢測(cè)提供了可能，利用免疫金試紙膜法檢測(cè)的模式可以很靈活，根

25、據(jù)具體情況可以采用不同的方式：既可以標(biāo)記抗體，又可以標(biāo)記抗原；既可以采用標(biāo)記抗原與待測(cè)抗原的競爭方式進(jìn)行檢測(cè)，又可以利用標(biāo)記抗體或標(biāo)記二抗的夾心法方式進(jìn)行檢測(cè)。美國PAN PROBE、INC、生物技術(shù)公司生產(chǎn)的產(chǎn)品名稱為“快速一步法膠體金尿測(cè)試條”的膠體金試紙，有以下幾種產(chǎn)品種類：(1)嗎啡海洛因鴉片；(2)可卡因；(3)苯丙胺；(4)甲基苯丙胺；(5)大麻；(6)安定。這種檢測(cè)試條的檢測(cè)時(shí)間是5min，在室溫下保存有效期兩年使用方法是將3滴尿液加入加樣孔，雙紅線為陰性，單紅線為陽性3本試驗(yàn)基于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的原理，并被用于對(duì)人類尿樣中嗎啡和鴉片制品的分析檢測(cè)分析過程中，在尿樣中的藥物及其代

26、謝物與固著在滲透膜上的藥物綴合物共同競爭在有色微小顆粒上的有限的抗體結(jié)合部位試驗(yàn)?zāi)驑颖坏稳氲綕B透膜一端的樣本液槽中如果尿樣含有所要檢測(cè)的藥物，那么藥物及其代謝產(chǎn)物會(huì)競爭在微小顆粒上的有限的抗體結(jié)合部位、當(dāng)藥物很充足時(shí)，它們會(huì)全部占據(jù)抗體結(jié)合部位、這會(huì)阻止有色微小顆粒和膜上試驗(yàn)探極區(qū)相結(jié)合這樣陽性尿樣在試驗(yàn)區(qū)就不會(huì)出現(xiàn)沉淀色帶試紙上另一條對(duì)照色帶是另一處抗體反應(yīng)區(qū)，它表明試驗(yàn)是可靠的在作試驗(yàn)結(jié)果判斷前，對(duì)照色帶總是應(yīng)該出現(xiàn)的一般情況下，陰性結(jié)果是出現(xiàn)兩條色帶：一條為對(duì)照色帶，在試驗(yàn)區(qū)還出現(xiàn)一條色帶沉淀線，而陽性結(jié)果只出現(xiàn)一條色帶。市面上大量使用的早早孕HCG膠體金試紙，采用了雙抗體夾心法的檢測(cè)模

27、式陽性尿樣是雙紅線，陰性尿樣是單紅線、人體絨毛膜促性腺激素(HCG)的含量是衡量懷孕與否的重要指標(biāo)，懷孕婦女尿液中的HCG濃度比末懷孕婦女顯著增高HCG抗體1預(yù)先被固定在試紙膜的特定部位上(就是檢測(cè)線出現(xiàn)的部位)，金標(biāo)HCG抗體2被平鋪在尿樣展開時(shí)經(jīng)過的區(qū)域、當(dāng)陽性尿樣被加入時(shí)，尿樣中的HCG首先與膜上平鋪的金標(biāo)HCG抗體2結(jié)合，隨著尿樣的展開最終被固定在HCG抗體1的地方并顯色。當(dāng)陰性尿樣被加入后，由于沒有HCG與金標(biāo)抗體2結(jié)合，最終金標(biāo)抗體2不會(huì)在抗體1處被富集，所以檢測(cè)線不出現(xiàn)紅色6艾滋病III型定性試劑盒也采用了膠體金標(biāo)記的方法，檢測(cè)的是人體血清中的艾滋病病毒(human immuno

28、deficiency virus，HIV)特異性抗體。便隱血膠體金試紙可以檢測(cè)糞便中微量人血紅蛋白，為早期胃腸道腫瘤發(fā)現(xiàn)和診斷提供了依據(jù)。目前便隱血膠體金試紙已被一些醫(yī)院臨床采用，并在健康人群體檢中運(yùn)用便隱血膠體金試紙檢驗(yàn)法采用雙抗體的三明治夾心免疫檢驗(yàn)法，特異性抗體是針對(duì)糞便樣品中的血紅蛋白(Hb)如果便樣中含有Hb，它就會(huì)和試劑中的金標(biāo)抗體組成抗原抗體復(fù)合物，再和反應(yīng)區(qū)中的另一種Hb抗體形成紫紅色的色帶，如果便樣中無Hb，反應(yīng)區(qū)中就不會(huì)有色帶出現(xiàn)梅毒膠體金法試劑盒采用免疫膠體金技術(shù)，通過硝酸纖維素膜上包被特異性梅毒基因重組抗原，檢測(cè)標(biāo)本中特異性的梅毒抗體，梅毒膠體金法具有較好的特異性和靈敏

29、度，在用于供血者篩選時(shí)優(yōu)于TRUST法，且操作簡便，結(jié)果判斷清晰快速，但其必須使用血清或血漿，不適合街頭一次性流動(dòng)采血7。此外還有其他的一些膠體金試劑盒，象“滴金法快速檢測(cè)幽門螺桿菌感染試劑盒”等，好多種用于細(xì)菌、病毒檢驗(yàn)的膠體金試劑盒?，F(xiàn)有膠體金試劑盒很多，價(jià)格和質(zhì)量各異，適用性不同，應(yīng)遵循合理的原則加以選擇，以期最小的花費(fèi)達(dá)到最佳的效果。膠體金技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)越性，現(xiàn)在應(yīng)用已越來越廣，但世上無十全十美之物，膠體金也有其缺點(diǎn)。（1）、配體固定于膠體金主要依賴物理吸附作用，而并非各種生物學(xué)活性分子都可被吸附。因此膠體金適用性雖廣，但并非適用于各種物質(zhì)的測(cè)定。（2）、配體與膠體金結(jié)合的機(jī)理至今尚

30、不甚明了，因此制備試劑的操作、產(chǎn)品質(zhì)量等相當(dāng)程度上有賴于經(jīng)驗(yàn)。（3）、膠體金在制備和使用時(shí)對(duì)水質(zhì)及器具的清潔度要求甚高，各種污染可使試劑自凝或產(chǎn)生非特異的IGSS反應(yīng)。（4）、膠體金先包以牛血清白蛋白等惰性蛋白質(zhì)，經(jīng)活化后再與配體化學(xué)交聯(lián)結(jié)合，從而可結(jié)合不能被吸附的配體，并使之保持良好的定向和穩(wěn)定性，但操作麻煩，產(chǎn)品得率低。免疫金試紙膜和試劑盒檢測(cè)法 因?yàn)槟z體金具有肉眼可觀察的紅色，所以為不需要任何儀器的試紙膜或試劑盒法的免疫檢測(cè)提供了可能，利用免疫金試紙膜法檢測(cè)的模式可以很靈活，根據(jù)具體情況可以采用不同的方式：既可以標(biāo)記抗體，又可以標(biāo)記抗原；既可以采用標(biāo)記抗原與待測(cè)抗原的競爭方式進(jìn)行檢測(cè)，又

31、可以利用標(biāo)記抗體或標(biāo)記二抗的夾心法方式進(jìn)行檢測(cè)。美國PAN PROBE、INC、生物技術(shù)公司生產(chǎn)的產(chǎn)品名稱為“快速一步法膠體金尿測(cè)試條”的膠體金試紙，有以下幾種產(chǎn)品種類：(1)嗎啡海洛因鴉片；(2)可卡因；(3)苯丙胺；(4)甲基苯丙胺；(5)大麻；(6)安定。這種檢測(cè)試條的檢測(cè)時(shí)間是5min，在室溫下保存有效期兩年使用方法是將3滴尿液加入加樣孔，雙紅線為陰性，單紅線為陽性3本試驗(yàn)基于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的原理，并被用于對(duì)人類尿樣中嗎啡和鴉片制品的分析檢測(cè)分析過程中，在尿樣中的藥物及其代謝物與固著在滲透膜上的藥物綴合物共同競爭在有色微小顆粒上的有限的抗體結(jié)合部位試驗(yàn)?zāi)驑颖坏稳氲綕B透膜一端的樣本液槽

32、中如果尿樣含有所要檢測(cè)的藥物，那么藥物及其代謝產(chǎn)物會(huì)競爭在微小顆粒上的有限的抗體結(jié)合部位、當(dāng)藥物很充足時(shí)，它們會(huì)全部占據(jù)抗體結(jié)合部位、這會(huì)阻止有色微小顆粒和膜上試驗(yàn)探極區(qū)相結(jié)合這樣陽性尿樣在試驗(yàn)區(qū)就不會(huì)出現(xiàn)沉淀色帶試紙上另一條對(duì)照色帶是另一處抗體反應(yīng)區(qū)，它表明試驗(yàn)是可靠的在作試驗(yàn)結(jié)果判斷前，對(duì)照色帶總是應(yīng)該出現(xiàn)的一般情況下，陰性結(jié)果是出現(xiàn)兩條色帶：一條為對(duì)照色帶，在試驗(yàn)區(qū)還出現(xiàn)一條色帶沉淀線，而陽性結(jié)果只出現(xiàn)一條色帶。市面上大量使用的早早孕HCG膠體金試紙，采用了雙抗體夾心法的檢測(cè)模式陽性尿樣是雙紅線，陰性尿樣是單紅線、人體絨毛膜促性腺激素(HCG)的含量是衡量懷孕與否的重要指標(biāo)，懷孕婦女尿液

33、中的HCG濃度比末懷孕婦女顯著增高HCG抗體1預(yù)先被固定在試紙膜的特定部位上(就是檢測(cè)線出現(xiàn)的部位)，金標(biāo)HCG抗體2被平鋪在尿樣展開時(shí)經(jīng)過的區(qū)域、當(dāng)陽性尿樣被加入時(shí)，尿樣中的HCG首先與膜上平鋪的金標(biāo)HCG抗體2結(jié)合，隨著尿樣的展開最終被固定在HCG抗體1的地方并顯色。當(dāng)陰性尿樣被加入后，由于沒有HCG與金標(biāo)抗體2結(jié)合，最終金標(biāo)抗體2不會(huì)在抗體1處被富集，所以檢測(cè)線不出現(xiàn)紅色6艾滋病III型定性試劑盒也采用了膠體金標(biāo)記的方法，檢測(cè)的是人體血清中的艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)特異性抗體。便隱血膠體金試紙可以檢測(cè)糞便中微量人血紅蛋白，為早期胃腸道

34、腫瘤發(fā)現(xiàn)和診斷提供了依據(jù)。目前便隱血膠體金試紙已被一些醫(yī)院臨床采用，并在健康人群體檢中運(yùn)用便隱血膠體金試紙檢驗(yàn)法采用雙抗體的三明治夾心免疫檢驗(yàn)法，特異性抗體是針對(duì)糞便樣品中的血紅蛋白(Hb)如果便樣中含有Hb，它就會(huì)和試劑中的金標(biāo)抗體組成抗原抗體復(fù)合物，再和反應(yīng)區(qū)中的另一種Hb抗體形成紫紅色的色帶，如果便樣中無Hb，反應(yīng)區(qū)中就不會(huì)有色帶出現(xiàn)梅毒膠體金法試劑盒采用免疫膠體金技術(shù)，通過硝酸纖維素膜上包被特異性梅毒基因重組抗原，檢測(cè)標(biāo)本中特異性的梅毒抗體，梅毒膠體金法具有較好的特異性和靈敏度，在用于供血者篩選時(shí)優(yōu)于TRUST法，且操作簡便，結(jié)果判斷清晰快速，但其必須使用血清或血漿，不適合街頭一次性流

35、動(dòng)采血7。此外還有其他的一些膠體金試劑盒，象“滴金法快速檢測(cè)幽門螺桿菌感染試劑盒”等，好多種用于細(xì)菌、病毒檢驗(yàn)的膠體金試劑盒?，F(xiàn)有膠體金試劑盒很多，價(jià)格和質(zhì)量各異，適用性不同，應(yīng)遵循合理的原則加以選擇，以期最小的花費(fèi)達(dá)到最佳的效果。膠體金技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)越性，現(xiàn)在應(yīng)用已越來越廣，但世上無十全十美之物，膠體金也有其缺點(diǎn)。（1）、配體固定于膠體金主要依賴物理吸附作用，而并非各種生物學(xué)活性分子都可被吸附。因此膠體金適用性雖廣，但并非適用于各種物質(zhì)的測(cè)定。（2）、配體與膠體金結(jié)合的機(jī)理至今尚不甚明了，因此制備試劑的操作、產(chǎn)品質(zhì)量等相當(dāng)程度上有賴于經(jīng)驗(yàn)。（3）、膠體金在制備和使用時(shí)對(duì)水質(zhì)及器具的清潔度要

36、求甚高，各種污染可使試劑自凝或產(chǎn)生非特異的IGSS反應(yīng)。（4）、膠體金先包以牛血清白蛋白等惰性蛋白質(zhì)，經(jīng)活化后再與配體化學(xué)交聯(lián)結(jié)合，從而可結(jié)合不能被吸附的配體，并使之保持良好的定向和穩(wěn)定性，但操作麻煩，產(chǎn)品得率低。膠體金的應(yīng)用 膠體金在電鏡水平的應(yīng)用膠體金應(yīng)用電鏡水平的研究最早，發(fā)展最快，應(yīng)用最廣泛。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以通過應(yīng)用不同大小的顆粒或結(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。直徑為315nm 膠體金均可用作電鏡水平的標(biāo)記物。315nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測(cè)，而直徑15nm 多用于檢測(cè)量較多的感染細(xì)胞。膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。單層培養(yǎng)中細(xì)胞

37、內(nèi)抗原的檢測(cè)。組織抗原的檢測(cè)。膠體金在光鏡水平的應(yīng)用膠體金同樣可用做光鏡水平的標(biāo)記物，取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細(xì)胞涂片、切片均可應(yīng)用。主要用于：用單克窿抗體或抗血清檢測(cè)細(xì)胞懸液或培養(yǎng)的單層細(xì)胞的膜表面抗原。檢測(cè)培養(yǎng)的單層細(xì)胞胞內(nèi)抗原，組織中或亞薄切片中抗原的檢測(cè)。凝集試驗(yàn)單分散的免疫金溶膠呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化，當(dāng)與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生專一性反應(yīng)后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發(fā)生變化，顆粒也會(huì)沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無色，這一原理可定性或定量地應(yīng)用于免疫反應(yīng)。此外，膠體金在流式細(xì)胞儀，免疫印痕技術(shù)，免疫層析快速診斷技術(shù)中也有很廣泛的應(yīng)用。膠體金的穩(wěn)定性及免

38、疫膠體金的貯存 膠體金具有很高的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不受破壞時(shí)自身凝聚極慢，可放置數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑，但濃度不宜過高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。當(dāng)金溶膠吸附蛋白質(zhì)后，溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，如ConA，過氧化物酶等，當(dāng)pH較低時(shí)保持穩(wěn)定，提高pH則顯得不穩(wěn)定，接近等電點(diǎn)或略高時(shí)又變得穩(wěn)定了。標(biāo)記后的膠體金溶液

39、可用0.20.5mg/ml PEG20000 作為穩(wěn)定劑。在410貯存數(shù)月有效，不宜冰凍。 膠體金的制備 膠體金有多種制備方法，常用的有：檸檬酸三鈉還原法、檸檬酸三鈉鞣酸混合還原法、白磷還原法、抗壞血酸還原法、乙醇超聲波還原法等。但制備中的一些細(xì)節(jié)問題極大的影響著膠體金的質(zhì)量，應(yīng)予以注意:（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時(shí)，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4）是以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對(duì)清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可

40、用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。免疫膠體金技術(shù)的基本原理 氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12），外層離子層H 則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆粒基本是圓球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子

41、被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因

42、而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中，這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。膠體金標(biāo)記技術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用 膠體金標(biāo)記技術(shù)由于標(biāo)記物的制備簡便，方法敏感、特異，不需要使用放射性同位素，或有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物，也不要熒光顯微鏡，它的應(yīng)用范圍廣，除應(yīng)用于光鏡或電鏡的免疫組化法外，更廣泛地應(yīng)用于各種液相免疫測(cè)定和固相免疫分析以及流式細(xì)胞術(shù)等。1液相免疫測(cè)定：將膠體金與抗體結(jié)合，建立微量凝集試驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)的抗原，如間接血凝一樣，用肉眼可直接觀察到凝集顆粒。利用免疫學(xué)反應(yīng)時(shí)金顆粒凝聚導(dǎo)致顏色減退的原理，建立均相溶膠顆粒免疫測(cè)定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地應(yīng)用于PCG的檢測(cè)，直接應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。2金標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)：膠體金可