中期考核匯報(bào)課件

1、中期考核匯報(bào) 張 婧 導(dǎo)師：羅深秋教授 時(shí)間：2006-03-237/14/20221中期考核匯報(bào)AMP 激活蛋白激酶（AMPK）靶向治療肝纖維化作用機(jī)理的研究 課題名稱7/14/20222中期考核匯報(bào)肝臟疾病嚴(yán)重危害著人們的健康。衛(wèi)生部2005年的統(tǒng)計(jì)資料顯示：我國約有1.2億人攜帶乙肝病毒，慢性乙肝患者約3000萬；慢性丙肝患者3800萬；脂肪肝患者約5000萬；藥物、中毒、自身免疫性肝病患者1000萬人。每年約有50萬人死于慢性乙肝相關(guān)疾病。7/14/20223中期考核匯報(bào) 肝纖維化是諸多慢性肝病發(fā)展至肝硬化過程中所共有的病理組織學(xué)變化。近年來的研究已經(jīng)證實(shí)肝纖維化是由于肝星狀細(xì)胞（he

2、patic stellate cell, HSC)分泌了過多的胞外基質(zhì)，并在肝臟內(nèi)沉積而形成的。7/14/20224中期考核匯報(bào)肝臟星形細(xì)胞(hepatic stellate cells ,HSC) 又稱貯脂細(xì)胞(fatstoring cell ,FSC) ,具有貯存脂肪供肝細(xì)胞能量、貯存及代謝維生素A、合成細(xì)胞外基質(zhì)的功能。在炎癥、化學(xué)物質(zhì)等致病因素刺激下HSCs 可活化、增殖并產(chǎn)生大量的膠原,是形成肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。7/14/20225中期考核匯報(bào)抗纖維化的治療策略去除病因，減少炎癥; 抑制HSCs 激活和細(xì)胞外基質(zhì)合成;促進(jìn)基質(zhì)降解；肝細(xì)胞再生；促進(jìn)HSCs的凋亡。7/14/20226

3、中期考核匯報(bào)近來的研究表明，AMP激活的蛋白激酶（AMPK）持續(xù)性的激活可以引發(fā)細(xì)胞的凋亡 。有實(shí)驗(yàn)證明持續(xù)的AMPK的活性可以誘導(dǎo)MIN6、原代的cell、Jurkat等細(xì)胞的凋亡。香港大學(xué)徐愛民教授與倫敦MRC研究中心的 David Carling 博士的合作課題中，對AMPK在激活的大鼠HSCs細(xì)胞的功能作用進(jìn)行了初步的探討。他們發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的組成性激活的AMPK的過表達(dá)能明顯的誘導(dǎo)激活的大鼠HSCs 細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。7/14/20227中期考核匯報(bào)技術(shù)路線 HSCs的分離 HSCs的鑒定和培養(yǎng) 外源基因表達(dá)的檢測細(xì)胞凋亡的檢測人肝星狀細(xì)胞株LX-2的培養(yǎng)鑒定 腺病毒轉(zhuǎn)染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)7/14

4、/20228中期考核匯報(bào)課題進(jìn)展分離、鑒定了大鼠的肝形狀細(xì)胞；鑒定了LX2細(xì)胞正在摸索合適的病毒感染的數(shù)量，以及感染后收獲細(xì)胞的時(shí)間。7/14/20229中期考核匯報(bào)Thank you！7/14/202210中期考核匯報(bào)HSCs的分離CL2MDP質(zhì)脂體的制備質(zhì)脂體尾靜脈注射3d灌注、分離肝臟紗網(wǎng)過濾、密度梯度離心培養(yǎng)7/14/202211中期考核匯報(bào)HSCs的鑒定1.Antidesmin的抗體做免疫組化2.油紅o染色3.熒光顯微鏡觀察7/14/202212中期考核匯報(bào)腺病毒的轉(zhuǎn)染設(shè)置不同的病毒的梯度感染細(xì)胞：0、10、20、40、80、100pfu，分別在18h和、30h、48h提取蛋白，進(jìn)行

5、目的蛋白表達(dá)的檢測，以確定病毒的用量和收獲細(xì)胞的時(shí)間。7/14/202213中期考核匯報(bào)外源基因表達(dá)的檢測1.western blotting檢測外源基因的表達(dá)：用抗Myc-標(biāo)簽的抗體作為一抗檢測。2.免疫組化檢測7/14/202214中期考核匯報(bào)細(xì)胞凋亡的檢測形態(tài)學(xué)的觀察流式細(xì)胞儀的檢測DNA ladder分析JNK表達(dá)的變化Caspase3表達(dá)的變化Bcl2表達(dá)的變化7/14/202215中期考核匯報(bào)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷 （含乙醇的高脂肪流質(zhì)食物喂食4周）四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化 （腹腔注射四氯化碳6周 ）動(dòng)物模型通過尾靜脈注入表達(dá)組成性激活的AMPK或熒光素酶的重組腺病毒，在預(yù)定時(shí)間后，取老鼠的肝臟進(jìn)行以下分析： （1）免疫組化評估肝損傷的程度，炎癥灶，HSCs細(xì)胞的激活，膠原的含量等； （2）檢測參與肝臟炎癥和纖維化的關(guān)鍵基因，如TNF，和膠原家族成