ProteinA,ProteinG

1、ProteinA、ProteinG1ProteinASepharose、rProteinASepharose親和層析介質(zhì)與抗體的結(jié)合目前，約70-80%的抗體純化使用ProteinA、ProteinG親和層析。蛋白A(ProteinA)來源于金黃色葡萄球菌的一個株系，它含有5個可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。蛋白A作為親和配基被偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上，可以特異性的和樣品中的抗體分子結(jié)合，而使其他雜蛋白流穿，具有極高的選擇性，一步親和層析就可達到超過95%的純度。1個蛋白A分子至少可以結(jié)合2個IgG。蛋白A也可以結(jié)合另一些免疫球蛋白，如用于某些種屬的IgA、IgM的純化。天然(Nat

2、iveProteinA)和重組的蛋白A(rProteinA)對于IgG的Fc段有著相似的特異結(jié)合。重組的蛋白A經(jīng)改造后含有一個C末端半胱氨酸，可以單一位點偶聯(lián)于瓊脂糖上，降低了空間位阻，增加了與IgG的結(jié)合能力。蛋白A與IgG的結(jié)合強度很大成度上依賴于該抗體的種屬和亞型，而其動態(tài)結(jié)合能力則決定于結(jié)合強度(解離常數(shù))及傳質(zhì)阻力等多種因素(例如上樣時樣品在柱內(nèi)的停留時間)。2ProteinGSepharose親和層析介質(zhì)與抗體的結(jié)合蛋白G是一種源自鏈球菌G族的細胞表面蛋白，為三型Fc受體。其通過類似于蛋白A的非免疫機制與抗體的Fc段結(jié)合。像蛋白A一樣，蛋白G可以與IgG的Fc區(qū)域特異性結(jié)合，不同的

3、是，ProteinGSepharose可以廣泛、更強地結(jié)合更多類型的IgG,多克隆IgG及人IgG，同時血清蛋白結(jié)合水平更低，純度更高，配基脫落也相對更低。此外，蛋白G還可以和某些抗體的Fab和F(ab)2段結(jié)合。是從類細菌中分離出來的胞壁蛋白，與多數(shù)哺乳動物的段結(jié)合包括：人、山羊、綿羊、兔、豚鼠、馬、豬、猴、小鼠等，分子量：可用于純化不能與很好結(jié)合的哺乳動物單抗和多抗的純化。相對于有著更高的親和力，尤其是對于。與不同，e對于大多數(shù)哺乳動物的的亞基，如人，小鼠和鼠不與狗結(jié)合、不結(jié)合人，重組蛋白G(RecombProteinG)已經(jīng)除去了與白蛋白及細胞表面結(jié)合位點，減少了交叉反應(yīng)和非特異性結(jié)合。

4、因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的親和力。可以代替二抗，廣泛應(yīng)用于免疫化學(xué)等領(lǐng)域。在親和力、穩(wěn)定性等方面好。本產(chǎn)品將我公司自主設(shè)計和生產(chǎn)的新型重組蛋白G偶聯(lián)到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠6B上,成為用于抗體分離純化的親和層析介質(zhì)本產(chǎn)品穩(wěn)定性好，基團脫落少，使用壽命長，使用方便，可從腹水或培養(yǎng)液中直接分離純化抗體。由于采用了環(huán)氧活化的方法，與溴化氰活化方法相比，可獲得長短更適合的結(jié)合臂，使抗體純化獲得更好的效果。并且這種方法活化的瓊脂糖凝膠沒有離子交換的作用，因而其死吸附少。、親和介質(zhì)特性:特點基團脫落少，結(jié)合特異性強基質(zhì)6%的交聯(lián)瓊脂糖凝膠配基重組蛋白G配基密度6mg重組蛋白G/ml吸附載量3-7m

5、g鼠IgG2a/ml親和介質(zhì)的顆粒大小50-160m最大流速200cm/hpH范圍3-10，在位清洗時pH范圍可到2-11使用溫度常溫保存溫度+48C保存液體20%乙醇三、適用范圍ProteinA和ProteinG的相對結(jié)合強度物種物種亞類亞類proteinA結(jié)合proteinG結(jié)合人IgA可變-IgD-lgD-lgG1+lgG2+lgG3-+lgG4+lgM可變-雞蛋黃lgY-牛+狗+山羊-+豚鼠lgG1+lgG2+倉鼠+馬+考拉-+駱駝-+猴（恒河）+小鼠lgG1+lgG2a+lgG2b+lgG3+lgM可變-豬+兔+大鼠lgG1-+lgG2a-+lgG2b-+lgG3-+綿羊+/-+=強

6、結(jié)合，+=中等結(jié)合，-=弱或不結(jié)四、緩沖液配制建議采用磷酸緩沖液，洗脫后不影響下游的標記。A緩沖液lmol/LNa2HPO4.12H2O(MW358.14)358.14g1500mMNaCll(MW68.08g/mol)87.7g溶于1升水，濾膜過濾B緩沖液1mol/LNaH2P04(MW156.01)156.01g1500mMNaCll(MW68.08g/mol)87.7g溶于1升水，濾膜過濾C吸附和洗滌緩沖液根據(jù)所需PH值，按下表3配制。按照所列比例量取后混合，然后再加9倍體積的水，稀釋成應(yīng)用溶液。如果洗脫下的抗體有些雜帶，可加吐溫-20至終濃度0.05%D中和緩沖液:A液77.4ml、B

7、液22.6m1；兩液混合成PH7.4的中和緩沖液E洗脫液0.1mo1/LNaH2P04(MW156.01)15.601g150mMNaCll(MW68.08g/mol)&77g溶于1升水，濾膜過濾，HC1調(diào)整PH至3.0五、應(yīng)用舉例A實驗名稱：從小鼠腹水中分離純化IgG2a1、重組蛋白G瓊脂糖凝膠裝柱，柱床體積為1ml,流盡20%乙醇溶液；2、以緩沖液C平衡5-10個床體積，流速為1m1/min；（緩沖液C配制方法:取A液35.2ml、B液64.8ml，再加900ml水，混合后PH6.5）.3、將0.2ml小鼠腹水用緩沖液C稀釋到2ml，0.45卩m濾膜過濾，上樣。流速為1ml/min；4、用

8、緩沖液C再洗5-10個床體積，流速為1ml/min；5、用洗脫液E,洗脫3體積。6、在洗脫液加入0.2體積中和緩沖液，以PH試紙確認溶液為中性。溶液太酸，會損傷抗體活性（中和緩沖液配制方法：A液77.4ml、B液22.6ml；兩液混合成PH7.4的中和緩沖液7、將分離純化的IgG2a與對照品同時進行SDS電泳分析。8、用純水流洗10個柱床體積，再用20%的乙醇流洗10個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于+48C環(huán)境中保存表三，5下磷酸鈉緩沖液的配制pHA液1mol/LNa2HPO4(ml)B液1mol/LNaH2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.

9、26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8根據(jù)比例量取混合，然后在加9倍體積的水，稀釋成應(yīng)用溶液。B免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）：（1）蛋白樣品的準備：1）對于10厘米細胞培養(yǎng)皿中的貼壁細胞，吸除細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，然后加入500微升至2毫升細胞裂解液裂解細胞。3）對于組織樣品參考貼壁細胞使用裂解液的比例進行裂解。4）對于懸浮細胞，離心收集細胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細胞的裂解方法進行裂解。注：詳

10、細的裂解方法參考不冋裂解液的詳細使用方法。對于不冋的培養(yǎng)器材，參考10厘米培養(yǎng)皿的裂解液的用量進行裂解。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，可以用裂解液或PBS適當稀釋，如果蛋白樣品濃度過低，在以后的裂解過程中宜適當減少裂解液的用量。（2）.去除非特異性結(jié)合（可選做）：1）.取200微升至1毫升蛋白樣品，蛋白量約為200微克至1毫克，加入約1微克和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20微升充分重懸的ProteinA+GAgarose，4C緩慢搖動30分鐘至2小時。2）.2500rpm（約1000g）離心5分鐘，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。注：所謂種屬相同的IgG是指，例如后續(xù)免疫沉淀時用的

11、是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normalmouseIgG，如無normalIgG可以加入其它不影響后續(xù)檢測的其它mouseIgG類型的抗體。通過和normalIgG和ProteinA+GAgarose的孵育，可以充分降低非特異性的結(jié)合，降低背景。（3）.免疫沉淀：1）.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4C緩慢搖動過夜。.再加入20微升充分重懸的ProteinA+GAgarose,4C緩慢搖動1-3個小時。(為方便后續(xù)的洗滌操作可以把加入充分重懸的ProteinA+GAgarose的量調(diào)整為40微升。).2500rpm(約lOOOg)離心5分鐘，或瞬時高速離心，小心吸除上清，注意寧可留下少量上清也不能吸掉ProteinA+GAgarose。.用準備蛋白