植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育

1、第十二章無病毒苗木培育植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育本章內(nèi)容提要：植物病毒危害與研究歷史概況脫毒培養(yǎng)的概念與意義脫除病毒的原理與方法脫病毒植株的檢測與保存陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育一、植物病毒的危害與研究概況 1 植物病毒的分布 1.1 植物病毒的地理分布的不均勻性 1.2 在植物體內(nèi)分布的不均勻性 病毒具有系統(tǒng)侵染的特點，雜除生長點外，的各個部位均有，有差異性，存在不均有分布。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育2、植物病毒的危害2.1 植物病毒的種類 已報道的植物病毒達500多種，且危害越來越嚴重。 核果類： 148 余種； 馬鈴薯： 30 余種； 蘋 果： 30 余種； 柑 桔

2、： 20 多種； 觀賞植物：200 多種。 19世紀歐洲馬鈴薯晚疫??；1998年6月馬鈴薯病 毒在歐洲蔓延。 草莓病毒；柑橘衰退?。桓涕冱S龍病。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育TMVTYMV陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育2.2 病毒對植物外觀狀態(tài)的影響花葉型： 也稱花葉病。是由于葉綠體結(jié)團或退化引起。造成葉片上形成暗綠(正常)、亮綠(結(jié)團)和黃色(退化)區(qū)域。環(huán)斑型：在葉片、果實或莖的表面形成單線圓紋或同心紋的環(huán)、全環(huán)或半環(huán)，以用連續(xù)屈曲狀的環(huán)。常常和花葉同時發(fā)生。畸形生長型 ：各種反常的生長。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育黃瓜花葉病毒（CMV）郁金香條斑病毒（TuBV）

3、陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育芋的花葉病百合叢簇?。–TLV）陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育變色型：葉片的局部或全部顏色改變。如褪綠、變黃、變橙、變紅、變紫、變藍綠等。郁金香碎裂病毒感染郁金香，使其花色由單色發(fā)生斑駁或縱向條點。壞死與變質(zhì)：某些細胞組織死亡或組織質(zhì)地變軟或變硬或木栓化。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育芋的枯萎病陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育2.3 染病后對生長和經(jīng)濟性狀的影響影響植物的正常生理代謝，不利于生長發(fā)育，出現(xiàn)各種病癥，如花葉，黃化。因植物病毒導(dǎo)致的年均損失約600億美元，僅次于真菌病害位列第二。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育3 研

4、究歷史概況1889年，印尼有人發(fā)現(xiàn)，患枯萎病的甘蔗放在50-520C的熱水中保持30分鐘，可去除枯萎病。1936年，Kunkel報道患有桃黃萎病(yellow virus)的植株，在34-360C處理14天可失活。1952年，法國morel通過培養(yǎng)莖尖培養(yǎng)獲得第一株脫毒苗，1955年，獲得馬鈴薯脫毒苗。目前，很多農(nóng)作物都已經(jīng)獲得了脫毒苗。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育4 離體培養(yǎng)脫毒的概念與意義 4.1 概念： 是指通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，在離體的條件下，進行脫毒培養(yǎng)，從而獲得無病毒再生植株的技術(shù)。 陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育4.2 意義 現(xiàn)在離體培育無病毒苗(virus-f

5、ree plant)已在生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用?？商岣咧参锏纳頎顟B(tài)，從而有效防病。可對已退化了的優(yōu)良品性作物進行復(fù)壯，從而提高產(chǎn)量和品質(zhì)。大蒜經(jīng)組培脫毒后，蒜頭可增產(chǎn)23.3%114.3%，蒜薹增產(chǎn)58.3%175.0%。用脫毒草莓苗進行生產(chǎn)，可提高果實產(chǎn)量20% 45%，果實可溶性固形物含量增加5.3%15.3%。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育二、植物脫毒原理與方法1 原理：病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，在莖尖中呈梯度分布。在受侵染的植株中，頂端分生組織無病毒或含毒量極低。（具體見P 182 頁）組織的含毒量隨與莖尖的距離加大而增加。植物病毒自身不具有主動轉(zhuǎn)移的能力。植物細胞的分裂與

6、病毒繁殖之間存在競爭。適當高溫可以鈍化病毒活性（不能殺死病毒）陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育1、物理的方法熱處理（熱療）法：溫湯浸漬法(木本)、熱空氣處理法(草本)。原理：適當高溫處理可鈍化病毒。病毒衣殼蛋白分子結(jié)構(gòu)不同，抗熱能力不同。利用不同病毒受熱力處理后衣殼蛋白變性，病毒活性喪失的原理進行熱處理脫毒。此時病毒不能合成或合成很少，而破壞卻增加，使寄主體內(nèi)病毒含量不斷降低。把握處理的部位、溫度范圍、時間。應(yīng)用：蔓性長春花、蘋果、樹莓、草莓、菊花、黃瓜、梨、康乃馨等已有報道或應(yīng)用。三、植物脫毒方法陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育2、化學(xué)方法采用某些化學(xué)物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)劑、2-硫尿

7、嘧啶，抗病毒制劑virazole等。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育3、生物學(xué)方法3.1 莖尖組織培養(yǎng)脫毒法原理：分生組織的細胞生長速度快，病毒在植物體內(nèi)繁殖的速度相對較慢；而且病毒的傳播是靠篩管組織進行轉(zhuǎn)移，或通過細胞間連絲傳遞給其他細胞，因此病毒的傳遞擴散也受到一定限制。造成病毒在植物體內(nèi)分布不均。方法：莖尖大小與脫毒率成反比，與成活率成正比。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育食用百合的脫毒培養(yǎng)過程陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育3.2 愈傷組織培養(yǎng)脫毒法 愈傷組織中某些細胞不帶病毒，可能是細胞的分裂速度快于病毒的復(fù)制速度，而似的少數(shù)細

8、胞無病毒，這樣通過這些細胞來再生植株，以獲得無病毒苗。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育3.3 珠心胚培養(yǎng)脫毒利用多胚性植物(如柑桔和芒果)的珠心胚培養(yǎng)脫除病毒，獲得無病毒苗。因為珠心細胞與維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系。缺點：20-30%的變異率、童期較長。3.4 花器官等培養(yǎng)脫毒 如草莓花藥、香蕉花序軸、水仙的子房切片。已在馬鈴薯、大蒜、草莓、水仙、香蕉等園藝植物中脫毒成功。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育3.5 微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法 （見書本188頁）方法：技術(shù)關(guān)鍵：陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育3.6 綜合脫毒法1） 莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理2

9、） 莖尖培養(yǎng)結(jié)合病毒鈍化劑處理陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育熱處理結(jié)合莖尖脫毒培養(yǎng)陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育四 脫毒苗的鑒定(1) 指示植物鑒定法：美國病毒學(xué)家Holmes于1929年發(fā)現(xiàn)，因為是利用病毒在其它植物上產(chǎn)生枯斑作為鑒別病毒種類的標準，也稱為枯斑和空斑測定法。如千日紅對X病毒的反應(yīng)是接種后在葉片上出現(xiàn)紅色病斑；洋酸漿對Y病毒-葉片上出現(xiàn)許多小型點狀病斑； 方法：摩擦接種法；嫁接接種法。 局限：只能測出病毒的相對感染力；只能鑒定靠汁液及嫁接傳染的病毒。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育(2) 免疫法A、酶聯(lián)免疫吸附法 (Enzyme Linked Immuno

10、sorbent Assay，ELISA) 1997年Clark和Adams用微量血凝板建立了診斷植物病毒的ELISA技術(shù)。Casper首先用其測定了PLRV病毒。 原理：抗血清(antiserum)鑒定法： 抗血清即含有抗體的血清；血清反應(yīng)即抗體與抗原的結(jié)合。由于血清反應(yīng)的特異性，故可用于病毒的鑒定。 特點：特異性高；測定速度快；靈敏度高；可定量。陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育陳傳紅 制作植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育植物組織培養(yǎng)無病毒苗木培育B：生物素親和素酶聯(lián)免疫吸附法；C：免疫吸附電子顯微術(shù)；D：點免疫結(jié)合試驗。3、PCR方法：近年來發(fā)展起來的廣泛用于各種病原菌檢測的方法。4、電子顯微鏡(Electron microscope