食品中去甲基他達(dá)拉非和硫代西地那非的測定 高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法

1、附件食品中去甲基他達(dá)拉非和硫代西地那非的測定高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法BJS 201704范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品（含保健食品）基質(zhì)中去甲基他達(dá)拉非和硫代西地那非的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于酒、牡蠣粉等食品（含保健食品）中去甲基他達(dá)拉非和硫代西地那非的測定。其他低糖、低脂、低蛋白類基質(zhì)可參照本方法定性檢測。原理試樣經(jīng)甲醇超聲提取，過濾后，濾液供高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，外標(biāo)法定量。試劑和材料注:水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。3.1試劑3.1.1乙腈（C2H3N）：色譜純。3.1.2甲酸（HCOOH）：色譜純。3.1.3 甲醇（CH3OH）：分析純。3.2 試劑配制3.2.1 0.

2、1%甲酸水溶液：取甲酸1mL用水稀釋至1000mL。3.2.2 0.1%甲酸乙腈溶液：取甲酸1mL用乙腈稀釋至1000mL。3.3標(biāo)準(zhǔn)品去甲基他達(dá)拉非、硫代西地那非對照品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見附錄A表A.1，純度98%。3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500 g/mL）：分別精密稱取去甲基他達(dá)拉非、硫代西地那非（3.3）各10.0 mg，用甲醇溶解并稀釋至20mL，搖勻，制成濃度為500 g/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20保存，保存期1個月。3.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（1 g/mL）：分別準(zhǔn)確吸取去甲基他達(dá)拉非、硫代西地那非標(biāo)準(zhǔn)儲備液(500 g

3、/mL)（3.4.1）各0.1 mL，用甲醇稀釋至50mL，搖勻，制成1 g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，-20保存，保存期1個月。3.4.3混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液 (1 g/mL)(3.4.2) 0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL、2.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液S1S5，濃度依次為各化合物10 g/L、20 g/L、40 g/L、100 g/L、200 g/L，臨用新制或依儀器響應(yīng)情況配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。儀器和設(shè)備4.1高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧（ESI）離子源。4.2天平：感量分

4、別為0.1mg和1mg。4.3超聲波發(fā)生器。分析步驟5.1 試樣制備5.1.1固態(tài)試樣取適量混勻，研細(xì)，稱取1g試樣（精確至0.01 g）于具塞試管中，加入甲醇10mL，密塞，稱重，超聲提取10min，放冷，再次稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用濾膜（0.22m，有機相型）過濾，取續(xù)濾液，根據(jù)實際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，備用。5.1.2 液態(tài)試樣取適量搖勻，吸取1.0 mL于具塞試管中，加入甲醇9mL，密塞，稱重，超聲提取10min，放冷，再次稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用濾膜（0.22m，有機相型）過濾，取續(xù)濾液，根據(jù)實際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，備用。5.1.3

5、空白試驗不加試樣按試樣同法處理，制得空白溶液。稱取與試樣等量的空白基質(zhì)試樣，按試樣同法處理，制得空白基質(zhì)試樣溶液，備用。5.2 儀器參考條件5.2.1 色譜條件a）色譜柱：Waters CORTECS T3（2.1100 mm, 2.7 m），或性能相當(dāng)者。b）流動相：A為0.1%甲酸水溶液（3.2.1），B為0.1%甲酸乙腈溶液（3.2.2），梯度洗脫程序見表1。c）流速：300 L/min。d）柱溫：30。e）進(jìn)樣量：1L。表1 梯度洗脫程序表梯度時間/min流動相A/%流動相B/%09010190104604071090910909.19010129010注：在有共流出成分影響目標(biāo)化合物

6、檢測時，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)流動相比例，使盡可能與干擾成分分離，減少干擾。5.2.2 質(zhì)譜條件a) 離子源：電噴霧離子源（ESI源）。b) 檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）。c) 干燥氣、霧化氣、鞘氣、碰撞氣等均為高純氮氣或其他合適氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)相應(yīng)參數(shù)使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求，毛細(xì)管電壓、干燥氣溫度、鞘氣溫度、鞘氣流量、噴嘴電壓、碰撞能量、碎裂電壓等參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度，監(jiān)測離子對和定量離子對等信息詳見附錄B。5.3 定性測定按照高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件測定試樣和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，記錄試樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的色譜保留時間，當(dāng)試樣中檢出與某標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量色譜峰保留時間一致的色譜峰（變化范圍在2.5%

7、之內(nèi)），并且試樣色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子對的相對豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對豐度比的偏差不超過表2規(guī)定的范圍，可以確定試樣中檢出相應(yīng)化合物。表2 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度（k）k50%50%k20%20%k10%k10%允許的最大偏差20%25%30%50%5.4定量測定5.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（3.4.3）分別按儀器參考條件（5.2）進(jìn)行測定，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積。以混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。必要時可用空白基質(zhì)試樣溶液（5.1.3）配制基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.4.2試樣溶液的

8、測定將試樣溶液（5.1）按儀器參考條件（5.2）進(jìn)行測定，得到相應(yīng)的樣品溶液的色譜峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中組分的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次。對照品色譜圖參見附錄C。6 分析結(jié)果的表述將液相色譜質(zhì)譜測得濃度代入下式計算含量：（1）式中：X 試樣中各待測物的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；c 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出的供試品溶液中各待測物的濃度，單位為微克每升（g/L）；V 樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；m 試樣溶液所代表的質(zhì)量，單位為克（g）；K 稀釋倍數(shù)。計算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。7 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測

9、定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。8 其他當(dāng)稱樣量為1g或1mL，定容體積為10mL時，本方法中去甲基他達(dá)拉非和硫代西地那非的檢出限均為50g/kg或50g/L，定量限均為100g/kg或100g/L。空白試驗應(yīng)無干擾。附錄A化合物相關(guān)信息表A.1化合物中文名稱、英文名稱、CAS號、分子式、相對分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)式序號中文名稱英文名稱CAS號分子式分子量結(jié)構(gòu)式1去甲基他達(dá)拉非Nortadalafil171596-36-4C21H17N3O4375.382硫代西地那非Thiosildenafil479073-79-5C22H30N6O3S2490.64附錄B質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件離子源：電噴霧離子源(ESI) ；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) ；掃描方式：正離子模式；毛細(xì)管電壓：正離子模式：4000V ；離子源溫度：200；干燥氣流量：12L/min；霧化氣壓力：25psi；鞘氣溫度：250；鞘氣（N2）流量：10L/min ;噴嘴電壓：正離子模式：500V ；其他質(zhì)譜參數(shù)見表B.1。表B.1化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)序號化合物名稱電離方式母離子 ( m/z)子離子 (m/z)碰撞能量(V)保留時間（min）1去甲基他達(dá)拉非ESI+376.1254.0*135.42261.9332硫代西地那非E