一代、二代、三代測序技術(shù).

1、【最新整理，下載后即可編輯】一代、二代、三代測序技術(shù)(2014-01-22 10:42:13)轉(zhuǎn)載第一代測序技術(shù)-Sanger鏈終止法一代測序技術(shù)是20世紀70年代中期由Fred Sanger及其同事首先 發(fā)明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長度只差一個 核苷酸的單鏈DNA分子區(qū)分開來。一代測序?qū)嶒灥钠鹗疾牧鲜?均一的單鏈DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每個分子的相 同位置上退火，然后該寡聚核苷酸就充當引物來合成與模板互補 的新的DNA鏈。用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑(雙脫氧核苷 酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3-OH基團，所以 可被用作鏈終止試劑)通過聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一

2、系列大小不 同的分子后再進行分離的方法。測序引物與單鏈DNA模板分子 結(jié)合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應(yīng)分四組進行， 每一組分別用四種ddNTP (雙脫氧核苷酸)中的一種來進行終 止，再用PAGE分析四組樣品。從得到的PAGE膠上可以讀出 我們需要的序列。第二代測序技術(shù)-大規(guī)模平行測序大規(guī)模平行測序平臺(massively parallel DNA sequencing platform) 的出現(xiàn)不僅令DNA測序費用降到了以前的百分之一，還讓基因 組測序這項以前專屬于大型測序中心的“特權(quán)”能夠被眾多研 究人員分享。新一代DNA測序技術(shù)有助于人們以更低廉的價格， 更全面、更深入地分

3、析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間交互作用組 的各項數(shù)據(jù)。市面上出現(xiàn)了很多新一代測序儀產(chǎn)品，例如美國 Roche Applied Science公司的454基因組測序儀、美國Illumina公 司和英國Solexa technology公司合作開發(fā)的Illumina測序儀、美 國 Applied Biosystems 公司的 SOLiD 測序儀。Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等 測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標記四種 不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP 就會釋放出不同的熒光，根據(jù)

4、捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算 機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。以Illumina測序 儀說明二代測序的一般流程，（1）文庫制備，將DNA用霧化 或超聲波隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶和外 切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個核 苷酸黏性末端。然后將Illumina測序接頭與片段連接。（2）簇 的創(chuàng)建，將模板分子加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇和測序循環(huán)。芯片 有8個縱向泳道的硅基片。每個泳道內(nèi)芯片表面有無數(shù)的被固定 的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后 與測序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴增 使用。通過不斷循環(huán)獲得上百萬條

5、成簇分布的雙鏈待測片段。（3） 測序，分三步：DNA聚合酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標記簇 成像，在下一個循環(huán)開始前將結(jié)合的核苷酸剪切并分解。（4） 數(shù)據(jù)分析第三代測序技術(shù)-高通量、單分子測序被稱為第三代的測序的He-licos單分子測序儀，PacificBioscience 的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子測 序技術(shù)正向著高通量 低成本長讀取長度的方向發(fā)展。不同于第 二代測序依賴于DNA模板與固體表面相結(jié)合然后邊合成邊測 序，第三代分子測序，不需要進行PCR擴增。（1）Helico BioScience 單分子測序技術(shù)。該測序是

6、基于邊合成邊測序的思想，將待測序 列隨機打斷成小分子片段并用末端轉(zhuǎn)移酶在3末端加上 poly（A）,以及在poly（A）的末端進行熒光標記和阻斷，把這些小片 段與帶有poly（T）的平板雜交成像來獲得已經(jīng)雜交模板所處的位 置，建立邊合成邊測序的位點加入聚合酶和被Cy3熒光標記脫 氧核苷酸進行DNA合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對Cy3成像，觀 測模板位點上是否有熒光信號，然后化學裂解核苷酸上的燃料并 釋放加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進行下一輪反 應(yīng)。（2）Pacific BioscienceSMRTT技術(shù)。該測序也是基于邊合成 邊測

7、序的原理，這項技于使用了 Zero-ModeWaveguide（ZMW）（零 級波導(dǎo)）。測序的過程：被熒光標記磷酸集團的核苷酸在聚合酶 活性位點上與模板鏈結(jié)合（每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料標 記），被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結(jié)束后，被標記的磷酸集團被 切割并釋放，聚合酶轉(zhuǎn)移到下一個位置，下一個脫氧核苷酸連接 到位點上開始釋放熒光脈沖，進行下一個循環(huán)。（3）Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測序技術(shù)。大多數(shù)納米孔 測序技術(shù)的基本原理是當DNA分子或者它的組成堿基從一個孔 洞經(jīng)過時而檢測到被影響的電流或光信號。OxfordNanopore測 序技術(shù)是以a-溶血素

8、來構(gòu)建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔 一側(cè)的外表面，一種合成的環(huán)糊精做為傳感器共價結(jié)合到納米孔 的內(nèi)表面。這個系統(tǒng)被鑲嵌在一個脂雙分子層內(nèi)，為了提供既符 合堿基區(qū)分檢測又滿足外切酶活性的物理條件，脂雙分子層兩側(cè) 為不同的鹽濃度 在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA, 單個堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫的相互作用，影響了 流過納米孔原本的電流，腺嘌吟與胸腺嘧啶的電信號大小很相 近，但胸腺嘧啶在環(huán)糊精停留是時間是其他核苷酸的2-3倍，所 以每個堿基都因其產(chǎn)生電流干擾振幅是特有的而被區(qū)分開來。第一代指雙脫氧末端終止法，擴增后通過毛細管電泳讀取序列， 每次獲取數(shù)據(jù)量少第二代為高通量測序，采用微

9、珠或高密度芯片邊合成邊測序，代表有454, solexa, solid,高通量，可一次獲得數(shù)G數(shù)據(jù)，相對與第三代，都仍然需要擴增的方法放大信號，擴增后再檢測。第三代特點是單分子測序，多基于納米科技，無需擴增，對單分 鏈DNA/RNA直接用合成、降解、通過納米孔等方式直接測序， 核心特點是無需擴增所以成本更低第二代DNA測序技術(shù)編輯本詞條缺少信息欄，補充相關(guān)內(nèi)容使詞條更完整，還能快速升級， 趕緊來編輯吧！第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列， 現(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括Roche/454 FLX、Il

10、lumina/Solexa Genome Analyzer 和 Applied Biosystems SOLID system。目錄1概述2基本原理3操作流程概述編輯DNA測序(DNA sequencing)作為一種重要的實驗技術(shù)，在 生物學研究中有著廣泛的應(yīng)用。早在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)(Watson and Crick,1953)被發(fā)現(xiàn)后不久就有人報道過DNA測序技術(shù)，但是 當時的操作流程復(fù)雜，沒能形成規(guī)模。隨后在1977年Sanger發(fā) 明了具有里程碑意義的末端終止測序法，同年A.M.Maxam和 W.Gilbert發(fā)明了化學降解法。Sanger法因為既簡便又快速，并經(jīng) 過后續(xù)的不斷改良，成為

11、了迄今為止DNA測序的主流。然而隨 著科學的發(fā)展，傳統(tǒng)的Sanger測序已經(jīng)不能完全滿足研究的需 要，對模式生物進行基因組重測序以及對一些非模式生物的基因 組測序，都需要費用更低、通量更高、速度更快的測序技術(shù)，第二代測序技術(shù)（Next-generation sequencing）應(yīng)運而生。這三個技術(shù) 平臺各有優(yōu)點，454 FLX的測序片段比較長，高質(zhì)量的讀長（read） 能達到400bp； Solexa測序性價比最高，不僅機器的售價比其他 兩種低，而且運行成本也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，成本只有 454測序的1/10； SOLID測序的準確度高，原始堿基數(shù)據(jù)的準確 度大于99.94%，而在15

12、X覆蓋率時的準確度可以達到99.999%， 是目前第二代測序技術(shù)中準確度最高的。雖然第二代測序技術(shù)的 工作一般都由專業(yè)的商業(yè)公司來完成，但是了解測序原理、操作 流程等會對后續(xù)的數(shù)據(jù)分析有很重要的作用，下文將以 Illumina/Solexa Genome Analyzer測序為例，簡述第二代測序技術(shù) 的基本原理、操作流程等方面。基本原理編輯Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原 理是邊合成邊 測序。在Sanger等測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏 色的熒光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時， 每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根

13、據(jù)捕捉的熒光信號 并經(jīng)過特定的計算機軟件處理,從而獲得待測DNA的序列信息。 操作流程 編輯1）測序文庫的構(gòu)建（Library Construction）首先準備基因組（雖然測序公司要求樣品量要達到200ng， 但是Gnome Analyzer系統(tǒng)所需的樣品量可低至100ng,能應(yīng)用在很 多樣品有限的實驗中），然后將DNA隨機片段化成幾百堿基或 更短的小片段，并在兩頭加上特定的接頭（Adaptor）。如果是 轉(zhuǎn)錄組測序，則文庫的構(gòu)建要相對麻煩些，RNA片段化之后需 反轉(zhuǎn)成cDNA，然后加上接頭，或者先將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA， 然后再片段化并加上接頭。片段的大小（Insert size）對于后面

14、的 數(shù)據(jù)分析有影響，可根據(jù)需要來選擇。對于基因組測序來說，通 常會選擇幾種不同的insertsize，以便在組裝（Assembly）的時候 獲得更多的信息。錨定橋接(Surface Attachment and Bridge Amplification)Solexa測序的反應(yīng)在叫做flow cell的玻璃管中進行，flow cell 又被細分成8個Lane，每個Lane的內(nèi)表面有無數(shù)的被固定的單 鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測 序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴增使 用。預(yù)擴增(Denaturation and Complete Amplificati

15、on)添加未標記的dNTP和普通Taq酶進行固相橋式PCR擴 增，單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性，釋 放出互補的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環(huán)，將會 在Flow cell的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片 段。單堿基延伸測序(Single Base Extension and Sequencing)在測序的flow cell中加入四種熒光標記的dNTP、DNA聚合 酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每加 入一個被熒光標記的dNTP就能釋放出相對應(yīng)的熒光，測序儀通 過捕獲熒光信號，并通過計算機軟件將光信號轉(zhuǎn)化為測序峰，從 而獲得待測片段的序列信息。從熒光信號獲取待測片段的序列信 息的過程叫做Base Calling， Illumina公司Base Calling所用的軟件 是 Illuminas Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analy