課件管式凝膠等電聚焦

1、管 式 凝 膠 等 電 聚 焦11、實(shí)驗(yàn)原理： 每一種兩性化合物例如蛋白質(zhì)等都有一個(gè)等電點(diǎn)PI,當(dāng)溶液的pH=PI時(shí)，該兩性化合物所帶的凈電荷為零。PH PI時(shí)兩 性化合物帶負(fù)電荷，反之兩性化合物帶正電荷。在電場的作用下，帶正電荷的顆粒向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的顆粒向正極移動(dòng)。 當(dāng)將兩性化合物置于由兩性載體所建立起來的pH梯度體系中進(jìn)行電泳時(shí)，各種兩性化合物就將分別聚集在相當(dāng)其等電點(diǎn)的pH 位置,這即為等電點(diǎn)聚焦。 因?yàn)椴煌膬尚曰衔锲涞入婞c(diǎn)不同，因而可以達(dá)到分離的目的。在實(shí)驗(yàn)過程中，往往由于通電時(shí)產(chǎn)生的熱量引起溶液的對(duì)流致使已分離的區(qū)帶重新混合，因此在電泳中需要有抗電流的穩(wěn)定介質(zhì)，采用聚丙烯酰

2、胺凝膠作為穩(wěn)定介質(zhì)的既稱為凝膠等電聚焦，本實(shí)驗(yàn)采用圓盤電泳裝置進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此亦稱為管式凝膠等電聚焦。 聚丙烯酰胺凝膠有光聚合和化學(xué)聚合兩種方法，本實(shí)驗(yàn)采取光聚合法。加樣有在單體聚合后加樣或是先將樣品混合在單體配制溶液中，然后使單體聚合兩種，本實(shí)驗(yàn)采用后一種。在聚焦以后，通過對(duì)凝膠固定或光密度掃描的方法，將樣品帶顯示出來，然后再與未經(jīng)固定的參比凝膠管測(cè)出的pH梯度曲線比較，而對(duì)應(yīng)出樣品帶所處的相當(dāng)其等電點(diǎn)的pH值。24、試劑與配制：4-1、實(shí)驗(yàn)試 劑： （1）、考馬斯亮蘭G 250 （2）、甲叉雙丙烯酰胺 （Bis） （3）、牛血清白蛋白 （BSA） （4）、兩性載體 (Amphaline pH

3、 4-10） （5）、丙烯酰胺 （Acr） （6）、三氯醋酸 （TCA） （7）、乙二胺 （8）、核黃素 （9）、磷 酸34-2、試劑的配制：（1）、丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）溶液的配制： 分別按表1.比例稱取 丙烯酰胺（Acr），1.6克和甲叉雙丙烯酰 胺（Bis）48毫克于25毫升小燒杯中，加蒸餾水10毫升，溶解即 可。（2）、4%核黃素溶液的配制： 稱取核黃素4毫克，加蒸餾水100毫升，溶解即可。（3）、兩性載體的配制： 直接取Amphaline 40%原液。（4）、測(cè)試的樣品溶液的配制： 稱取牛血清白蛋白2.0毫克，加蒸餾水2.0毫升，溶解即可（濃度 為：mg/ml）

4、。（5）、5%磷酸溶液 上電極槽溶液（正極） 的配制： 吸取磷酸5毫升，加蒸餾水95 毫升，混勻即可（另還用作調(diào)PH 用）。（6）、5%乙二胺溶液 下電極槽溶液（負(fù)極） 的配制： 吸取乙二胺溶液5毫升，加蒸餾水95 毫升，混勻即可。（7）、凝膠固定溶液（15%TCA）的配制： 稱取三氯醋酸15克，溶于100.0ml蒸餾水,混勻即可。45、操作步驟：55-1、凝膠系統(tǒng)的配制：表1：凝膠系統(tǒng)溶液的配制方法表 （ 吸取量:3根管 / 組 ）65-2、凝膠的聚合：（屬光聚合法） 每組同學(xué)輪流排隊(duì)加膠，不得各自分裝以免浪費(fèi) （1）、將清潔、干燥的小玻管一端，用膠布貼封后，朝下 垂直放入有機(jī)玻璃凝膠玻管架

5、的孔中，并在小玻管 的8.0 cm處作一記號(hào)。 （2）、用自動(dòng)取液器（1000 ul）或注射器吸取上述配好 的凝膠溶液沿著小玻管內(nèi)壁小心準(zhǔn)確加入8.0 cm高。 （3）、凝膠加畢后，隨即用注射器吸取蒸餾水，加至管中 的凝膠表面（1.0cm），使其表面覆蓋一水層。 （4）、然后將凝膠管隨支架一同移入日光燈箱內(nèi)進(jìn)行光聚 合約一小時(shí)。在聚合一開始，管中的界面漸至消 退，待膠體形成后，又將重新可辨（一般30分鐘左 右即可），此時(shí)表明膠體已經(jīng)凝聚。7 5-3、聚 焦： 5-3-1、凝膠管的安裝： （1）、取出并選擇合適的聚合完畢的凝膠管，然 后棄去 凝膠管底端膠布，并倒去管端內(nèi)的溶液。 （2）、用滴管分

6、別吸取的上電極槽溶液和下電極槽溶液 洗滌凝膠管的上端和下端的凝膠表面。 （3）、將凝膠管的上端統(tǒng)一插在上電極槽底板的各同心 橡皮圈孔中（注意密封） 85-4、加電極溶液： 先用滴管吸取上電極槽溶液，在每凝膠管上端逐一加滿，然后在 上、下兩極槽內(nèi)分別加入各自的上、下電極槽溶液。其用量，上電 泳槽以電極完全浸入為宜，下電泳槽以凝膠管盡可能全浸入為宜。 提示： 在加入電極溶液時(shí)一定要避免或排除上、下玻管口內(nèi)所留有的 氣泡，另外上、下電極槽內(nèi)的電極溶液不得加錯(cuò)。95-5、電泳： 將上、下電泳槽對(duì)合好，上電極槽電極接電源 的正極，下電極槽電極接電源的負(fù)極，使起始電 壓調(diào)約為200伏，10分鐘后，將電壓調(diào)

7、至250伏特，并在 室溫下恒壓不變，在此條件下聚焦約2小時(shí)，即可。105-6、取出玻管內(nèi)的凝膠：（又稱剝膠） 將一支帶有長針頭的注射器吸有適量水（蒸餾水或自來 水），把針頭慢慢插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，一 邊開始?jí)核?，一邊同時(shí)使針頭慢慢貼緊管壁呈螺旋式前 進(jìn)，如果一端不行，再在管的另一端按同樣的方法剝 離，這樣依靠水流的壓力和滑潤力，使玻管內(nèi)壁與凝 膠分離，最后用洗耳球在管的一端輕輕擠壓，另一端對(duì) 著一干凈大小適宜的培養(yǎng)皿內(nèi)，此時(shí)可以將凝膠柱壓出 玻管。在凝膠擠壓之前先在凝膠一端（陽極或陰極）插 入 一根細(xì)銅絲或硬尼龍絲，作一記號(hào)，以免將極端搞 錯(cuò)。 注意：剝凝膠時(shí)主要一點(diǎn)是不要損傷凝膠柱

8、表面 。115-7、凝膠的處理與pH曲線的測(cè)定： （1）、將取出的兩條凝膠柱，取其中的一條凝膠柱置于 玻板上，自然擺直用直尺分別準(zhǔn)確量取凝膠柱全 長的長度（mm/cm）編為L3。 （2）、量取后的置于玻板上的凝膠與直尺對(duì)應(yīng)好，用刀 片以陽極為起始端，按0.5 cm 一段順序切下， 切下后，將每一段順序放入已編號(hào)的試管中。 （3）、再依次在試管中加入蒸餾水1.0 ml ，抽提2.0小 時(shí)（或過夜）。 （4）、取出抽提液，用pHS2型酸度計(jì)從起始端（陽極） 依次測(cè)定每管的pH值，并記錄所測(cè)定的數(shù)據(jù)（結(jié) 果見表X）。 （5）、然后以pH為縱坐標(biāo)，凝膠長度（mm/cm）為橫坐 標(biāo)，制作出pH曲線圖（結(jié)

9、果見圖X）。125-8、凝膠的固定與等電點(diǎn)的測(cè)定： （1）、將另一條凝膠柱放入一干凈適宜的試管內(nèi)（最好用15 ml的大試 管），加適量的15%的三氯醋酸（TCA）溶液浸泡固定20分鐘，凝膠 中的蛋白質(zhì)區(qū)帶即被固定。 提示：當(dāng)凝膠柱某一段出現(xiàn)一條明顯乳白色的色帶時(shí)，表明已固定完 畢，既可終止固定。 （2）、棄去固定液，凝膠柱在試管中用蒸餾水或自來水漂洗2-3次。 （3）、漂洗完畢，取出凝膠柱于玻板上，用直尺以與pH曲線相同的起點(diǎn) （陽極端）準(zhǔn)確量取凝膠柱中樣品帶的遷移距離（mm/cm）編為L2。 （4）、同時(shí)準(zhǔn)確量取凝膠柱全長（mm/cm）編為L4，記錄（3）、（4）項(xiàng) 中各自所量的數(shù)據(jù)（結(jié)果見

10、表X）。 （5）、由于凝膠柱經(jīng)固定后，長度已發(fā)生變化，因此所測(cè)出的樣品帶的長 度需經(jīng)校正后，才能在長度與pH關(guān)系的曲線上查出對(duì)應(yīng)的與其等電 點(diǎn)相應(yīng)的pH值（結(jié)果見表3）。13其校正的方法如下： L3 L1 = L2 L4 L1 ：測(cè)試品各帶的實(shí)際長度。 L2 ：樣品帶經(jīng)固定后所測(cè)出的長度。 L3 ：供測(cè)pH曲線的參考凝膠柱全長。 L4 ：經(jīng)固定染色后凝膠柱全長。 按效正公式計(jì)算出測(cè)試品各帶實(shí)際長度（結(jié)果見表 X）。146、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 6-1、未固定的凝膠柱分段（0.5cm / 段）測(cè)定pH結(jié)果： 表2.pH測(cè)定結(jié)果表提示：在酸性時(shí)pH不穩(wěn)，隨意測(cè)一下，約接近pH 3.2并有明顯上升梯度 時(shí)，檢測(cè)慢一點(diǎn)，仔細(xì)一點(diǎn)為好。此階段的pH比較穩(wěn)