常用微生物染色方法課件

1、1、革蘭染色2、抗酸染色3、墨汁染色革蘭氏染色革蘭氏染色原理一 通透性學(xué)說(shuō)二 等電點(diǎn)學(xué)說(shuō)三 化學(xué)學(xué)說(shuō) G- / G+ 細(xì)菌細(xì)胞壁比較示意圖肽聚糖層磷脂層LPS磷壁酸 革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層很厚，脂類(lèi)含量較少，酒精不易滲入，而且95酒精可使細(xì)胞壁脫水，間隙變小，通透性降低，阻礙結(jié)晶紫-碘復(fù)合物滲出； 革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較疏松，肽聚糖層很薄，外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被酒精溶解洗出而脫色。 原理一 通透性學(xué)說(shuō)二 等電點(diǎn)學(xué)說(shuō)三 化學(xué)學(xué)說(shuō) 革蘭氏陽(yáng)性菌等電點(diǎn)（pH 2-3）比革蘭氏陰性菌等電點(diǎn)（pH 4-5）

2、低，加之媒染劑碘為弱氧化劑能降低革蘭氏陽(yáng)性菌的等電點(diǎn)，因此在同樣的pH的染色環(huán)境中，陽(yáng)性菌所帶負(fù)電荷比陰性菌多，與帶正電荷的結(jié)晶紫染料能牢固結(jié)合，不易被酒精脫色。 原理一 通透性學(xué)說(shuō)二 等電點(diǎn)學(xué)說(shuō)三 化學(xué)學(xué)說(shuō) 革蘭氏陽(yáng)性菌含有大量核糖核酸鎂鹽，其可與結(jié)晶紫-碘結(jié)合成大分子復(fù)合物，因而不易被95酒精脫色；而陰性菌中此物質(zhì)含量較少，因而吸附染料量很少，分子量也較小，故易被酒精脫色。 原理一 通透性學(xué)說(shuō)二 等電點(diǎn)學(xué)說(shuō)三 化學(xué)學(xué)說(shuō) 細(xì)菌涂片的制備涂片：取一張潔凈載玻片，用已滅菌的接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水于玻片中央，再將接種環(huán)滅菌，取菌與生理鹽水磨勻，涂布成1cm1cm大小區(qū)域的均勻薄膜，使鹽水磨成灰白色為

3、宜，接種環(huán)滅菌后放回試管架。干燥：涂片最好在室溫下自然干燥或?qū)?biāo)本片涂抹面向上，置酒精燈火焰上半尺高處慢慢烘干。固定：常用火焰加熱法，手執(zhí)載玻片一端，標(biāo)本面向上，迅速來(lái)回通過(guò)火焰三次。注意點(diǎn) 取菌量不可太多，涂片應(yīng)均勻，否則影響染色結(jié)果 干燥時(shí)切忌高熱，以免細(xì)菌變形 固定時(shí)溫度不可過(guò)高時(shí)間不可長(zhǎng)，以防涂抹面 燒焦及玻片燒裂固定的目的殺死細(xì)菌，使菌體蛋白凝固，染料易于著色改變細(xì)菌通透性，以利于染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使菌體與玻片粘附牢固，在染色時(shí)不致被染 料和水沖掉BASO快速革蘭染色初染：加龍膽紫液染色10秒，水洗，甩干媒染：加碘液數(shù)滴，染色10秒，水洗，甩干脫色：加脫色液脫色，不時(shí)搖動(dòng)約1020秒，至

4、無(wú)紫色脫落為止，水洗 ，甩干 復(fù)染：加沙黃溶液復(fù)染10秒，水洗，甩干吸水紙吸干，油鏡觀察標(biāo)本 注意事項(xiàng)1染液方面：1）試劑用完后，請(qǐng)迅速蓋好，以免揮發(fā)。2）脫色液用完后，可用丙酮作為代用脫色液，脫色時(shí)間可稍短。3）試劑效期過(guò)后，請(qǐng)不要使用。試劑盒儲(chǔ)存時(shí)，盡量避免高、低溫環(huán)境及陽(yáng)光直射。2涂片染色技術(shù)方面：1）涂片不能太厚，太厚時(shí)常不易完全脫色，使陰性菌呈紫色。2）涂片后最好自然干燥，若用火焰干燥或固定不能太靠近火焰，以免破壞菌體或炭化。3）脫色時(shí)注意勿脫過(guò)頭，使陽(yáng)性變成陰性，尤其是鏈球菌很容易脫過(guò)頭變成陰性。4）染色時(shí)間要掌握好。3. 觀察細(xì)菌形態(tài)或染色性不能用幼齡菌或衰老菌，一般采用培養(yǎng)16

5、-18小時(shí)的菌落或菌液涂片染色。革蘭染色意義鑒別細(xì)菌 革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌選擇藥物 革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)青霉素等敏感 革蘭氏陰性菌對(duì)鏈霉素等敏感與細(xì)菌的致病性有關(guān) 革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生外毒素 革蘭氏陰性菌產(chǎn)生內(nèi)毒素抗酸染色原理：結(jié)核菌、麻瘋桿菌、恥垢菌等抗酸性菌，因其菌體表面有一層類(lèi)脂或脂質(zhì)而不易著色，但一經(jīng)著色后酸或已醇的作用亦是不易脫色。利用此特性并以增強(qiáng)的染色液染色，然后再用酸及乙醇加處理，使其脫色后再對(duì)比染色，此時(shí)抗酸性菌仍是固定著最初色素的顏色（紅色），而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為藍(lán)色。操作步驟1、涂片經(jīng)火焰固定，加石碳酸復(fù)紅溶液用火焰微熱至出現(xiàn)蒸氣約3分鐘（防止染液蒸發(fā)干，必要時(shí)可續(xù)加第

6、一液數(shù)滴，水洗。2、用3%鹽酸酒精脫色約1分鐘，直至涂片無(wú)色或淡粉紅色為止，水洗3、再加復(fù)染液復(fù)染1分鐘，水洗，干后鏡檢。結(jié)果判斷 抗酸桿菌呈紅色，其他細(xì)菌及細(xì)胞呈藍(lán)色。注意事項(xiàng)1抗酸染色直接用于痰標(biāo)本時(shí)，可以適當(dāng)增加標(biāo)本涂片的厚度，發(fā)提高檢出率。染厚涂片時(shí)，須掌握復(fù)染時(shí)間，如果背景過(guò)深，會(huì)影響鏡檢。痰標(biāo)本找抗酸桿菌，應(yīng)先高壓殺菌，避免實(shí)驗(yàn)室污染。2尿、糞中找到抗酸桿菌須作潘氏染色，排除恥后桿菌，才能報(bào)告。標(biāo)本中找到抗酸桿菌，須作傳染病報(bào)告。3離心應(yīng)為3000轉(zhuǎn)/分，30分鐘。4涂片至少保留三個(gè)月。墨汁染色通常用于檢查腦脊液或分泌物涂片中的隱球菌，具有方便、快速、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)，是涂片中檢查隱球菌感染的首選方法。隱球菌： 顯微鏡暗視野（負(fù)染）下找隱球菌，可見(jiàn)圓形菌體，外周有一圈透明的肥厚莢膜，內(nèi)有反光孢子，但無(wú)菌絲。反復(fù)多次查找 陽(yáng)性率高，腦脊液應(yīng)離心后沉淀涂片。隱球菌墨汁染色陽(yáng)性，需進(jìn)一步做真菌培養(yǎng)操作步驟： 腦脊液等其他標(biāo)本離心取沉淀物或者挑取菌液1環(huán)涂于沽凈玻片上，然后加印度墨汁1環(huán)，覆以蓋玻片