第八章DNA重組與轉(zhuǎn)座ppt課件

1、DNA重組與轉(zhuǎn)座概述第一節(jié) 同源重組第二節(jié) 位點(diǎn)專注性重組第三節(jié) 轉(zhuǎn)座作用第四節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子概述： 只需有DNA，就會(huì)發(fā)生重組減數(shù)分裂高等Euk.體細(xì)胞核基因、葉綠體和線粒體溫暖噬菌體轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座 生存變異突變，重組 損傷修復(fù)、順應(yīng)環(huán)境、加速進(jìn)化 廣義遺傳重組：任何呵斥基因型變化的基因交流過程 DNA重組 DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合。1同源重組2位點(diǎn)特異性重組3轉(zhuǎn)座重組4異常重組 DNA重組可分為四類DNA序列、蛋白質(zhì)因子 重組DNA技術(shù) 第一節(jié) 同源重組1、 同源重組homologous recombination: 發(fā)生在同源DNA序列之間一、特征2、 特征： 涉及同源序列

2、間的聯(lián)會(huì)配對(duì)，且交換的片段較大 涉及DNA分子在特定的交換位點(diǎn)發(fā)生斷裂和錯(cuò)接的生化過程 異源雙鏈區(qū)的生成 存在重組熱點(diǎn) 需求重組酶 單鏈DNA分子或單鏈DNA末端是交換發(fā)生的重要信號(hào)細(xì)線期合線期粗線期雙線期終變期 e.g. Euk.減數(shù)分裂時(shí) 的染色單體之間 的交換 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化， 轉(zhuǎn) 導(dǎo)，接合，噬菌體 重組雙倍體染色體交換二 同源重組的分子模型1.Holliday于1964年提出Holliday模型1兩個(gè)同源染色體DNA陳列整齊2兩DNA分子同一部位兩單鏈發(fā)生斷裂引發(fā)重組3斷裂的單鏈游離末端彼此交換構(gòu)成Holliday中間體4經(jīng)過分支遷移產(chǎn)生異源雙鏈DNA分子。5中間體在內(nèi)切酶和銜接酶作用下，

3、構(gòu)成拼接重組體和片段重組體。SynapsedchromatidsRecombinationjointHeteroduplex DNA5512片段重組體拼接重組體Holliday中間體3553Meselson-Radding模型單鏈入侵模型鏈轉(zhuǎn)移模型置換侵入Loop切除同化 異構(gòu)化 分支遷移5切割雙鏈斷裂修復(fù)模型 2、 分枝遷移和Holliday中間體構(gòu)造的拆分 分枝遷移branch migaration 雙螺旋構(gòu)成的交叉銜接以拉鏈?zhǔn)叫?yīng)分散Holliday的異構(gòu)化產(chǎn)生重組體的拆分Holliday構(gòu)造一經(jīng)生成即可不斷地處于異構(gòu)化異源雙鏈 heteroduplex DNA重組結(jié)果取決于拆分時(shí)配對(duì)鏈

4、上的切口位置1212 Holliday構(gòu)造的拆分產(chǎn)生含異源雙鏈的片段重組體產(chǎn)生拼接重組體“親本鏈-片段重組體“拼接重組體三、原核同源重組E.coli 發(fā)生在雙方DNA的同源區(qū)域 部分復(fù)制的染色體DNA之間或染色體DNA與外源DNA之間 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo) 1、RecBCD酶和 Chi 位點(diǎn) RecBCD酶具有ATP依賴的解旋酶活性、依賴于ATP的核酸外切酶活性、序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性. 單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈 RecA的作用位點(diǎn) Chi位點(diǎn)含有GCTGGTGG序列,是基因recBCD編碼RecBCD酶作用的靶位點(diǎn)3 RecBCD的識(shí)別和切割位點(diǎn)a、 R

5、ecBCD結(jié)合在DNA的平 頭末端產(chǎn)活力制不清楚b、 外切、解鏈、挪動(dòng) ATPc、 兔耳狀 loop 構(gòu)造產(chǎn)生再旋酶活性低于解旋酶活性d、 RecBCD 在 loop 單鏈區(qū)的 chi 位點(diǎn)3方46NT處切 斷單鏈單鏈內(nèi)切酶 chi位點(diǎn)：GCTGGTGG 目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點(diǎn) E.coli 含 1000 個(gè)、Euk.e、 RecBCD 切割產(chǎn)生3單鏈末端 2、RecA 蛋白 1 活性a、 RecA 有單、雙鏈 DNA 結(jié)合活性 b、 RecA 有 NTPase 活性底物差別活性 與單鏈 DNA 結(jié)合時(shí)活性最大-依賴于 DNAc、 RecA 有啟動(dòng)一個(gè)分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分子 的才干，即聯(lián)會(huì)

6、同源 DNA 但其靶 DNA 必需有缺口結(jié)合DNARecA入侵單鏈被置換連RecA引發(fā)鏈侵入模型RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end. RecA啟動(dòng)的單鏈入侵RecA引起的鏈交換和Holliday構(gòu)造的生成 2RecA 蛋白催化雙鏈和單鏈 DNA 的反響階段a、 聯(lián)會(huì)前階段緩慢 RecA 與單鏈結(jié)合b、 單鏈與雙螺旋的互補(bǔ)鏈迅速配對(duì)，構(gòu)成雙鏈銜接分子 Holliday5侵入c、

7、從雙螺旋構(gòu)造中緩慢置換一條鏈產(chǎn)生一段長(zhǎng)的異源雙鏈 DNA 反響終了時(shí)，RecA 結(jié)合到雙鏈上 其中單鏈同化有固定的方向 入侵單鏈為53 雙鏈 DNA 的互補(bǔ)鏈?zhǔn)?5 RecBCD 和 RecA 的共同作用 3、原核同源重組的其它蛋白 需求 E.coli 中三個(gè)基因 ruvA,ruvB 和 ruvC 的產(chǎn)物 a、 RuvA 識(shí)別 Holliday 構(gòu)造的銜接點(diǎn)b、 RuvB 為分枝遷移提供動(dòng)力ATPase 1020bp/s c、 RuvC 核酸內(nèi)切酶-專注性識(shí)別 Holliday 構(gòu)造的銜接點(diǎn) 體外切段銜接點(diǎn)以拆分重組體 E.coli 重組的各階段 損傷修復(fù)損傷DNA復(fù)制產(chǎn)生缺口RecA鏈交換第

8、二次鏈交換DNApol經(jīng)過DNA合成填滿缺口RuvA,B分枝遷移RuvC切割Holliday銜接點(diǎn)第二節(jié) 位點(diǎn)專注性重組一、位點(diǎn)專注性重組 site-specific recombination1、概念：發(fā)生在專注序列的DNA分子間的重組,有特異的 重組酶和輔助因子對(duì)其識(shí)別和作用。噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體基因組中屬此種重組2、位點(diǎn)特異性重組的結(jié)果依賴于重組位點(diǎn)的位置和方向二、phage的整合與切除1、實(shí)現(xiàn)機(jī)制：均是經(jīng)過-細(xì)菌DNA和DNA上特定位點(diǎn)之間的重組2、特定位點(diǎn)-附著位點(diǎn)attachment site att E.coli attB 含BOB序列 23bp phage attP 含

9、 POP序列 240bp 中心序列 “O區(qū)完全一致 同源部分15bp -位點(diǎn)特異性重組發(fā)生的地方3、整合過程 整合后的附著位點(diǎn)為 attLBOP attRPOB 整合位點(diǎn)-attB、attP 切除位點(diǎn)-attL、attR 整合過程需求整合酶 integrase Int編碼 和寄主的整合宿主因子IHF integration host factor 共同作用溶源性細(xì)菌(lysogen)溶菌周期lysis原噬菌體4、整合分子機(jī)制 中心序列O全長(zhǎng)15bp，富含A-T 發(fā)生在O內(nèi)的重組交換位點(diǎn)相距 7bp 整合酶的結(jié)合位點(diǎn)：attP 240bp、attB 23bp(兩者的作用不同) attP位點(diǎn)的負(fù)超

10、螺旋為重組所必需-加強(qiáng)了Int和IHF的親和力 -高劑量的蛋白維持單鏈重組所必需的構(gòu)造 Int結(jié)合 -中心序列的反向位點(diǎn)切割位置 -結(jié)合在att臂上臂與中心區(qū)接近intIHFXis 整合體及其作用 整合體intasome- Int和IHF結(jié)合到attP時(shí)的復(fù)合物 整合體捕獲attB 闡明- a、attB和attP的最初識(shí)別靠Int 識(shí)別兩序列的才干 b、兩序列的同源性在鏈交換時(shí)為 重要要素 Int蛋白能切斷DNA，并使它重新銜接，近而使holliday構(gòu)造拆分 重組時(shí)attP和attB部位交叉斷裂，互補(bǔ)單鏈末端進(jìn)展交叉雜交5、整合與切除的控制1 整合 C-促使阻遏蛋白C的產(chǎn)生 -與int ge

11、ne 的PI結(jié)合，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Int蛋白 -且PI位于xis基因內(nèi)，C與PI結(jié)合導(dǎo)致xis gene失活2 切除 寄主SOS反響時(shí)-RecA大量產(chǎn)生，促使阻遏蛋白C的水解 -把OL和OR從阻遏形狀釋放出來 -從PL轉(zhuǎn)錄使int和xis表達(dá)細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組鼠傷寒沙門氏桿菌鞭毛蛋白H1和H2轉(zhuǎn)換四、依賴于同源重組的位點(diǎn)特異性的序列代換 -酵母MAT序列的轉(zhuǎn)換1、 酵母結(jié)合型的轉(zhuǎn)變-DNA序列的代換，而不是互換 -依賴于序列的同源性 被代換的序列命運(yùn)是被降解-突變實(shí)驗(yàn)2、 同源序列 匣子 W X Y Z1 Z2 total HML 723 704 747 239 88 2501 MAT 723 704

12、 747 239 88 2501 MATa 723 704 642 239 88 2369 HMRa 704 642 239 88 15853、 轉(zhuǎn)換過程 內(nèi)切酶(HO)識(shí)別、切割-Y/Z1交界處-起始MAT序列的轉(zhuǎn)換 (雙鏈斷裂) HM匣子受Sir阻遏蛋白的維護(hù) Y區(qū)域被降解，直到Y(jié)和Ya一樣的部分或不斷到X區(qū)域 四個(gè)斷頭侵入供體匣子的同源部分并與其中互補(bǔ)鏈配對(duì) 以供體DNA為模板復(fù)制Y區(qū)域，holliday構(gòu)造構(gòu)成 Holliday構(gòu)造的拆分，產(chǎn)生新的MAT匣子和這次轉(zhuǎn)換中的供體匣子4、 特征-同源重組和位點(diǎn)特異性重組特征都具有 需求大范圍的同源序列 需求重組酶系rad52基因產(chǎn)物、位點(diǎn)特

13、異性的HO內(nèi)切酶第三節(jié) 轉(zhuǎn)座作用一、轉(zhuǎn)座子概述1、轉(zhuǎn)座子(元)或轉(zhuǎn)座元件(transposon or transposable element): 基因組上不用借助于同源序列就可以挪動(dòng)的DNA片段，它們可以直 接從基因組的一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)供體和受體轉(zhuǎn)座transposition：轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移過程2、發(fā)現(xiàn)和開展 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉層花斑突變 玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機(jī)理 騰躍基因jumping gene 1947 冷泉港實(shí)驗(yàn)室美 Barbara McClintock 基因轉(zhuǎn)座景象的再次發(fā)現(xiàn)與證明 在一個(gè)支配子

14、中， 與支配基因毗連的構(gòu)造基因發(fā)生終止突變后，它除了影響該基因本身產(chǎn)物的翻譯外，還影響其后構(gòu)造基因多肽的翻譯，并且具有極性梯度的特征。 插入型極性突變的發(fā)現(xiàn)與機(jī)理Operon & Polarity Mutation 極性突變的根本概念A(yù)酶活性 O gene Z 基因終止突變位 點(diǎn)離O基因的間隔 I p o Z Y A20世紀(jì)60年代末期,在不同實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一系列可轉(zhuǎn)移的抗藥性轉(zhuǎn)座子1983年Barbara McClintock被授予諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。a) 不依賴供體序列與靶位點(diǎn)間序列的同源性b) 轉(zhuǎn)座不是簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)移，涉及轉(zhuǎn)座子的復(fù)制Hotspots (熱點(diǎn))Regional preferen

15、ce ( 在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)插入) d) 某些轉(zhuǎn)座因子Tn3對(duì)同類轉(zhuǎn)座因子的插入具有排他性 免疫性e) 靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)構(gòu)成正向反復(fù) f) 轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)3、轉(zhuǎn)座重組的特點(diǎn)c) 轉(zhuǎn)座插入的靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī)插入專注型二、Prok.轉(zhuǎn)座子種類 兩種類型： 簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子simple transposon 插入序列 insertion sequence IS 復(fù)合轉(zhuǎn)座子composite transposon 共同特征： a兩端有2040bp的IR b具有編碼轉(zhuǎn)座酶transposase的基因1、插入序列 最簡(jiǎn)單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分 命名： I

16、S編號(hào)鑒定類型 長(zhǎng)度 7002000bp 特點(diǎn)： a兩端IR為轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別位點(diǎn)突變 b插入靶位點(diǎn)后會(huì)出現(xiàn)靶位點(diǎn)的正向反復(fù)39bp IS 可以正反方向插入到DNA宿主、質(zhì)粒或某些噬菌體， 常對(duì)插入位點(diǎn)后面的基因表達(dá)功能產(chǎn)生極性效應(yīng)a) Tn / TnA family l 具有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、 調(diào)理基因解離酶、抗抗生素基因 l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) 2.5 kb 20 kb Tn3 IR TnpA R

17、es TnpR AmpR IR 38bp 38bp 轉(zhuǎn)座酶 regulator - 內(nèi)酰胺酶 2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子 兩種類型 b兩端反復(fù)序列為IS的復(fù)合轉(zhuǎn)座子 e.g. IS插入到功能基因兩端，能夠構(gòu)成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子IS ISIS IS L IS R臂 中心區(qū) 臂transposition 當(dāng)兩個(gè)IS組件一樣時(shí)，其中任一個(gè)都可行使轉(zhuǎn)座功能 不同時(shí)，主要依托一個(gè) 兩側(cè)的IS既可以是IR，又可以是DR形狀I(lǐng)R多3 轉(zhuǎn)座噬菌體 Mu phage 巨型轉(zhuǎn)座子 C repressor for A, BB 33 kd 與轉(zhuǎn)座有關(guān)A 70 kd 轉(zhuǎn)座酶U, S 毒性蛋白attL, attR 與寄主同源，反向反復(fù)，轉(zhuǎn)

18、座必需 Gin G區(qū)倒位酶 att L C A B S U att R 150bp 1.5kb G 倒位區(qū) 38kbPgin 以E.coli為寄主的溫暖型噬菌體溶源、裂解 Mu的插入途徑a 侵入的Mu在溶源化過程中恣意插入寄主DNA 兩側(cè)各5bp的靶位點(diǎn)序列反復(fù)b 進(jìn)入裂解生長(zhǎng)后，復(fù)制產(chǎn)生后代Mu DNA幾乎全部插入寄主 DNA中，并可繼續(xù)轉(zhuǎn)座構(gòu)成寄主DNA和Mu的共合體，噬 菌體成熟時(shí)，切段共合體包裝三、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)作機(jī)制及方式 三種類型：復(fù)制型、非復(fù)制型和保守型1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座方式 本質(zhì)：轉(zhuǎn)座子元件被復(fù)制并被挪動(dòng)到受體位點(diǎn)，最終轉(zhuǎn)座過程 擴(kuò)增了轉(zhuǎn)座子的拷貝供、受點(diǎn) 需兩種酶： 轉(zhuǎn)作酶作用于原拷

19、貝兩末端 解離酶作用于復(fù)制后的拷貝 方式： 兩大步 a) 共合體構(gòu)成 切口銜接復(fù)制 b) 拆分 靶位點(diǎn)的DR構(gòu)成2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座方式 供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂 供體位點(diǎn)如不能被修復(fù)那么有致 死效應(yīng)3、保守型轉(zhuǎn)座方式 另一種非復(fù)制型 與整合機(jī)制類似 其轉(zhuǎn)座酶與整合酶家 族有關(guān)4、TnA轉(zhuǎn)座方式 復(fù)制型轉(zhuǎn)座 轉(zhuǎn)座酶(tnpA)、 解離酶(tnpR) 解離酶需求特異的內(nèi) 部位點(diǎn) 雙重功能：解離功能 tnpA及本身的阻遏物 拆分位點(diǎn) res 共合體拆分位點(diǎn) 轉(zhuǎn)座結(jié)果產(chǎn)生5bp 的正向反復(fù)序列 四、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座頻率的調(diào)控 每個(gè)轉(zhuǎn)座子控制本身轉(zhuǎn)座的中心-控制轉(zhuǎn)座酶的程度 1、Tn10轉(zhuǎn)座機(jī)制 Tn10為復(fù)合型

20、轉(zhuǎn)座子 IS10R元件提供轉(zhuǎn)座酶活性-合成轉(zhuǎn)座酶的序列 自發(fā)轉(zhuǎn)座頻率-107 Tn10轉(zhuǎn)座酶程度是控制轉(zhuǎn)座的關(guān)鍵 有兩種控制轉(zhuǎn)座的方式 a 經(jīng)過反義RNA的翻譯程度控制 IS10R外側(cè)邊緣兩個(gè)啟動(dòng)子 PIN控制IS10R的轉(zhuǎn)錄 弱啟動(dòng)子 POUT強(qiáng)啟動(dòng)子 右向轉(zhuǎn)錄宿主DNA INRNA和OUTRNA 有36bp的重疊 穩(wěn)定性： OUTRNAINRNA 大量OUTRNA作為 INRNA的反義RNA b 甲基化作用控制轉(zhuǎn)座酶合成及其與DNA的結(jié)合 Tn10轉(zhuǎn)座酶啟動(dòng)子含有GATC序列其它轉(zhuǎn)座子 E.coli中Dam甲基化酶 作用使啟動(dòng)子相對(duì)鈍化 只能利用剛剛復(fù)制完成 時(shí)出現(xiàn)少數(shù)轉(zhuǎn)座酶 此外，IS10R的末端 IR也含有GATC， 甲基化的GATC不能 結(jié)合轉(zhuǎn)座酶 Tn10在DNA剛剛 復(fù)制后發(fā)生轉(zhuǎn)座五、轉(zhuǎn)座子的某些遺傳學(xué)效應(yīng)1.轉(zhuǎn)座頻率10-810-3，引起插入突變；2.插入位置染色體重排而出現(xiàn)新基因；3.影響插入位置臨近基因的表達(dá),使宿主表現(xiàn)型改動(dòng)；4.引起染色體插入位點(diǎn)兩側(cè)染色體畸變。 真核生物的轉(zhuǎn)座成分根據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制目前分為兩類： a) 轉(zhuǎn)座機(jī)制與細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子類似 遺傳信息： DNADNA 玉米的Ac-Ds