桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)及桿狀病毒滴度測(cè)定課件

1、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)疫苗實(shí)驗(yàn)體液免疫與細(xì)胞免疫的檢測(cè)&桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)重組pFastBac質(zhì)粒的構(gòu)建重組Bacmid的產(chǎn)生與鑒定獲得重組桿狀病毒蛋白表達(dá)&病毒擴(kuò)大OverviewBac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有效的獲得重組桿狀病毒，其重組是基于供體質(zhì)粒表達(dá)盒與桿狀病毒穿梭載體Bacmid間發(fā)生位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座。供體質(zhì)粒pFastBac：靶基因位于桿狀病毒特異啟動(dòng)子下游DH10Bac：桿狀病毒穿梭載體Bacmid + 輔助質(zhì)粒Bac-to-Bac 表達(dá)系統(tǒng)的組成和工作原理Bac-to-Bac 表達(dá)系統(tǒng)的組成和工作原理Expermi

2、antal outlineInsect Cell Lines：Sf9 or Sf21 cells主要用于轉(zhuǎn)染，空斑實(shí)驗(yàn)和滴度測(cè)定High Five cells or Mimic Sf9 cells轉(zhuǎn)染效率低，主要用于蛋白表達(dá) Graces Insect Medium with L-glutamine and supplemented with（pH 6.5）： 3330 mg/L lactalbumin hydrolysate3330 mg/L yeastolate350 mg/L NaHCO310% heat-inactivated fetal bovine serum昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)Atmo

3、sphere：air, 100% pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your handTemperature：27.028.0 Subculturing：Preservation：90% serum, 10% DMSO嚴(yán)格程序降溫，-80 過(guò)夜后轉(zhuǎn)移液氮保存。昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)重組pFastBac質(zhì)粒的構(gòu)建選擇合適的載體 重組Bacmid的產(chǎn)生重組Bacmid的鑒定PCR法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者

4、pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insertBacmid DNA 135kb獲得重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染Sf9 cells1. 小提好的Bacmid DNA，置4 不超過(guò)1周2. 轉(zhuǎn)染試劑：Cellfectin Reagent3. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的形態(tài)變化細(xì)胞變大增殖明顯變慢或不增殖裂解脫落融合(VSV/G)或4. 收毒，短期內(nèi)4 避光保存，長(zhǎng)期保存分裝后置-80 病毒擴(kuò)增&蛋白表達(dá) 擴(kuò)增病毒：接毒量為 0.050.1 MOI一般情況下，P1代毒滴度大概為1106 1107 PFU/ml，

5、 P2 代毒滴度11071108 PFU/ml比如：P1代毒滴度為5106 PFU/ml，T75細(xì)胞瓶的細(xì)胞量 2107cells，那么蛋白表達(dá)：接毒量為 15 MOI桿狀病毒滴度測(cè)定兩種病毒滴度測(cè)定方法的比較：空斑實(shí)驗(yàn)法測(cè)定滴度依賴于病毒在感染細(xì)胞中的復(fù)制以及感染周邊細(xì)胞形成局灶型病變；而免疫染色法只需要病毒感染靶細(xì)胞并表達(dá)病毒所編碼的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）測(cè)定病毒滴度需要的時(shí)間比空斑法（PFU/ml）更短。BacPAK Rapid Titer Kit 本測(cè)定方法，以針對(duì)桿狀病毒囊膜蛋白gp64的單克隆抗體標(biāo)記被病毒感染

6、的細(xì)胞，然后以HRP-標(biāo)記的二抗與感染細(xì)胞進(jìn)行染色。通過(guò)底物顯色，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)感染斑點(diǎn)的數(shù)量，經(jīng)過(guò)稀釋倍數(shù)的換算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。注意事項(xiàng)： 細(xì)胞鋪板5 106 cells/well，細(xì)胞計(jì)數(shù)要準(zhǔn)，臺(tái)盼藍(lán)染 色，保證細(xì)胞活力 95%。2. 病毒稀釋要準(zhǔn)，不同濃度之間換槍頭，是確保不同稀釋 度孔斑點(diǎn)成10倍關(guān)系的關(guān)鍵。3. 整個(gè)過(guò)程中，輕輕洗板，避免細(xì)胞脫落過(guò)多。4. 實(shí)驗(yàn)完畢3 h后數(shù)斑，效果更佳。5. 結(jié)果判定：疫苗免疫動(dòng)物后免疫效力評(píng)價(jià)體液免疫檢測(cè)ELISA抗體中和抗體細(xì)胞免疫檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA水平檢測(cè)qPCR細(xì)胞因子蛋白質(zhì)水平檢測(cè)ELISA淋巴增殖實(shí)驗(yàn)MTT法

7、ELISA抗體 制備良好的抗原包被ELISA板純化的蛋白或病毒3. 設(shè)置空白孔（不加血清），統(tǒng)計(jì)結(jié)果時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)組的 OD值先減掉背景值，再計(jì)算比值和滴度。（1）蛋白質(zhì)與酶標(biāo)板的結(jié)合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白質(zhì)疏水鍵的適當(dāng)暴露。（2）酶標(biāo)板聚苯乙烯表面暴露的主要是CH鍵，包被液PH大于蛋白PI，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷，有利于蛋白質(zhì)與酶標(biāo)板的牢固結(jié)合，提高包被效率。每次包被板子條件一致， 4 16-18h。2. 血清樣品不溶血，防止干擾結(jié)果。方陣滴度確定最佳抗原包被濃度。微量中和實(shí)驗(yàn)技術(shù)中和抗體中和實(shí)驗(yàn)原理分 類固定病毒稀釋血清法固定血清稀釋病毒法（用的很少

8、）用 途疾病診斷病毒分離株的鑒定不同病毒株的抗原關(guān)系研究疫苗免疫原性的評(píng)免疫血清的質(zhì)量評(píng)價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中是否存在抗體材 料 病毒（1）凍存的病毒不能重復(fù)使用（2）進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)前，需先進(jìn)行病毒滴定（TCID50）的滴定進(jìn)行病毒定量2. 血清樣品（1）血清樣品分裝凍存于-20 ，一般不要反復(fù)凍融3次以上。（2）血清樣品不溶血，不長(zhǎng)期凍存，以減少對(duì)細(xì)胞的毒性。（3）需要有陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清，實(shí)驗(yàn)前需56滅活30分鐘。3. 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)試劑（1）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（2）DMEM/血清/胰酶/抗生素固定病毒稀釋血清法 將不同稀釋度的血清與固定量的?。?00TCID50、EID50或LD50）混合，適當(dāng)

9、的條件下感作一定時(shí)間以后，再將血清-病毒混合物接種于敏感細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，測(cè)定被檢血清阻止組織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物發(fā)生病毒感染的能力及其效價(jià)。以能保護(hù)50%組織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物不發(fā)生病變、感染或死亡的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的50%中和效價(jià)(PD50)。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入37 5% CO2培養(yǎng)箱中作用45 min60 min。感作完成后每孔加入100 l細(xì)胞懸液，繼續(xù)置37 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果，一般要觀察4-5天。 結(jié)果計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進(jìn)行。距離比例=(高于50%的保護(hù)率-50% )/(高于50%的保護(hù)率-低于

10、50%的保護(hù)率) =(66.7-50)/(66.7-16.7) =0.33 PD50=-1.299的反對(duì)數(shù)=0.05=1/20即1:20稀釋的待檢血清可保護(hù)50%的組織培養(yǎng)細(xì)胞不出現(xiàn)CPE中和效價(jià)(PD50)的計(jì)算：lgPD50=高于50%保護(hù)率的血清稀釋度的對(duì)數(shù) +距離比例稀釋度對(duì)數(shù)的差 =-1.2+0.33(-0.3) =-1.299固定血清稀釋病毒法 在固定量的血清中，加入等量不同稀釋度的病毒，用對(duì)照非免疫血清（對(duì)照組）和待檢血清同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算每一組的TCID50、EID50或LD50，然后計(jì)算中和指數(shù)。注意事項(xiàng)： 待檢血清需56滅活30分鐘。 需重復(fù)測(cè)定抗體時(shí)，血清應(yīng)分裝后凍存，以

11、免反復(fù)凍融。 細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，嚴(yán)禁細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)或老化，細(xì)胞 活力 95%。4. 牛血清有中和病毒感染力的作用，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中切勿將細(xì)胞 培養(yǎng)液與病毒稀釋液混淆使用。5. 病毒與抗血清混合，常規(guī)采用37作用1小時(shí)。但針對(duì)不 同耐熱性的病毒，孵育溫度和時(shí)間應(yīng)有所增減。6. 每份血清做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。細(xì)胞免疫的檢測(cè)首先要完成淋巴的分離和體外刺激包括脾淋巴細(xì)胞/外周血單核細(xì)胞的分離 脾細(xì)胞的分離： 2.將脾臟轉(zhuǎn)入勻漿器中，加少量不完全1640，輕輕研磨。1.處死的小鼠經(jīng)消毒后，放置于泡沫板右側(cè)臥固定，剪開(kāi)左側(cè)背腹交界處皮膚，分三套鑷子/剪刀無(wú)菌取脾臟3.靜置，吸上清液入15 ml離心管中，1000r

12、pm10 min。4.棄上清，加入5 ml的8.3g/l NH4Cl，靜止5 min (去除紅細(xì)胞)，1000 rpm 10 min。5.棄上清，用不完全RPMI-1640洗滌，1000 rpm 10 min。6. 細(xì)胞計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色，要求細(xì)胞活性應(yīng)在95%以上。7.調(diào)整濃度為4106 cells/ml。外周血單核細(xì)胞的分離 ： 細(xì)胞因子的定量PCR檢測(cè)： （1）于24孔板中加入適量的相關(guān)刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后將濃度為4106 cells/ml的細(xì)胞懸液加至各孔內(nèi)，每孔1 ml。（2）置37 ，5 % CO2溫箱中培養(yǎng)2

13、0 h，提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定 RNA濃度和純度。（3）取0.5 g RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑）。（4）定量PCR：Primer-Forward（IFN-/IL-4/-actin）1 l（10 M）Primer-Reverse（IFN-/IL-4/-actin）1 l（10 M）2SYBR Green Real-time PCR Master Mix12.5 lcDNA1 lROX0.05 lH2O9.45 l總25 L細(xì)胞因子的ELISA檢測(cè)： （1）于24孔板中加入適量的相關(guān)刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后將濃度為4106 cells/ml的細(xì)胞懸液加至各孔內(nèi)，每孔1 ml。（2）置37 ，5 % CO2溫箱中培養(yǎng)72 h后，收取細(xì)胞上清。（3）