細(xì)胞培養(yǎng)基本方法(復(fù)蘇、換液、傳代、凍存)課件

1、細(xì)胞培養(yǎng)1一 原代培養(yǎng)（略）2二. 傳 代 培 養(yǎng) 準(zhǔn)備及注意事項(xiàng) 換 液 傳 代 凍 存 復(fù) 蘇 MTT3準(zhǔn)備事項(xiàng)紫外燈照射細(xì)胞室30分鐘,風(fēng)機(jī)運(yùn)行10分鐘后方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室.穿專(zhuān)用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等.帶手套,并用酒精擦拭之.準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)必需用品.超凈工作臺(tái)內(nèi)操作前用酒精棉球擦拭臺(tái)面.超凈工作臺(tái)內(nèi)操作完成后，要用酒精棉球擦拭臺(tái)面,除了酒精燈,鑷子,試管架等物品外,其他都要拿出工作臺(tái)外.紫外燈照射30分鐘.4換液把細(xì)胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出, 擰緊蓋子;觀(guān)察瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的顏色, 是否渾濁等; 放在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。放入超凈工作臺(tái)內(nèi),點(diǎn)燃酒精燈,拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)兩圈以上,

2、至少三秒.取下蓋子,燒瓶口;倒掉培養(yǎng)基,燒瓶口;拿出PBS液瓶子,燒瓶口和鑷子;用鑷子將塞子取出,燒瓶口（至少10圈）。56.用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。燒培養(yǎng)瓶口， 來(lái)回晃動(dòng)PBS100次后到掉PBS。重復(fù)此操作一次。7.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出， 燒瓶口（至少10圈）。8.用吸管吸取5ml-8ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，燒瓶口， 鑷子和蓋子；9.蓋上蓋子，倒置顯微鏡下觀(guān)察，之后標(biāo)明名稱(chēng)和日期， 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi)即可。 注意：1.打開(kāi)培養(yǎng)箱時(shí)盡量不要說(shuō)話(huà)；2.步驟9中培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時(shí)，應(yīng)把蓋子擰開(kāi)少許。 6傳代1.把細(xì)胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出

3、，擰緊蓋子；2.觀(guān)察瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的顏色，是否渾濁等；放在 倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。3.放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，拿培養(yǎng)瓶 口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)兩圈以上，至少三秒。4.取下蓋子，燒瓶口；倒掉培養(yǎng)基，燒瓶口；5.拿出PBS瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞 子取出，燒瓶口（至少10圈）。7 6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。燒培養(yǎng) 瓶口，來(lái)回晃動(dòng)PBS100次后到掉PBS。重復(fù)此 操作一次。7.拿出胰酶瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取 出，燒瓶口（至少10圈）。8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，燒培養(yǎng) 瓶口和蓋子，蓋上蓋子；9.拿出工作臺(tái)外，在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞，然后 用酒

4、精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi)；5分鐘 后取出；810.在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的消化情況。若 細(xì)胞變成單個(gè)圓形，則可進(jìn)行傳代。11.拿到工作臺(tái)內(nèi)，燒瓶口，取下蓋子，燒瓶 口。用吸管吸出胰酶，燒瓶口。12.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子 將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。13.用吸管吸取5ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)， 用吸管吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)，分裝 即可。9凍存1.把細(xì)胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出，擰緊蓋子；2.觀(guān)察瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的顏色，是否渾濁等；放在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。3.放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)兩圈以上，至少三秒。4.取下蓋子，燒瓶口；倒掉培養(yǎng)基

5、，燒瓶口；5.拿出PBS瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。106. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。燒培養(yǎng)瓶口，來(lái)回晃動(dòng)PBS100次后到掉PBS。重復(fù)此操作一次。7. 拿出胰酶瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，燒培養(yǎng)瓶口和蓋子，蓋上蓋子；9. 拿出工作臺(tái)外，在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi)；5分鐘后取出；10. 在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的消化情況。若細(xì)胞變成單個(gè)圓形，則可進(jìn)行傳代。1111.拿到工作臺(tái)內(nèi)，燒瓶口，取下蓋子，燒瓶 口。用吸管吸出胰酶，燒瓶口。12

6、.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子 將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。13.用吸管吸取5ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用吸管 吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液。14.用吸管將細(xì)胞懸液移至5ml離心管中，蓋上蓋 子，在離心機(jī)內(nèi)離心，1500轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為15 分鐘。15.離心結(jié)束后，拿至工作臺(tái)內(nèi)，燒離心管口。去掉 塞子，燒管口。1216.棄上清液，加凍存液2ml 吹打，使細(xì)胞均勻混在凍存液中，再加3ml凍存液，用吸管吸出打入多個(gè)凍存管中，每管1.5ml。17.蓋上蓋子，用封口膜封好,標(biāo)上細(xì)胞名稱(chēng)和日期 .18.凍存方式：430分鐘，-2015分鐘，-8060分鐘，最后轉(zhuǎn)移到液氮罐內(nèi)。注意：凍存管移動(dòng)時(shí)要夾在

7、冰塊中間。13復(fù)蘇1. 取一敞口瓶，內(nèi)裝蒸餾水，放入電熱恒溫水槽中，溫度設(shè)置為39.0。2. 等達(dá)到39.030分鐘后，用鑷子將欲復(fù)蘇的細(xì)胞從液氮管中取出，快速放入敞口瓶?jī)?nèi)，晃動(dòng)，使凍存管內(nèi)完全液化。3. 用酒精擦拭凍存管，放入工作臺(tái)內(nèi)。4. 用鑷子將封口膜夾掉，輕燒管口；5. 用吸管吸出凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液，打入已裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。146. 燒瓶口，鑷子和蓋子；蓋上蓋子， 在倒置顯微鏡下觀(guān)察。7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi).注意： 步驟2中，蒸餾水不要沒(méi)過(guò)凍存管口 所有步驟結(jié)束過(guò)24小時(shí)后一定要換液；15MTT法1.實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，96孔板應(yīng)在超凈臺(tái)紫外燈下照射2個(gè)小時(shí)以

8、上。2.從培養(yǎng)箱中拿出培養(yǎng)瓶，觀(guān)察，加PBS，加胰酶消化，加培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)。 （方法及步驟同傳代1-13步。）3.加培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為10000個(gè)/200l.4.加到96孔板內(nèi),每板6行8列共48孔,每孔200l.5.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺(tái)，倒置顯微鏡下觀(guān)察，標(biāo)明名稱(chēng)，序號(hào)和日期。166. 用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)。7. 從培養(yǎng)箱中取出，鏡下觀(guān)察，拿到工作臺(tái)內(nèi)， 用200l的槍將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出；8. 加入不同濃度的藥物的無(wú)血清培養(yǎng)基,每孔200l。9. 蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺(tái)，倒置顯微鏡下 觀(guān)察，用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 小時(shí)。10.從培養(yǎng)箱

9、中取出，鏡下觀(guān)察，拿到工作臺(tái)內(nèi)， 每孔加MTT液20l。1711.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺(tái)，倒置顯微鏡下 觀(guān)察，用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)4 小時(shí)。12.取出96孔板，倒掉孔內(nèi)的液體，每孔加 DMSO150l，放入酶標(biāo)儀內(nèi)，振蕩600秒， 讀數(shù)即可。注意： 本實(shí)驗(yàn)以CHL細(xì)胞為例.加DMSO時(shí)，帶口罩和手套。放入酶標(biāo)儀內(nèi)時(shí)，96孔板勿蓋蓋子。多重復(fù)幾次。18溶液的配制PBSRPMI1640培養(yǎng)基消化液凍存液清潔液MTT其它溶液19PBS配制之后，加1000ml三蒸水,調(diào)節(jié)PH值在7.2-7.4之間,高壓121 ,30分鐘,4備用。 名稱(chēng) 質(zhì)量(單位:克)NaClKClNa2HPO

10、4.12H2OKH2PO48.000.203.490.2020RPMI1640培養(yǎng)基的配制：取一小袋1640培養(yǎng)粉，加高壓過(guò)的三蒸水800ml，在1000ml的燒杯中用玻璃棒攪拌溶解；加碳酸氫鈉2.0g，再加三蒸水定容至1000ml；加青霉素(100U/ml) ，鏈霉素（100g/ml）；在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾除菌，分裝成180ml，-20備用。注意 燒杯要泡過(guò)酸，并在紫外線(xiàn)下照射至少30分鐘。21消化液的配制稱(chēng)取胰蛋白酶粉0.5克，溶入PBS緩沖液200ml，混勻，調(diào)整PH值到7.2，過(guò)濾除菌，用1.5ml的EP管分裝，-20凍存。取少許放入已培養(yǎng)的無(wú)污染的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)。22凍存液的配制高壓過(guò)

11、的二甲基亞砜DMSO，胎牛血清和無(wú)血清培養(yǎng)基按1:3:6的比例配制。例如配制10ml的凍存液： 高壓的小瓶中加3ml過(guò)濾的胎牛血清， 再加6ml培養(yǎng)基，最后加1ml的 DMSO,混勻即可。23清潔液的配制重鉻酸鉀(單位:克)濃硫酸(單位:ml)蒸餾水(單位:ml)弱液100 1001000次強(qiáng)液120 2001000強(qiáng)液 631000 20024一般常用次強(qiáng)液。新配制的清潔液為棕紅色， 多次使用后，成綠色時(shí)就不能再用, 需重新配制。注意：保護(hù)自己；先將重鉻酸鉀完全溶解于水中（必要時(shí)可加熱幫助溶解），然后緩慢加入濃硫酸，以免產(chǎn)生熱量太多，使容器破裂。 25噻唑藍(lán)MTT液配制方法 稱(chēng)取25mgMT

12、T, 加入5ml PBS液, 混勻, 即成5mg/ml的MTT液； 用0.22m的微孔濾器除菌, 避光, 4保存一周內(nèi)使用.原理 活細(xì)胞的線(xiàn)粒體的乳酸脫氫酶可使MTT（黃綠色）分解，產(chǎn)生蘭紫色結(jié)晶狀甲贊顆粒，積淤細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周?chē)?；其量與細(xì)胞數(shù)成正比，也與細(xì)胞活力成正比。注意 MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力, 不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù).26其它溶液的配制95%到75%的酒精的配制比例為4:1， 例如,配制100ml75%的酒精,80ml 95%酒精加20ml三蒸水即可。36%-38%的濃HCL到5%的稀HCL的配制比例為3:17， 例如,配制1000ml的5%的稀鹽酸,150ml的濃HCL加85

13、0ml的蒸餾水即可。27細(xì)胞計(jì)數(shù)方法吸出細(xì)胞懸液少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿(mǎn)蓋片和計(jì)數(shù)板之間。靜置三分鐘鏡下觀(guān)察，計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)。公式為：細(xì)胞數(shù)/ml=四大格細(xì)胞總數(shù)/4 104個(gè)注意鏡下見(jiàn)有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算;若細(xì)胞團(tuán)數(shù)量占10%以上，重新制備細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)時(shí)，計(jì)左側(cè)和上方的壓線(xiàn)細(xì)胞，右側(cè)和下方的壓線(xiàn)細(xì)胞不應(yīng)該計(jì)在本方格之內(nèi)。28血清滅活把血清置于56的水浴鍋里待完全溶解后開(kāi)始計(jì)時(shí)，30分鐘后分裝成20ml的小瓶，放-20備用。29實(shí)驗(yàn)用品的洗滌橡膠，塑料用品玻璃器皿30橡膠，塑料用品用自來(lái)水沖洗后放入專(zhuān)用燒杯內(nèi),加入蒸餾水，使之淹沒(méi)物品稍許，放在電爐上加熱；等水開(kāi)時(shí)開(kāi)始記時(shí)，三十分鐘后取下，倒掉燒杯內(nèi)的水，自來(lái)水沖洗3遍，蒸餾水沖洗2遍，放烤箱下層中烘干