精減4重組-13碩ppt課件

1、第四章 DNA重組DNA重組DNA recombinationDNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，即核苷酸序列的交換、重排(rearrangement)和轉(zhuǎn)移景象，稱為DNA重組。重組產(chǎn)物稱為重組體DNA。DNA重組的廣泛性廣泛存在于各類生物真核生物基因組間重組多發(fā)生在減數(shù)分裂時(shí)同源染色體之間的交換。細(xì)菌及噬菌體來自不同親代兩組DNA之間可經(jīng)過多種方式進(jìn)展遺傳重組。DNA重組的生物學(xué)意義迅速添加群體的遺傳多樣性經(jīng)過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息參與許多重要的生物學(xué)過程 為DNA損傷或復(fù)制妨礙提供修復(fù)機(jī)制-重組修復(fù) 某些生物的基因表達(dá)受DNA重組調(diào)理DNA重組在相應(yīng)序列之間準(zhǔn)確發(fā)生，在重組

2、染色體上既不多加也不喪失任何堿基。重組可分為三種類型，其共同點(diǎn)是在兩個(gè)DNA雙鏈之間發(fā)生物理性物質(zhì)交換。不同類型發(fā)生的機(jī)制不同。DNA重組的特點(diǎn)DNA重組機(jī)制一、同源重組(homologous recombination)二、位點(diǎn)特異性專注性重組(site-specific recombination)三、轉(zhuǎn)座重組(transposition recombination)一、同源重組(homologous recombination)普通性重組(general recombination)是在兩個(gè)DNA分子的同源序列間直接進(jìn)展交換的一種重組方式。真核生物中，同源重組發(fā)生在減數(shù)分裂時(shí)期細(xì)菌的轉(zhuǎn)化

3、、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)一、同源重組1 Holliday模型 Robin Holliday于1964年提出2 大腸桿菌同源重組的分子根底1 Holliday模型Branch migration異源雙鏈區(qū)分支遷移Holliday 銜接重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本，稱為片段重組體。重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自不同親本，稱為拼接重組體。Holliday模型構(gòu)成小結(jié)1 重組始于雙鏈斷裂與再銜接兩條同源序列先整齊陳列兩個(gè)配對(duì)雙鏈DNA的同源鏈中相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生斷裂2 經(jīng)過分支遷移產(chǎn)生異源雙鏈重組結(jié)合點(diǎn)可以沿雙鏈挪動(dòng)3 構(gòu)成Holliday中間體4 Holliday中間體切開并修復(fù)，切口方向決議重

4、組結(jié)果 片段重組體前后兩個(gè)切口在同一條鏈上拼接重組體前后兩個(gè)切口在不同鏈上DNA在分支點(diǎn)構(gòu)成帶有一些單鏈?zhǔn)中蜨olliday中間體PotterDressler噬菌體同源重組雙鏈之間進(jìn)展銜接所需求的同源區(qū)域最短是多少？經(jīng)過質(zhì)粒及噬菌體把短的同源序列引入細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)闡明，假好像源區(qū)小于75bp那么重組頻率降低。2 大腸桿菌同源重組的分子根底在細(xì)菌中識(shí)別重組位點(diǎn)重組僅涉及DNA分子的限定區(qū)域而不是完好的染色體重組的普經(jīng)過程是一樣的：1兩條序列先平行陳列，然后兩條序列的其中一條單鏈 均發(fā)生斷裂2斷裂分子的一個(gè)單鏈與其同源雙鏈相互作用3配對(duì)區(qū)域延伸-分支遷移4內(nèi)切核酸酶消化同源雙鏈2 大腸桿菌重組的分子

5、根底每一步都需求酶的催化重組Recombination有關(guān)的酶RecA蛋白與RecBCD系統(tǒng)RuvA 、RuvB和 RuvC蛋白R(shí)ecA蛋白及其功能在E.coli中，RecA蛋白參與重組是最關(guān)鍵的步驟1 誘發(fā)SOS反響 作為共蛋白酶(co-protease)促進(jìn)LexA蛋白的水解；是SOS反響最初發(fā)動(dòng)的因子2 促進(jìn)DNA單鏈的同化 單鏈同化即指單鏈與同源雙鏈分子發(fā)生鏈交換，從而產(chǎn)生重組過程中的DNA配對(duì)、Holliday中間體構(gòu)成、分支遷移等步驟。 嚴(yán)重的DNA損傷產(chǎn)生大量單鏈缺口 LexA阻遏蛋白裂解，阻遏作用解除 激活RecA蛋白需求單鏈DNA和ATP存在 一系列基因表達(dá)包括修復(fù)基因 DN

6、A SOS修復(fù)易錯(cuò)修復(fù)，突變添加RecA蛋白誘發(fā)SOS反響 E. coli的SOS反響 重組修復(fù)損傷ABCD序列一樣重組RecA蛋白介導(dǎo)的DNA鏈交換模型單鏈同化RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合復(fù)合物與同源雙鏈DNA結(jié)合入侵單鏈與雙鏈中的互補(bǔ)鏈配對(duì)，同源鏈被置換RecA蛋白與單鏈DNA的結(jié)合具有協(xié)同性RecBCD系統(tǒng)及其功能1 任何部位的單鏈DNA都能借助RecA蛋白與同源雙鏈DNA進(jìn)展鏈交換。2 單鏈DNA可由多種途徑產(chǎn)生。3 RecBCD酶是產(chǎn)生參與重組的DNA單鏈的主要途徑，產(chǎn)生3單鏈末端。該酶的亞基分別由基因recB、recC和recD編碼。RecBCD系統(tǒng)及其功能具有三種酶的活性1 依賴

7、于ATP的核酸外切酶活性2 可被ATP加強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶活性3 ATP依賴的解螺旋酶活性產(chǎn)生3單鏈DNA序列序列及其功能是一段特殊的堿基序列，其一致序列是 5-GCTGGTGG它的存在能顯著提高重組的頻率能在重組過程中調(diào)理RecBCD的酶活性作為其從3-5外切酶活性轉(zhuǎn)變?yōu)?-3外切酶活性的信號(hào)RuvA 、RuvB和 RuvC蛋白R(shí)uvA蛋白識(shí)別Holliday銜接，協(xié)助RuvB蛋白催化分支的遷移。以一種特別的方式構(gòu)成四聚體，呈四重對(duì)稱。RuvB蛋白是一種解鏈酶，催化重組中分支的遷移，是一種環(huán)狀六聚體蛋白。單獨(dú)結(jié)合DNA的效率并不高，需求RuvA的協(xié)助。RuvC蛋白是一種特殊的核酸內(nèi)切酶，在重組中

8、促進(jìn)Holliday銜接的分別，又稱拆分酶，是一種二聚體蛋白。其作器具有一定的序列特異性，其作用的一致序列為5-(A/T)TT (G/C)-3識(shí)別銜接分支遷移銜接分別產(chǎn)生3單鏈二、位點(diǎn)專注性重組(site-specific recombination)指發(fā)生在DNA特異性位點(diǎn)上的重組參與重組的特異性位點(diǎn)需求專門的蛋白質(zhì)識(shí)別和結(jié)合二、特異位點(diǎn)重組位點(diǎn)專注性重組噬菌體在E.coli細(xì)胞中以兩種方式存在：裂解形狀與溶原形狀前噬菌體兩種類型間的轉(zhuǎn)換經(jīng)過位點(diǎn)特異性重組實(shí)現(xiàn)為了進(jìn)入溶原形狀，游離DNA必需整合到宿主DNA中(整合反響)；為了從溶原形狀進(jìn)入裂解周期，前噬菌體DNA必需從染色體DNA上切除下來

9、(切除反響) 。 一DNA經(jīng)過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1 重組反響在附著位點(diǎn)(attachment site)發(fā)生2 與催化有關(guān)的酶類一DNA經(jīng)過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1 重組反響在附著位點(diǎn)(attachment site)發(fā)生 整合和切除過程是在細(xì)菌和噬菌體DNA上被稱為附著位點(diǎn)的特殊位置上，經(jīng)過重組作用而實(shí)現(xiàn)。一DNA經(jīng)過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1 重組反響在附著位點(diǎn)(attachment site)發(fā)生在細(xì)菌遺傳學(xué)中，細(xì)菌染色體上的這一附著位點(diǎn)稱為att。假設(shè)這一座位發(fā)生突變，那么會(huì)抑制的整合。細(xì)菌上的附著位點(diǎn)att稱為attB(Bacteria)，噬菌體上的稱為attP(

10、Phage)attP長度為255bpattB長度為30bp兩者含有共同的中心序列15bpO區(qū)POPBOB一DNA經(jīng)過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除1 重組反響在附著位點(diǎn)(attachment site)發(fā)生2 與催化重組有關(guān)的酶類一DNA經(jīng)過位點(diǎn)特異性重組機(jī)制整合和切除2 催化重組的酶類 整合反響：整合酶Integrase,Int、整合宿主因子Integration Host Factor,IHF 切除反響：整合酶Int、整合宿主因子IHF、噬菌體基因xis產(chǎn)物切除反應(yīng)整合反應(yīng)xis噬菌體BB環(huán)形噬菌體DNA經(jīng)過attP位點(diǎn)和attB位點(diǎn)的交互重組將噬菌體DNA變成整合的線形前噬菌體DNA整合i

11、ntegrationattP(255bp)attB(30bp)attO(15bp)二位點(diǎn)特異性重組結(jié)果依賴于重組 位點(diǎn)的位置和方向12211212212結(jié)果發(fā)生倒位結(jié)果發(fā)生切除切除的環(huán)形片段重組位點(diǎn)反方向位于同一DNA分子上重組位點(diǎn)同方向位于同一DNA分子上1位點(diǎn)特異性重組結(jié)果小結(jié)1 當(dāng)重組位點(diǎn)反方向位于同一DNA分子上時(shí)， 重組結(jié)果：發(fā)生倒位；2 當(dāng)重組位點(diǎn)同方向位于同一DNA分子上時(shí)， 重組結(jié)果：發(fā)生切除；3 當(dāng)重組位點(diǎn)位于不同DNA分子上時(shí)， 重組結(jié)果：發(fā)生整合。三細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門菌的H抗原H1鞭毛蛋白H2鞭毛蛋白單菌落的沙門菌中經(jīng)常出現(xiàn)少數(shù)呈另一H抗原的細(xì)菌細(xì)胞鞭毛相轉(zhuǎn)變沙門菌的

12、H片段倒位遺傳學(xué)分析闡明，這種抗原相位改動(dòng)是由一段995bp的DNA，稱為H片段發(fā)生倒位所決議的。hin編碼特異的重組酶倒位酶hix為14bp的反向反復(fù)序列重組位點(diǎn)Promoterhin能否仍表達(dá)？H2、rH1呢？H1呢？沙門菌H片段倒位決議鞭毛相轉(zhuǎn)變沙門菌的H片段倒位遺傳學(xué)分析闡明，這種抗原相位改動(dòng)是由一段995bp的DNA，稱為H片段發(fā)生倒位所決議的。rH1阻遏蛋白與啟動(dòng)子結(jié)合阻止H1表達(dá)PH片段995bpPH片段995bp為14bp的反向反復(fù)序列hixhin編碼特異的重組酶倒位酶沙門氏菌的H片段倒位rH1 倒位后，啟動(dòng)子序列與H2、rH1取向相反，H2、 rH1不表達(dá),解除了對(duì)H1的抑制

13、，H1表達(dá)PPH1鞭毛素H片段995bphin能否仍表達(dá)？三、轉(zhuǎn)座重組(transposition recombination)指DNA上的核苷酸序列從一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)位置的景象。發(fā)生轉(zhuǎn)位的DNA片段稱為轉(zhuǎn)座元件、可移位遺傳元件( mobile genetic element, MGE)、騰躍基因 (jump gene)轉(zhuǎn)座元件的種類 原核生物轉(zhuǎn)座元件的種類 IS插入序列 TnA family Composite transposon Transposable phage 復(fù)制型轉(zhuǎn)座元件 (replicating transposable element)長度較小，普通7002000bp

14、之間兩端通常含有1040bp長的IR(inverted repeats)內(nèi)部普通只需一個(gè)基因，編碼產(chǎn)物為轉(zhuǎn)座酶缺乏抗生素或其他毒性抗性基因(一)插入序列 insertion sequence， IS l 700 2000 base pair bpGATCGTC -GACGATCCTAGCAG-CTGCTAG GATCGTC -GACGATC Stem-loop 5 GATCGTC 3 CTAGCAG IS的構(gòu)造 一個(gè)構(gòu)造基因反向反復(fù)序列IS的轉(zhuǎn)座機(jī)制 當(dāng)IS轉(zhuǎn)座時(shí)，宿主靶部位雙鏈交錯(cuò)切開，經(jīng)修復(fù)后IS兩側(cè)構(gòu)成短的正向反復(fù)?；虻谋磉_(dá)及其產(chǎn)物的活性?ATGTAAATGTAA(二)轉(zhuǎn)座子(Tran

15、sposon，Tn / TnpA family) l兩側(cè)含有3540bp的IRl 較長，2.5 kb 20 kb l內(nèi)部通常含有不止一個(gè)構(gòu)造基因：轉(zhuǎn)座酶基因、調(diào)理基因、抗生素抗性基因(resistance gene) l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) 多個(gè)構(gòu)造基因反向反復(fù)序列(三)復(fù)合元件/復(fù)合轉(zhuǎn)座子 composite element / composite tansposon IS插入到一段帶有抗生素抗

16、性基因或其它毒性抗性基因等構(gòu)造基因的兩端，構(gòu)成復(fù)合轉(zhuǎn)座子。IStranspositionmutation ISIS IS L IS R臂 中心區(qū) 臂插入結(jié)果？ 復(fù)合轉(zhuǎn)座子一旦構(gòu)成，轉(zhuǎn)座功能受較多因子調(diào)控 構(gòu)造特點(diǎn) IR IR IR IRIRIR IS10L Tn10 (9.3 kb) IS10R IR IR IR IRDRDR IS1L Tn9(2.5 kb) IS1R構(gòu)造基因兩端IS序列方向相反構(gòu)造基因兩端IS序列方向一樣兩種轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性？ 穩(wěn)定性發(fā)生切除DR型 (Instable)IR型 (Stable)InversionB AA BBA發(fā)生倒位思索題：轉(zhuǎn)座子Tn9和Tn10，哪一種較穩(wěn)

17、定？為什么？轉(zhuǎn)座重組產(chǎn)生的效應(yīng)1. 是基因突變和重排的重要緣由：轉(zhuǎn)座元件的存在，會(huì)添加宿主基因組DNA的量，同時(shí)引起宿主染色體DNA重組，呵斥染色體斷裂、反復(fù)、缺失、倒位及易位等。2. 影響臨近基因的表達(dá)，改動(dòng)宿主表型：轉(zhuǎn)座元件也可經(jīng)過干擾宿主基因與其調(diào)控元件之間的關(guān)系或轉(zhuǎn)座元件本身的作用而從而改動(dòng)宿主表型。轉(zhuǎn)座重組產(chǎn)生的效應(yīng)轉(zhuǎn)座元件插入特定基因內(nèi)部后，很能夠?qū)е禄蚴Щ睿@是轉(zhuǎn)座作用最直接的效應(yīng)。當(dāng)轉(zhuǎn)座元件自發(fā)插入細(xì)菌的啟動(dòng)子時(shí)，即可阻止它所控制基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。由于轉(zhuǎn)座元件帶有終止子，其插入將影響支配子中其后基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)座重組的生物學(xué)意義人、小鼠和水稻的基因組大約有40%的序列由轉(zhuǎn)座子衍

18、生而來。低等真核生物和細(xì)菌內(nèi)轉(zhuǎn)座子相應(yīng)比例較小，約1%-5%。轉(zhuǎn)座子在從低等生物到高等生物的基因和基因組進(jìn)化過程中曾發(fā)揚(yáng)過非常重要的作用。1. RecA蛋白是怎樣調(diào)理SOS反響的？2. 什么叫DNA重組？歸納總結(jié)三種DNA重組的機(jī)制。3. 什么是Holliday中間體？它是如何構(gòu)成的？RecA和RecBCD系統(tǒng)、Ruv系統(tǒng)是如何發(fā)揚(yáng)作用的？4. 在位點(diǎn)特異性重組中，假設(shè)重組位點(diǎn)反向位于同一條DNA上，那么重組后的結(jié)果會(huì)怎樣？假設(shè)同方向位于一條DNA上呢？假設(shè)重組位點(diǎn)位于不同DNA分子上，重組結(jié)果如何？可圖示闡明5. 什么是卡序列？它在同源重組中如何發(fā)揚(yáng)作用？復(fù)習(xí)題6. 在不同的轉(zhuǎn)座子類型中，Tn10與Tn9哪一種轉(zhuǎn)座子較穩(wěn)定？為什么？7. 以DNA重組為例，說說生物大分子是如何相互作用來影響生命景象的