診斷酶學介紹知識點

1、診斷酶學介紹知識點酶學概述 酶的概念、結(jié)構(gòu)及功能基本概念 1. 酶2. 酶的催化特：極高的催化效率、高度的特異性、 催化作用的可調(diào)節(jié)性。3.酶促反應(yīng)：酶催化的反應(yīng)； 酶活性(activity)：酶催化反應(yīng)的能力； 底物(substrate，S)：酶所作用的物質(zhì)； 產(chǎn)物(product，P)：酶促反應(yīng)的生成物； 酶的激活劑(activator）：加速酶促反應(yīng)的物質(zhì)； 酶的抑制劑(inhibitor ）：減慢或終止酶促反應(yīng)的物質(zhì)（一）診斷酶學的發(fā)展簡史20世紀初臨床就開始測定體液中的酶1908年測尿AMY活力診斷急性胰腺炎30年代ALP用于診斷骨骼疾病診斷酶學的真正發(fā)展從50年代用分光光度法建立了

2、連續(xù)監(jiān)測酶活性方法開始70年代開始起，逐步將注意力集中到同工酶測定上，又隨免疫學和技術(shù)方法的開展，用抗原抗體反應(yīng)有可能直接測定微量的酶蛋白。（二）廣泛利用酶診斷的原因 1. 測定酶活力的方法靈敏度、準確性較好； 2. 酶活力的變化早于臨床體征或其他診斷指標（三）診斷酶學的作用：各種疾病的診斷、預后和隨訪觀察 一、血清酶的來源 根據(jù)酶的來源及其在血漿中發(fā)揮催化功能的情況，將其分為：P143一般代謝酶組織專一酶血漿特異酶非血漿特異酶 外分泌酶細胞酶一般代謝酶組織專一酶血漿特異酶非血漿特異酶 外分泌酶細胞酶血 清 酶（一）血清（漿）特異酶：在血清（漿）中發(fā)揮催化作用的酶類，有明確的生理功能，含量高于

3、其他組織。（二）非特異的血漿酶：在血中不起任何生理作用，濃度明顯低于組織和細胞中含量。. 外分泌酶：血清中來源于外分泌腺的酶。.細胞酶：存在于機體各種組織細胞中進行物質(zhì)代謝的酶類。 名稱 血漿特異酶 非血漿特異酶 外分泌酶細胞酶一般代謝酶組織專一酶來源肝消化腺或其它外分泌腺 各組織器官 （無器官專一性） 肝 （有器官專一性） 種類凝血酶原、因子、因子、纖溶酶原、ChE、CER、LCAT、脂蛋白脂肪酶等 胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等LDH、AST、ALT、CK、MDH等 OCT等 三、血清酶變化的病理生理機制（一）細胞酶的釋放. 細胞內(nèi)外酶濃度的差異.酶在細胞內(nèi)定位與存在形式.

4、酶蛋白分子量的大?。ǘ┟冈诩毎忾g隙的分布和運送細胞中的酶經(jīng)過三種途徑進入血液：直接進入血液；既和組織間隙也和血液直接相接觸；大部分進入組織液，經(jīng)淋巴系統(tǒng)入血。（三）血中酶的清除 一般以血中酶的半壽期代表酶從血中清除快慢。表7-2血漿中酶的半壽期酶 半壽期AST 175hALT 4710hGLD 181hLD1 11360hLD5 102hCK 約15hCK-MM 174hCk-MB 124hCK-BB 約5hALP 3-7天GGT 3-4天CHE 約10天AMY 3-6h（四）酶合成異常 對于血漿特異酶，細胞內(nèi)酶合成下降是引起血中酶變化的重要因素。合成減少合成增多肝損害導致合成酶的能力受損

5、（ChE、LCAT）酶基因變異引起酶合成減少（銅氧化酶）增生性疾?。ü趋兰膊?，ALP)惡性腫瘤（前列腺癌，ACP)酶的誘導作用（乙醇，-GT）P144（五）其它抑制劑和活化劑四、血清酶的生理變異（一）性別（二）年齡（三）進食（四）運動（五）妊娠與分娩五、酶活性測定方法和質(zhì)量測定方法及其評價 酶活性濃度的測定 （一）酶活性濃度測定方法酶活性濃度測定就是要使酶促反應(yīng)的初速度（v）達到最大速度Vmax，即在過量底物存在下的零級反應(yīng)期的速度，此時反應(yīng)速度與酶濃度E之間存在線性關(guān)系。按照酶促反應(yīng)時間的不同可將酶活性濃度測定方法分為兩大類: 定時法（fixed time assay） 連續(xù)監(jiān)測法（cont

6、inuous monitoring assay）。按檢測方法分類： 分光光度法、旋光法、熒光法、電化學法、化學反應(yīng)法、核素測定法、量熱法1.定時法（固定時間法）定時法：測定酶與底物作用反應(yīng)一定時間后底物或產(chǎn)物變化的總量，計算酶促反應(yīng)平均速度。優(yōu)點：比較簡單，最后測定時因酶促反應(yīng)已被終止，故所用儀器無需恒溫裝置，顯色劑的選擇也可不考慮對酶活性的影響。缺點：無法知道在整個酶促反應(yīng)進程中是否都處于線性期。利用該法測定酶活性濃度，必須保證酶和底物在所選定的溫度下作用時間要非常精確，否則會引起較大誤差。2、連續(xù)監(jiān)測法（動力學法或速率法）指在酶促反應(yīng)過程中用儀器監(jiān)測某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時間的變化量，

7、求出酶反應(yīng)初速度，間接計算酶活性濃度的方法。優(yōu)點：無須終止酶促反應(yīng)，不需添加其它成色試劑，就能將反應(yīng)物變化的多點測定結(jié)果連接成線，觀察到整個反應(yīng)過程，選擇線性反應(yīng)期來計算酶活性，結(jié)果準確可靠。要求檢測儀器具有恒溫裝置及自動檢測功能，自動生化分析儀都能達到這些要求。 3、平衡法（終點法） 通過測定酶反應(yīng)開始至反應(yīng)達到平衡時產(chǎn)物或底物濃度總變化量來求出酶活力的方法。特點：無需終止反應(yīng)； 反應(yīng)時間長，影響因素多； 適合零級反應(yīng)期很短的酶促反應(yīng)。酶質(zhì)量測定法隨著免疫技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了利用酶的抗原性，通過抗原、抗體反應(yīng)來直接測定酶的質(zhì)量，用質(zhì)量單位ng/ml、ug/L來表示。優(yōu)點：靈敏度和特異性高，不受

8、體液中其他物質(zhì)的影響，尤其是激活劑和抑制劑的影響。當血液中有酶抑制劑存在，或因基因缺陷，合成無活性的酶蛋白時，可測出其質(zhì)量CK-MB質(zhì)量測定較活性測定對疾病的診斷價值高六、酶活性濃度的單位（一）酶活性單位1慣用單位 慣用單位是酶活性測定方法的建立者所規(guī)定的單位。由于單位定義不同，參考值差別很大，難以進行比較。2國際單位（international unit，IU） 在特定的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量為一個國際單位。以IU表示，1IU=1mol.min-1。3Katal單位 在規(guī)定條件下，每秒鐘轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量為1kat， 1kat=1mol.s-1。常用單位為katal或 nk

9、atal。Kat與IU的換算關(guān)系為：1IU=1molmin-1=16.67nmols-1= 16.67nkatal（二）標本的采集、處理與貯存 1. 體外溶血 2. 一般采用血清標本 3. 酶蛋白不穩(wěn)定，易失活七、工具酶工具酶：酶學分析中作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性濃度的酶。指示酶和輔助酶作為反應(yīng)系統(tǒng)中的試劑。（一）工具酶（二）常用工具酶常用工具酶多為氧化還原酶類工具酶純度不必要求過高工具酶中雜質(zhì)的含量有一定的限制P152 （三）工具酶參與的指示反應(yīng) 臨床生化檢驗中，很多項目的測定往往使用有工具酶參與的類似的反應(yīng)原理共通（通用）反應(yīng)途徑。1. 偶聯(lián)H2O2的工具酶及其指示反應(yīng)葡萄糖尿酸膽

10、固醇甘油丙酮酸葡萄糖氧化酶尿酸氧化酶膽固醇氧化酶甘油氧化酶丙酮酸氧化酶H2O2以H（e）為受體的指示酶以NAD(P)H為輔酶參與的指示酶觸酶POD(最常用）P152 2H2O2+4-AAP+酚 醌亞胺(紅色)+4H2OPOD2. NAD(P)+或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應(yīng) 許多氧化還原反應(yīng)，尤其是作為工具酶如LD、GLD、G6PD等參與時，常將底物的H去除后傳遞給NAD (P)+形成NAD(P)H。借助NAD(P)H340nm處特征性的光吸收，借此用分光光度法檢測。 如：葡萄糖、尿素、-羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、 ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD、ICD等。

11、例：尿素H2O 2NH3CO2NH3 -酮戊二酸 NADHH+ 谷氨酸NAD+H2O尿素酶GLDP152 P+NAD(P)H+H+ PH2+NAD(P) + 八、臨床常用血清酶分析 一、轉(zhuǎn)氨酶（ Aminotransferases ）及其同工酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (Alanine aminotransferases，ALT) / 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 GPT天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (Aspartate aminotransferases，AST/ 谷草轉(zhuǎn)氨酶 GOT1.催化反應(yīng)L-丙氨酸-酮戊二酸 -丙酮酸 L-谷氨酸L-天冬氨酸-酮戊二酸 -草酰乙酸 L-谷氨酸ALTAST 兩種酶均需要磷酸吡哆醛（VitB

12、6）為輔基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白為脫輔基酶蛋白，無催化活性。P166 2.組織分布 ALT大量存在于肝組織，其次為腎、心、骨骼肌等。其有兩種活性同工酶，(ALTs)、(ALTm)，分別存在細胞質(zhì)及線粒體中。肝細胞中ALT大多存在細胞質(zhì)，少量在線粒體，肝細胞壞死時血清中以ALTs為主。 AST存在多種器官，按含量多少為心、肝、骨骼肌和腎。其有兩種同工酶ASTs、ASTm，分別存在細胞質(zhì)及線粒體中。細胞輕度損傷ASTs顯著升高，而嚴重損傷時ASTm 大量出現(xiàn)于血清中。血中AST升高多來自心臟或肝臟損傷。P166疾病ALT AST AST/ALT 病毒性肝炎隨不同病期和嚴重程度而異，常明顯升高，可

13、達10-100倍正常上限 同ALT，但程度沒有ALT明顯，恢復到正常早于ALT 1.0 重癥肝炎不超過20倍正常上限，出現(xiàn)“肝疸分離” 增高程度常超過ALT 1.0 肝硬化變化不定，常輕度增高同ALT，但增高程度常超過ALT1.0梗阻性黃疸變化不足，常不超過5倍正常上限同ALT不定，常1.0溶血性黃疸無變化無變化AMI正?；蜉p度升高明顯升高，與CK和LD相比，無何優(yōu)點1.0心肌炎正?；蜉p度升高急性期可輕度升高1.0肌肉損傷正常或輕度升高可高達2-5倍正常上限1.0肌萎縮明顯上升，可達8倍正常上限同ALT1.0（二）臨床意義1. 急性肝損害 ALT的升高常與病情輕重相平行，可作為判斷急性肝炎是否

14、恢復的指標。重癥肝炎出現(xiàn) “酶（ ALT）膽（膽紅素）分離”現(xiàn)象，常是肝壞死的前兆。2. 心臟、骨骼肌等組織受損、肝膽疾病時血清ALT水平也可出現(xiàn)不同程度的升高。有些藥物如異煙肼、利福平等可引起急性或慢性的肝損害，血中ALT活性升高。3. 在AMI患者胸前區(qū)疼痛發(fā)作后6h8h，血清AST可明顯升高，其升高的幅度與心肌損傷的程度成正比。發(fā)病后48h60h達峰值，4天5天可降至正常。4. 轉(zhuǎn)氨酶輕度增加(1ULN3ULN) ：胰腺炎、酒精性脂肪肝、肝硬化、肉芽腫、腫瘤等；中度增加(3ULN10ULN)的疾病：傳染性淋巴增多癥、慢性活動性肝炎、肝外膽道梗塞、心肌梗死等；重度增加(20ULN)的疾?。?/p>

15、病毒性肝炎、中毒性肝炎。堿性磷酸酶及其同工酶堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP/AKP）1. 催化反應(yīng) 一種含鋅的糖蛋白，在堿性環(huán)境中（pH10.0）可以水解各種天然及人工合成的磷酸單酯化合物。2. 組織分布 ALP廣泛存在于各組織器官中，其含量以肝臟為最多，其次為腎、胎盤、小腸和骨骼等。血清中的ALP主要來自肝臟和骨骼。 生長期兒童血清內(nèi)ALP主要來自成骨母細胞和生長中的骨軟骨細胞，少量來自肝。P170 測定方法與臨床意義1. 測定方法（1）磷酸苯二鈉比色法：測定ALP水解底物產(chǎn)生的酚。（2）連續(xù)監(jiān)測法：IFCC正式推薦的參考方法。2. 臨床意義（1）肝膽疾病 各

16、種肝內(nèi)、外膽管阻塞引起的膽汁淤積性疾病，ALP明顯升高，且ALP升高與膽紅素平行；肝癌血清ALP升高并可與膽紅素、黃疸增加不平行。肝炎等累及肝實質(zhì)細胞的肝膽疾病，ALP僅輕度升高。嚴重肝壞死，若黃疸增加而ALP下降則表示病情惡化；若黃疸減退而ALP升高則表示病情惡化。2甲亢、惡性骨損傷、佝僂病、Pagets病、骨折、指端肥大癥所致骨損傷等，均可引起ALP活性升高，尤其是骨ALP同工酶的增高。3妊娠后期及兒童生長期ALP增高。4血清ALP活性降低：主要見于呆小病、維生素C缺乏癥、甲狀腺功能低下、惡性貧血等。增高變形性骨炎（Paget?。O度上升，可達50倍正常上限骨腫瘤中度上升佝僂病（軟骨癥）可

17、升達1-3倍正常上限骨折輕度升高梗阻性黃疸明顯升高，可達10-15倍正常上限肝實質(zhì)疾?。ǜ窝?，肝硬化）輕度上升，很少超過3倍正常上限肝癌（原發(fā)，繼發(fā)）常明顯上升，可達5-10倍正常上限無黃疸有ALP升高應(yīng)考慮肝占位性病變下降下降甲狀腺功能低下惡性貧血等遺傳性堿性磷酸酶缺乏或下降癥三、-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶 （一）生化特性與組織分布1. 生化特性-GT或GGT （L-glutamyltransferase）是一種含巰基的線粒體酶。2. 組織分布分布于腎、胰、肺、肝、腸和前列腺等多種組織中，其中以腎臟含量最多。GGT在細胞中有膜結(jié)合型（疏水型）和可溶型（親水型）兩種。血清中GGT主要來源于肝膽系

18、統(tǒng)。肝臟中的GGT主要分布在肝細胞的毛細膽管側(cè)和整個膽管系統(tǒng)，因此肝內(nèi)GGT合成增多或膽管系統(tǒng)病變膽汁排泄受阻時，均可引起血清GGT增高。（二）測定方法與臨床意義1. 測定方法（1）重氮試劑為代表的比色法。（2）連續(xù)監(jiān)測法。2. 臨床意義（1）膽道疾病 膽石癥、膽道炎癥、肝外梗阻等升高明顯。（2）肝實質(zhì)疾病 肝炎、脂肪肝、肝硬化時中度升高。 慢性肝炎活動期GGT多增高，非活動期則多正常。 原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌時不同程度的增高。（3）誘導作用 對乙醇性中毒的判斷有一定的價值。 長期接受巴比妥類藥物、含雌激素的避孕藥者升高。 (4) 同工酶 用醋酸纖維薄膜電泳可將GGT同工酶分為GGT1、 GGT2

19、、GGT3和GGT4四種，正常人只有GGT2和GGT3。 重癥肝膽疾病和肝癌時有GGT1出現(xiàn)；乙醇性肝壞死、 膽總管結(jié)石及胰腺炎時GGT2增加；GGT4與膽紅素增高 相關(guān)。增高無變化膽道疾病明顯增高，可達5-30倍正常上限骨疾患（膽石癥、炎癥）陽性率高，為85-93妊娠肝實質(zhì)疾?。ǜ窝?，肝硬化）輕度增高，可達2-5倍正常上限肝癌（原發(fā)，繼發(fā)）明顯增高且陽性率高誘導作用輕度升高，停藥后降至正常（乙醇，苯巴比妥，抗抑郁藥，抗癲癇藥，含雌激素避孕藥四、肌酸激酶及其同工酶 （一）生化特性與組織分布1. 生化特性肌酸激酶（creatine kinase，CK）為巰基酶，易受金屬離子Ca2、Cu2、Zn2

20、、Mn2等的抑制，Mg2是CK的必需激活劑。由兩種不同亞基（M和B亞基）組成的二聚體。按電泳速率的快慢分為：CK-BB（CK1）、CK-MB（CK2）、CK-MM（CK3）和CKMt(CK4)四種同工酶。2. 組織分布廣泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦組織。CK-BB在腦和脊髓內(nèi)含量最高稱為腦型同工酶。CK-MB主要存在于心肌細胞內(nèi)稱為心型同工酶。骨骼肌中幾乎全部為CK-MM，稱為肌型同工酶。（二）測定方法與臨床意義1. 測定方法 有比色法、酶偶聯(lián)法和熒光法等。（1）肌酸顯色法（2）和酶偶聯(lián)法 是IFCC推薦的參考方法，偶聯(lián)己糖激酶（HK）和葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PD）參與催化反

21、應(yīng)。 （3）CK同工酶的測定常用電泳法和免疫抑制法。2. 臨床意義 主要用于早期診斷AMI（1） 血清CK總活力 心肌梗死后2h4h開始升高，10h24h達峰值，3天4天恢復正常 。（2）CK同工酶及亞型 AMI胸痛發(fā)作后，血清CK-MB的上升先于其CK總活性，CK-MB/CK0.03可診斷為AMI。CK-MM亞型的測定：以CK-MM3/CK-MM11.0作為診斷AMI的標準。在AMI發(fā)病2h4h內(nèi)比值開始升高，8h12h達峰值，因此對AMI的早期診斷具有重要價值。CK-MB2亞型：在AMI早期診斷和判斷有無再灌注上同樣有很高的靈敏度和特異性。一般以CK-MB21.9U/L或CK-MB2/CK

22、-MB11.5作為AMI的診斷標準疾病總CKCK同工酶增高急性心肌梗死（AMI ）常用酶中CK增高最早（4-8h），24h達峰值，2-3d恢復正常，中度升高，常在3000U/L以下診斷AMI“金標準”（6），增高稍早于總CK（？），2-3天恢復正常 心肌炎（病毒性，風濕性）急性期輕度升高，可達5倍正常上限CK-MB可增高 運動試驗）可輕度升高CK-MB正常肌肉損傷（挫傷、手術(shù)，肌注藥物、癲癇、酒精和毒素中毒，過度運動）升高程度和損傷程度有關(guān)，嚴重病例可達10000U/L以上，肌注藥物引起CK升高，一般不超過正常上限2倍，持續(xù)不超過一天主要為CK-MM升高，CK-MB絕對值雖可升高，但百分比6多

23、發(fā)性肌炎與肌炎CK明顯增高主要為CK-MM神經(jīng)性肌肉疾患CK正常無變化降低臥床患者程度不等地下降主要為CK-MM甲狀腺功能亢進程度不等地下降主要為CK-MM激素治療個別患者可下降主要為CK-MM五、乳酸脫氫酶及其同工酶 （一）生化特性與組織分布1. 生化特性乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LD或LDH）是糖酵解途徑中的一種重要酶。LD除催化L-乳酸外還可催化-羥丁酸、-酮丁酸進行脫氫反應(yīng)。2. 組織分布LD位于細胞質(zhì)中，是一種含鋅的糖酵解酶。LD是由H（心型）和M型（肌型）兩種不同亞基組成的四聚體。兩種亞基分子量相同，但氨基酸組成不同，理化性質(zhì)亦不同，形成5種同工酶。若

24、用-羥基丁酸作為底物，可測定H亞基的活性。因為H亞基能夠催化-羥基丁酸脫氫，所以又稱為-羥基丁酸脫氫酶（-HBD），實際上就是測定的LD1和LD2活性之和。1.測定方法 LD-L法與LD-P法。 LD同工酶常用電泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。2. 臨床意義（1）心肌梗死 LD心肌酶中升高最晚，持續(xù)時間長。（2）急性肝炎、慢性活動性肝炎和肝癌(尤其轉(zhuǎn)移性肝癌)時，LD明顯升高。（3）LD同工酶主要用于AMI和肝病的診斷 A. AMI LD1升高最為顯著，LD1/LD21，視為診斷AMI的一個特異指標。 B. 肝膽疾病 LD5升高常表示有肝細胞壞死。肝細胞性黃疸時LD5LD4，阻塞性黃疽時LD4

25、LD5。 C.腫瘤 肝癌(尤其轉(zhuǎn)移癌)時可伴有LD4和LD5明顯增高；白血病、膠原病時以LD3、LD4增高為主。 D. 惡性貧血 LD活性極度升高(原始巨幼紅細胞可產(chǎn)生并釋放LD)，伴有LD1明顯升高，LD1LD2。（二）測定方法與臨床意義疾病總LDLD同工酶增高AMI常測酶中，升高最慢（8-10h），但升高時間最長（5-10d），峰值可達10倍正常上限LD1LD2，并可持續(xù)到兩周（部分病例總LD正常）充血性心衰，心肌炎可升高達5倍正常上限LD1LD2巨細胞性貧血可升高達5倍正常上限，治療正確迅速下降LD1LD2病毒性肝炎部分病例可升高達5倍正常上限LD5LD4（部分病例總LD正常肝硬化常輕度升高LD5明顯升高，LD5LD4原發(fā)性肝癌部分病例升高LD5明顯升高，LD5LD4梗阻性黃疸不定常LD4LD5肌肉損傷視損傷程度不同而異以LD5升高為主肌萎縮可高達10倍正常上限以LD5為主某些惡性腫瘤（白血病，結(jié)腸癌）可升高，個別病例高達5倍正常上限以LD3為主，LD3LD1六、淀粉酶（AMY）及其同工酶 AMY對食物中多糖化合物的消化起著重要作用。作用于多種糖化合物，如淀粉、糖原等。它不同