第18章生殖毒性研究

1、第18章生殖毒性研究第一節(jié) 致畸胎研究研究概況年份 事件作者19321935194819501956196319661971維生素A缺乏可使猴胚胎畸形X射線照射使大鼠胚胎發(fā)生各種畸形氮芥導(dǎo)致大鼠胚胎畸形可的松致小鼠胚胎畸形反應(yīng)停（Thalidomide）事件美國(guó)藥物安全委員會(huì)美國(guó)FDA 人用藥生殖安全評(píng)價(jià)準(zhǔn)則WHO規(guī)定新藥應(yīng)有生殖毒性研究HaleGobHarriuBaxter先天愚型海豹肢畸形 生殖毒性研究（Reproductive toxicity study）是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，它與急性毒性、長(zhǎng)期毒性、遺傳毒性等毒理學(xué)研究有著密切的聯(lián)系，是藥物進(jìn)入臨床研究及上市的重要環(huán)節(jié)。

2、生殖毒性研究在限定臨床研究受試者范圍、降低臨床研究受試者和藥品上市后使用人群的用藥風(fēng)險(xiǎn)方面發(fā)揮重要作用。生殖過(guò)程分期分期研究?jī)?nèi)容檢測(cè)方法交配前到懷孕成年雄性/雌性動(dòng)物的生殖功能；配子的發(fā)育和成熟；交配行為及生育力一般生殖毒性試驗(yàn)懷孕到著床成年雄性/雌性動(dòng)物的生殖功能；著床前的發(fā)育和著床著床到硬腭閉合成年雄性/雌性動(dòng)物的生殖功能；胚胎發(fā)和大部分器官形成致畸試驗(yàn)硬腭閉合到懷孕末期成年雌性動(dòng)物的生殖功能；胚胎生長(zhǎng)發(fā)育以及器官發(fā)育和生長(zhǎng)出生到斷奶成年雌性動(dòng)物的生殖功能；嬰兒在宮外生活的適應(yīng)性；斷奶前的發(fā)育和生長(zhǎng)圍產(chǎn)期試驗(yàn)斷奶到性成熟斷奶前的發(fā)育和生長(zhǎng)；獨(dú)立生活的能力；完全達(dá)到性成熟避孕藥、性激素、性功

3、能障礙藥、促精子生成藥、致突變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性或有毒作用的新藥，必須進(jìn)行生殖毒性試驗(yàn)。第二節(jié) 有關(guān)生殖毒性的基本概念 生殖是機(jī)體繁衍種族的生理過(guò)程，包括生殖細(xì)胞的發(fā)育形成、交配、受精、植入、胚胎形成和發(fā)育、分娩和哺乳等過(guò)程。每一個(gè)環(huán)節(jié)均可能是化學(xué)物質(zhì)毒性作用的靶部位，機(jī)體接觸化學(xué)物質(zhì)后干擾了其生理過(guò)程，使生殖過(guò)程的功能出現(xiàn)缺陷和損害，此即化學(xué)物質(zhì)的生殖毒性。 生殖毒性有兩個(gè)特點(diǎn)：（1）對(duì)化學(xué)物質(zhì)的毒性作用敏感，一定劑量下，其他系統(tǒng)尚未出現(xiàn)損害之前，生殖過(guò)程中的某個(gè)環(huán)節(jié)或功能已經(jīng)出現(xiàn)障礙；（2）化學(xué)物質(zhì)毒性作用對(duì)其損害更為深遠(yuǎn)，不僅表現(xiàn)在接觸化學(xué)物的機(jī)體本身，還可影響后代。第二節(jié) 有關(guān)生殖毒性的基本概念

4、 畸胎學(xué)：從胚胎學(xué)和病理學(xué)發(fā)展出來(lái)的一個(gè)分支學(xué)科，是研究胚胎發(fā)育時(shí)期，由各種內(nèi)外因子引起結(jié)構(gòu)和功能異常的先天性畸形的科學(xué)。 致畸性（teratogenicity）：藥物接觸胚胎發(fā)生期后引起永久性結(jié)構(gòu)或功能異常的性質(zhì)。 胚胎毒性（embryo toxicity）：某些藥物在一定劑量?jī)H對(duì)胚胎或胎兒有毒性作用而對(duì)母體沒(méi)有毒性作用，此作用被稱為胚胎毒性。胚胎毒性表現(xiàn)為胚胎死亡、胚胎生長(zhǎng)遲緩、畸形和功能不全。 母體毒性（embryo toxicity ）：指藥物引起懷孕動(dòng)物的毒效應(yīng)，如體重不增或減輕等，最嚴(yán)重的是死亡。第二節(jié) 有關(guān)生殖毒性的基本概念 畸形（malformations）：永久性結(jié)構(gòu)異?；蚬?/p>

5、能異常的胎兒和新生兒。通常不包括顯微鏡下細(xì)微結(jié)構(gòu)的異常, 生化代謝性缺陷。單純功能異常(如精神缺陷、智力缺陷), 也不包括分娩過(guò)程中各種因素造成的缺陷。 致畸指數(shù)（teratogeny index）：為一種藥物對(duì)母體的半數(shù)致死量與最小致畸量的比值，是表示一種化學(xué)物質(zhì)的致畸強(qiáng)度指標(biāo)。建議致畸指數(shù)在10以下定為不致畸，10 100為致畸，100以上為強(qiáng)致畸。 出生缺陷(birth defect)：指任何解剖學(xué)的和功能的異常。既包括形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常(大體的和細(xì)微的)，也包括功能、代謝、行為的異常。第三節(jié) 一般生殖毒性試驗(yàn) 目的 一般生殖毒性試驗(yàn)（reproductive toxicity test）是

6、研究藥物對(duì)整個(gè)生殖過(guò)程的影響。包括生殖細(xì)胞（精子、卵細(xì)胞）的發(fā)生，卵細(xì)胞受精、著床胚胎形成，胚胎發(fā)育階段的影響并作出評(píng)價(jià)。 動(dòng)物及分組 至少一種動(dòng)物，一般為大鼠或小鼠，每組雄性動(dòng)物10只，雌性動(dòng)物至少20只。第三節(jié) 一般生殖毒性試驗(yàn) 給藥劑量及途徑 給藥組設(shè)高、中、低三個(gè)劑量；高劑量應(yīng)能產(chǎn)生輕微毒性反應(yīng)，如體重增長(zhǎng)緩慢等，但不應(yīng)出現(xiàn)嚴(yán)重中毒或死亡。 給藥途徑應(yīng)盡量接近臨床。 給藥時(shí)間 雄性動(dòng)物交配前給藥60 80天，雌性動(dòng)物交配連續(xù)給藥14天。交配后繼續(xù)給藥至大多數(shù)器官發(fā)生期（大鼠/小鼠為孕后13天）。第三節(jié) 一般生殖毒性試驗(yàn) 檢查雄性與雌性動(dòng)物同籠交配后，每日檢查小鼠陰道中有無(wú)陰栓，大鼠則檢

7、查精子，以檢查到陰栓或精子的當(dāng)日作為妊娠第0天。雌鼠于妊娠第13天解剖觀察，以確定妊娠、胎兒的吸收和死亡情況，并記錄母鼠的一般狀況、體重變化和胎盤重量，以確定子宮內(nèi)的活胎數(shù)，對(duì)活胎進(jìn)行性別鑒定、體重和身長(zhǎng)的測(cè)量以及外表和內(nèi)臟器官的形態(tài)學(xué)觀察，對(duì)骨骼進(jìn)行茜紅素染色后進(jìn)行檢查，必要時(shí)進(jìn)行組織學(xué)和組織化學(xué)的詳細(xì)檢查。第三節(jié) 一般生殖毒性試驗(yàn) 檢查大鼠于孕期第20天處死（小鼠18天）。剖腹取出子宮及卵巢，辨認(rèn)和記錄活胎數(shù)，早死胎數(shù)、晚死胎數(shù)、吸收胎數(shù)和黃體數(shù)，對(duì)活胎仔應(yīng)辨別性別、稱重，測(cè)量身長(zhǎng)及尾長(zhǎng)，仔細(xì)檢查活胎仔的外觀有無(wú)畸形，將每只母鼠的2/3活胎仔剝?nèi)テつw和內(nèi)臟，經(jīng)脫水透吸及茜紅素染色后，檢查骨

8、骼畸形，將1/3活胎仔浸入Bouin氏溶液中固定，供檢查內(nèi)臟畸形。第三節(jié) 一般生殖毒性試驗(yàn) 結(jié)果判定 100 %畸胎率% =畸胎總數(shù)活胎仔總數(shù)活胎仔平均畸形數(shù) =畸形總數(shù)活胎仔總數(shù)100 %母體畸胎出現(xiàn)率% =出現(xiàn)畸胎母體數(shù)妊娠母體總數(shù)* 畸胎及畸形的計(jì)算方法第四節(jié) 繁殖試驗(yàn) 目的、原理 凡受試物能引起生殖機(jī)能障礙，干擾配子的形成或使生殖細(xì)胞受損，其結(jié)果除可影響受精卵或孕卵的著床而導(dǎo)致不孕外，尚可影響胚胎的發(fā)生及胎仔的發(fā)育，如胚胎死亡導(dǎo)致自然流產(chǎn)、胎仔發(fā)育遲緩以及胎仔畸形。如果對(duì)母體造成不良影響，出現(xiàn)妊娠、分娩和乳汁分泌的異常，亦可出現(xiàn)胎仔出生后發(fā)育異常。 本試驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)整個(gè)生殖過(guò)程的毒性作

9、用，通過(guò)繁殖試驗(yàn)可以了解藥物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的性腺功能、交配能力、受孕能力、妊娠過(guò)程、分娩、哺乳及對(duì)后代生長(zhǎng)發(fā)育的影響。 一般傾向于二代繁殖試驗(yàn)。第四節(jié) 繁殖試驗(yàn) 動(dòng)物及分組 大鼠，至少設(shè)三個(gè)劑量級(jí)和一個(gè)對(duì)照組。每組動(dòng)物應(yīng)至少能產(chǎn)仔20窩；F0代有生育能力的雄鼠至少10只，以后各代每組也應(yīng)至少有10只雄鼠。 給藥劑量 高、中、低三個(gè)劑量；高劑量應(yīng)有毒性作用，但不能引起10%以上動(dòng)物死亡，且超過(guò)人體預(yù)期接觸水平。低劑量應(yīng)不產(chǎn)生可觀察到的有害作用。 方法 以人體可能接觸的方式染毒。 僅對(duì)F0及F1代動(dòng)物染毒。 F0代動(dòng)物自離乳起（6 w之前）開(kāi)始染毒，直到F1代離乳；F1代動(dòng)物離乳（約30 d）后，部分

10、動(dòng)物（用來(lái)繼續(xù)繁殖的動(dòng)物）每天染毒，直到F2代離乳后30天。 F0代給藥至少100天后，開(kāi)始交配，產(chǎn)生F1代。 F1代給藥至少數(shù)120天后，開(kāi)始交配，產(chǎn)生F2代。第四節(jié) 繁殖試驗(yàn)第四節(jié) 繁殖試驗(yàn) 觀察指標(biāo) 包括動(dòng)物一般狀態(tài)、體重、進(jìn)食量及死亡情況；著重觀察受孕率、妊娠率、出生存活率、產(chǎn)仔總數(shù)及平均仔重等與生殖機(jī)能有關(guān)指標(biāo)。 計(jì)算下述生殖指數(shù)：100 %1. 生育力指數(shù)： 受孕率% =妊娠雌鼠數(shù)交配雌鼠數(shù)100 %2. 受孕指數(shù)： 正常妊娠率% =活產(chǎn)雌鼠數(shù)妊娠雌鼠數(shù)100 %3. 存活力指數(shù)：出生存活率% =生后4 d 存活仔數(shù)出生時(shí)活仔數(shù)100 %4. 哺育指數(shù)： 哺育存活率% =生后21

11、d 存活仔數(shù)出生后4 d 存活數(shù)第四節(jié) 繁殖試驗(yàn)第五節(jié) 致畸試驗(yàn) 原理 母體在孕期受到可通過(guò)胎盤屏障的藥物作用,影響胚胎的器官發(fā)育,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和機(jī)能的缺陷,出現(xiàn)胎仔畸形。因此在受孕動(dòng)物的胚胎著床后，并已開(kāi)始進(jìn)入細(xì)胞及器官分化期時(shí)，可檢出該物質(zhì)對(duì)胎仔的致畸作用。 致畸試驗(yàn)（teratogenic test）為鑒定動(dòng)物致畸物的標(biāo)準(zhǔn)方法。不僅能檢測(cè)到藥物的致畸性，也可得到有關(guān)藥物致胚胎死亡及生長(zhǎng)遲緩的資料。第五節(jié) 致畸試驗(yàn) 動(dòng)物 要求選用對(duì)藥物敏感性高而自發(fā)畸形率低的動(dòng)物，常用大鼠、小鼠和兔。一般至少采用2種動(dòng)物，一種為嚙齒類，另一種要求非嚙齒類（狗和猴）。 動(dòng)物受孕及檢查方法 未交配過(guò)的雌鼠，鼠齡3

12、 m以下，體重200 - 250 g，做陰道分泌物涂片檢查，若發(fā)現(xiàn)白色分泌物較多，鏡下發(fā)現(xiàn)有核上皮細(xì)胞，則提示大鼠處于動(dòng)情前期。此時(shí)，將其與雄鼠按21 或32同籠過(guò)夜，次日檢查是否受孕。 檢查是否受孕。（1）檢查陰栓：陰栓是雄鼠精囊與凝固腺分泌液在雌鼠陰道凝結(jié)而成的白色塊狀物，形似米粒。大鼠陰栓易脫落，小鼠陰栓不易脫落。（2）陰道涂片檢查精子。 陰栓或精子檢出當(dāng)日記為孕0天，次日為孕第1天。 第五節(jié) 致畸試驗(yàn) 劑量分組 分組 分高、中、低三個(gè)劑量組；陰性對(duì)照組；陽(yáng)性對(duì)照組。 劑量確定 （1）高劑量應(yīng)有母體毒性反應(yīng)，或?yàn)樽畲蠼o藥量；低劑量組應(yīng)為母體和胚胎毒性反應(yīng)劑量。 （2） 以 LD50 的

13、1/3 1/5 為高劑量組；以 LD50 的 1/30 1/100 為低劑量。 （3） 以人實(shí)際接觸量做為低劑量組，并以其倍數(shù)（10倍）做為高劑量。 每組受孕動(dòng)物數(shù) 大鼠、小鼠 15 20 只；兔 8 10 只；狗和猴 3 4 只。 第五節(jié) 致畸試驗(yàn) 給藥方式及時(shí)間 給藥途徑根據(jù)藥物的性質(zhì)及人類可能的接觸方式定，多為灌胃和腹腔注射。 給藥時(shí)間選在胚胎對(duì)致畸物的易感期（器官形成期）。第五節(jié) 致畸試驗(yàn) 觀察指標(biāo) 1 每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在試驗(yàn)期間的受精日期、給藥日期和劑量、體重等基本指標(biāo)。 2 對(duì)母體的觀察：每天檢查有無(wú)中毒癥狀，對(duì)有流產(chǎn)或早產(chǎn)征兆者（陰道出血）及時(shí)處死檢查。 3 對(duì)胎仔的觀察A 活仔外形

14、的檢查B 胎仔內(nèi)臟檢查C 對(duì)胎仔骨骼檢查部位 畸 形頭顱鼻眼耳腭頜和唇肢趾脊柱腹部尾肛門腦突出，露腦，顱脊柱裂，單純性腦膜膨出單鼻孔，鼻孔擴(kuò)張小眼，無(wú)眼，開(kāi)眼，眼異位無(wú)耳，小耳，耳異位腭裂頜小，無(wú)頜，無(wú)口，唇裂短肢，畸形足多趾，少趾，缺趾，并趾脊柱膜膨出，脊柱骨缺失，脊柱側(cè)凸臍疝短尾，卷尾，角形尾，螺旋尾，無(wú)尾肛門閉鎖常見(jiàn)畸形及部位（外觀畸形）部位 畸 形顱頂骨枕骨頸椎骨胸骨肋骨腰椎四肢骨盤骨尾椎骨缺損，骨化遲緩缺損，骨化遲緩缺損，骨化遲緩缺損，錯(cuò)位，骨化遲緩多肋，少肋，短肋，分叉肋，波狀肋，融合肋缺失，分裂，變形多骨，缺失缺失缺失，椎弓不連續(xù)，融合常見(jiàn)畸形及部位（骨骼畸形）部位 畸 形頭腭口

15、腔眼心血管肺膈腸肝腎生殖器膀胱腦積水，腦室擴(kuò)大腭裂短舌，分叉舌少眼，小眼，無(wú)眼右位心，室中隔缺損，單房室心，主動(dòng)脈弓橫位氣管食管瘺，肺倒位，少葉橫膈缺損，并引起腹內(nèi)臟疝或內(nèi)臟側(cè)位腸疝肝異位，少葉馬蹄腎，腎積水，腎積水，腎缺失，腎異位子宮缺失，睪丸缺失或隱睪，睪丸發(fā)育不全（單側(cè)/雙側(cè)），兩性畸形缺失常見(jiàn)畸形及部位（內(nèi)臟畸形）第五節(jié) 致畸試驗(yàn) 結(jié)果評(píng)定 1 對(duì)母體動(dòng)物評(píng)定： 100 %100 %母體畸胎出現(xiàn)率（%）=妊娠母體數(shù)交配率% =已交配動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)死亡率% =死亡動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)出現(xiàn)畸形胎的母體數(shù)100 %母體增重= 處死時(shí)母體體重 妊娠第6日體重 處死時(shí)子宮連胎重第五節(jié) 致畸試驗(yàn) 結(jié)

16、果評(píng)定 2 對(duì)胎仔評(píng)定： 100 吸收胎率（% ）=早期吸收數(shù) + 中期吸收數(shù) + 晚期吸收數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)注意區(qū)分畸形數(shù)和畸胎數(shù)外觀畸形率% =外觀畸形數(shù)檢查胎仔數(shù)100 %骨骼畸形率% =骨骼畸形數(shù)檢查骨骼數(shù)100100 死胎率（%）=胎仔總數(shù)死胎數(shù)內(nèi)臟畸形率% =內(nèi)臟畸形數(shù)檢查胎仔數(shù)100 %100活胎率（%）=胎仔總數(shù)活胎數(shù)第五節(jié) 致畸試驗(yàn)評(píng)定藥物致畸作用應(yīng)注意問(wèn)題統(tǒng)計(jì)分析；劑量效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自發(fā)畸形類型和頻率變異種屬差異、品系差異動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推致人類時(shí)，須結(jié)合人群流行病學(xué)調(diào)查注意人類實(shí)際接觸量及接觸方式與途徑第五節(jié) 致畸試驗(yàn)第六節(jié) 致畸作用機(jī)理 突變引起胚胎發(fā)育異常 細(xì)胞死亡和增殖速度減慢 細(xì)胞間通訊抑制 胚胎中間代謝障礙 胚胎組織發(fā)育過(guò)程不協(xié)調(diào) 滲透壓不平衡