環(huán)境工程微生物學(xué)一微生物細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)

1、環(huán)境工程微生物學(xué)一微生物細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)一、目的（1）了解細(xì)菌的涂片及染色在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的重要性。（2）學(xué)會(huì)細(xì)菌染色的基本技術(shù)，從而掌握微生物的一般染色法和革蘭氏染色法。二、染色原理 由于微生物細(xì)胞含有大量水分，對(duì)光線的吸收和反射與水溶液的差別不大,機(jī)體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差,在普通光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須對(duì)它們進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。 微生物細(xì)胞是由蛋白質(zhì)、核酸等兩性電解質(zhì)及其他化合物組成。所以，微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)的性質(zhì)。兩性電解質(zhì)兼有堿性基和酸性基，在酸性溶液中離解出堿性基呈堿性帶正電。在堿性溶液中離解出酸性基

2、呈酸性帶負(fù)電。 經(jīng)測(cè)定，細(xì)菌等電點(diǎn)pH在2-5之間，故在中性、堿性或偏酸性溶液中，細(xì)菌的等電點(diǎn)均低于上述溶液的pH值，所以細(xì)菌帶負(fù)電荷，容易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，故用堿性染料染色的較多。微生物體內(nèi)各結(jié)構(gòu)與染料結(jié)合力不同，故可用各種染料分別染微生物的各結(jié)構(gòu)以便觀察。 (一)簡(jiǎn)單染色法 簡(jiǎn)單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細(xì)菌染上顏色，如果僅為了在顯微鏡下看清細(xì)菌的形態(tài)，用簡(jiǎn)單染色即可。三、染色方法(二)復(fù)染色法 用兩種或多種染料染細(xì)菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。 革蘭氏染色法：不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)，而且還可將所有細(xì)菌

3、區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。三、染色方法三、染色方法四、實(shí)驗(yàn)器材、試劑、材料1. 材料： 枯草桿菌、大腸桿菌。2. 器材： 廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡3. 試劑：草酸銨結(jié)晶紫染液革蘭氏碘液體積分?jǐn)?shù)為95%酒精質(zhì)量濃度為5g/L蕃紅（沙黃）染色液1涂片 取干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量菌種(玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層

4、，涂布面不宜過大。2干燥（固定） 室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可手持載玻片的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過23次，共約23秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60）,放置待冷后，進(jìn)行染色。切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而變形。 五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟(一)細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色 涂片干燥（固定）染色水洗干燥鏡檢3染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍(lán)任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。4水洗 斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。5干燥 用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然

5、干燥或微熱烘干。用吸水紙時(shí)切勿將菌體擦掉。 6鏡檢 先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅瑢⒏弑剁R轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。(一)細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色 涂片干燥（固定） 染色水洗干燥鏡檢(二)細(xì)菌的革蘭氏染色步驟 涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脫色水洗復(fù)染水洗干燥觀察五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟1. 涂片、固定染色約1min同簡(jiǎn)單染色法。2. 初染滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1-2min，水洗。3. 媒染滴加革蘭氏碘液，染色約1-2min，水洗。(二)細(xì)菌的革蘭氏染色步驟 涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脫色水洗復(fù)染水洗干燥觀察4. 脫色

6、滴加體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，約20-30S后即水洗，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止；或滴加體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇后將玻片搖晃幾下即傾去乙醇，如此重復(fù)2-3次后即水洗。5. 復(fù)染滴加沙黃染液（番紅）1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約2-3min，水洗并使之干燥。6. 鏡檢同簡(jiǎn)單染色，并根據(jù)呈現(xiàn)的顏色判斷該菌屬是G+細(xì)菌還是G-細(xì)菌，紫色的是革蘭氏陽性菌，紅色的是革蘭氏陰性菌。革蘭氏染色紫色的是革蘭氏陽性菌，紅色的是革蘭氏陰性菌。六、注意事項(xiàng)1革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被誤認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。3.選用幼齡的細(xì)菌。G+菌培養(yǎng)12h-16h，G-細(xì)菌培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使