蛋白質(zhì)分離純化的一般程序(共15頁)

1、蛋白質(zhì)分離純化(chn hu)的一般程序可分為以下幾個步驟：（一）材料(cilio)的預(yù)處理及細(xì)胞破碎分離提純某一種蛋白質(zhì)時，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性。所以(suy)要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。常用的破碎組織細(xì)胞的方法有：1. 機械破碎法這種方法是利用機械力的剪切作用，使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。2. 滲透破碎法 這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。3. 反復(fù)凍融法 生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。4. 超聲波法 使用超聲波震蕩器使細(xì)

2、胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。5. 酶法 如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。(二) 蛋白質(zhì)的抽提通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。（三）蛋白質(zhì)粗制品的獲得選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：1. 等電點沉淀法不同蛋白質(zhì)的等電點不同，

3、可用等電點沉淀法使它們相互分離。2. 鹽析法不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。3. 有機溶劑沉淀法中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。此外，有機溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質(zhì)變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。（四）樣品的進一步分離純化用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進一步分離提純才能

4、得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品純化方案是由幾種純化方法組成的 ，一般選擇的依據(jù)是從抽提液中有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)考慮的。如沉淀法是從溶解度的差異考慮的；離子交換層析、凝膠過濾、親和層析分別從電荷、分子量、對配體親和力的差異性考慮的。為純化某一有效成分，可選出由兩種或更多種方法組成的方案。一般先選粗放、快速、有利縮小樣品體積和后工序處理的方法；精確(jngqu)、費時、需樣品 量少的方法后選。在每一純化方案中，切忌一種方法重復(fù)使用。你好!我也是位畢業(yè)的學(xué)生.希望(xwng)能給你

5、提供參考.以下是離子交換層析常見問題分析,希望能解決你的問題1.純化(chn hu)的蛋白質(zhì)產(chǎn)率低 可能原因及解決方法： 樹脂上的蛋白質(zhì)未洗凈，可采用增強溶液離子強度，更換活性高的反荷離子或使用去垢劑等辦法解決； PH值不合適，若緩沖體系的PH值與目的蛋白的PI相差太遠(yuǎn)，目的蛋白與樹脂的結(jié)合會過于牢固； 蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，可能是因為緩沖體系PH值過于接近蛋白質(zhì)PI值，溶液離子強度過低或溶液過渡稀釋 ； 蛋白質(zhì)在初步過濾的時候有損失； 蛋白質(zhì)或者輔助因子在層析時有損失； 蛋白質(zhì)水解酶破壞了目的蛋白； 樹脂中有 純化時蛋白質(zhì)失活 可能原因及解決辦法： 某個輔助因子或一部分蛋白質(zhì)有損失，混合部分收集液

6、，測定活性； 蛋白質(zhì)在現(xiàn)有層析液中不穩(wěn)定； 樹脂中有微生物。微生物。3. 蛋白質(zhì)不與樹脂結(jié)合 可能原因及解決方法： 初上樣緩沖液離子強度過大，降低初始上樣緩沖液離子強度； 樹脂PH值因解析作用而發(fā)生變化，注意蛋白質(zhì)等電點的計算值往往與實驗值差別很大； 樹脂未進行適當(dāng)平衡； 再生(zishng)的樹脂未洗凈。4. 純化(chn hu)的蛋白質(zhì)產(chǎn)率低 可能原因(yunyn)及解決方法： 樹脂上的蛋白質(zhì)未洗凈，可采用增強溶液離子強度，更換活性高的反荷離子或使用去垢劑等辦法解決； PH值不合適，若緩沖體系的PH值與目的蛋白的PI相差太遠(yuǎn)，目的蛋白與樹脂的結(jié)合會過于牢固； 蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，可能是因為緩沖

7、體系PH值過于接近蛋白質(zhì)PI值，溶液離子強度過低或溶液過渡稀釋 ； 蛋白質(zhì)在初步過濾的時候有損失； 蛋白質(zhì)或者輔助因子在層析時有損失； 蛋白質(zhì)水解酶破壞了目的蛋白； 樹脂中有微生物。5. 蛋白質(zhì)分辨效果差 可能原因及解決辦法： 層析時流速太快； 層析柱過短； 上柱蛋白過多； 梯度洗脫時洗脫液濃度變化太快； 蛋白質(zhì)可在脫離層析柱后再次混合，盡量減少樹脂支持物與部分收集期間的管道體積； 不均勻的裝柱以至產(chǎn)生碎屑，上樣合洗脫時的錯誤操作； 樹脂未進行適當(dāng)平衡； 樹脂中有微生物。 蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項重要的操作技術(shù)。一個典型的真核細(xì)胞可以包含數(shù)以千計的不同蛋白

8、質(zhì)，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質(zhì)，必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來。用于分離蛋白質(zhì)的最重要特性有大小、電荷、疏水性和對其他分子的親和性。通常采用多種方法的組合來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的完全純化。其蛋白質(zhì)分離純化主要方法包括：（1） 根據(jù)分子大小不同的分離方法：透析和超過濾（利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜）；密度梯度離心（蛋白質(zhì)在介質(zhì)中離心時質(zhì)量和密度較大的顆粒沉降較快）；凝膠過濾(一種柱層析)（2） 利用溶解度差別(chbi)分離：等電點沉淀法）由于蛋白質(zhì)分子在等電點時凈電荷為零，減少了分子間靜電斥力，因而容易聚集沉淀，此時溶解度最小)；鹽溶與鹽析(利用一

9、定濃度鹽溶液增大或減小蛋白質(zhì)的溶解度)（3） 根據(jù)電荷不同(b tn)的分離方法，主要包括電泳和離子交換層析分離；（4） 蛋白質(zhì)的選擇(xunz)吸附分離（利用顆粒吸附力的強弱不同達(dá)到分離目的）（5） 根據(jù)配體特性的分離親和層析（利用蛋白質(zhì)分子與另一種稱為配體的分子能夠特異而非共價地結(jié)合這一生物性質(zhì)）這是一門很深的學(xué)問，除了需要高科技還需要科研專用設(shè)備，只是簡介，希望對你有幫助，不要上當(dāng)受騙：酶的分離純化方法簡介生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶有兩類：一類由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細(xì)胞外進行作用的酶，稱為細(xì)胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產(chǎn)葡萄糖所用的兩種淀粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發(fā)酵過程中分泌的。這類酶一般

10、含量較高，容易得到；另一類酶在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，稱為細(xì)胞內(nèi)酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發(fā)酵生產(chǎn)所進行的一系列化學(xué)反應(yīng)，就是在多種酶催化下在細(xì)胞內(nèi)進行的，在類酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合，有一定的分布區(qū)域，催化的反應(yīng)具有一定的順序性，使許多反應(yīng)能有條不紊地進行。酶的來源多為生物細(xì)胞。生物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。因此，在提取某一種酶時，首先應(yīng)當(dāng)根據(jù)需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于從動物內(nèi)臟或植物果實中提取酶制劑

11、受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點有很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內(nèi)酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產(chǎn)量，用廉價原料可以大量生產(chǎn)。由于在生物(shngw)組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)，因此為制取某酶制劑時，必須經(jīng)過分純化的手續(xù)。酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)很容易變性，所以在酶的提純過程中應(yīng)避免用強酸強堿，保持在較低的溫度(wnd)下操作。在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在

12、分離提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標(biāo)，在整個酶的分離純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經(jīng)過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取舍。酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶(jijng)或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：一、預(yù)處理及固液分離技術(shù)1.細(xì)胞破碎（cell disruption）高壓均質(zhì)器法：此法可用于破碎酵母菌、大

13、腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。將細(xì)胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑可調(diào)的排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓環(huán)境，細(xì)胞就容易破碎。菌懸液一次通過均質(zhì)器的細(xì)胞破碎率在12%-67%。細(xì)胞破碎率與細(xì)胞的種類有關(guān)。要達(dá)到90%以上的細(xì)胞破碎率，起碼要將菌懸液通過均質(zhì)器兩次。最好是提高操作壓力，減少操作次數(shù)。但有人報道，當(dāng)操作壓力達(dá)到175Mpa時，破碎率可達(dá)100%。當(dāng)壓力超過70Mpa時，細(xì)胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質(zhì)器的閥門是影響細(xì)胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質(zhì)器的閥門，尤其高濃度菌體時更是如此。在豐富培養(yǎng)基上比在合成培養(yǎng)基上生長的大腸菌更難破碎。容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格便

14、宜，常用來裂解細(xì)胞。具體做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化鈉溶液中，使細(xì)胞濃度為5%（干重），在35用0.68kg（干重）的蛋清處理20min，得到的細(xì)胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機將細(xì)胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分?jǐn)?shù)），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。2.離心離心分離過程可分為離心過濾、離心沉淀、離心分離3種類型，所使用的設(shè)備有過濾式離心機、沉降式離心機和離心機。過濾式離心機的轉(zhuǎn)鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質(zhì)，一般可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機用于分離固體

15、濃度較低的固液分離，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有機溶劑處理過的蛋白質(zhì)等。分離機用于分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。在生物領(lǐng)域采用的離心機系統(tǒng)，除了應(yīng)具備離心機的一般要求外，還應(yīng)滿足生物生產(chǎn)的技術(shù)要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產(chǎn)品不受污染并不污染環(huán)境?，F(xiàn)代哦離心機裝置包括以下三個步驟，并進行程序控制：離心、離心系統(tǒng)的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機產(chǎn)品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉(zhuǎn)筒主軸上下的碳化硅動環(huán)和固定環(huán)組成，密封由水連續(xù)冷卻和潤滑，可防止產(chǎn)品被污染，也可防止生產(chǎn)過程中排出的廢物對環(huán)境的污染。該離心機又如一個密閉的壓力容器，可在12

16、1溫度下進行蒸汽滅菌，該離心設(shè)備設(shè)有環(huán)繞離心機轉(zhuǎn)筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進行充分的冷卻，并能有效地控制溫度，這對于生物制品是非常重要的。如BTPX205型離心機可用于細(xì)胞收集、培養(yǎng)液的凈化和細(xì)胞碎片的分離，可用于疫苗、酶制劑等的提取。該機的其他輔助系統(tǒng)及控制系統(tǒng)也較為完善，如設(shè)有壓力指示器、力量計、溫度傳感器和液面?zhèn)鞲衅鳌?.膜分離技術(shù)(jsh)在蛋白質(zhì)純化過程中主要用到的膜分離技術(shù)多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質(zhì)透過薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多數(shù)超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結(jié)合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而

17、支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優(yōu)點是：操作(cozu)條件溫和，無相變化，對生物活性物質(zhì)沒有破壞。超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經(jīng)泵打入超濾器，水及低分子量物質(zhì)(wzh)排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環(huán)。當(dāng)料液濃縮至一定的倍數(shù)后即可作為進一步處理的濃縮料液。超濾應(yīng)用于蛋白質(zhì)類物質(zhì)的濃縮和脫鹽過程中時應(yīng)注意以下問題：第一，在超濾循環(huán)過程中，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會逐漸升高，會造成蛋白質(zhì)分子的損失。因此，料液貯罐應(yīng)加冷卻系統(tǒng)，并安裝自動測溫及控制系統(tǒng)。第二，某些酶的輔助因子散失為問題：一些酶含有輔助因子，其分子量

18、小，超濾時易從透過液中排除掉，因而在超濾前或超濾后要添加一定濃度的的輔助因子。還可將超濾與親和層析相結(jié)合以提高分離純度。其工作原理是：當(dāng)溶液中欲被分離的蛋白質(zhì)不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時，如果在膜的一側(cè)結(jié)合著親和配基，該蛋白質(zhì)就會與配基結(jié)合因而結(jié)聚在膜的這一側(cè)。不與配基結(jié)合的其他物質(zhì)就將穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質(zhì)洗脫下來，洗脫液用于進一步的分離純化。4.泡沫分離原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由于這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生物學(xué)特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同

19、。這樣，溶液中的組分舅得以分離。蛋白質(zhì)較易吸附與氣液界面，這有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。泡沫分離過程是：蛋白質(zhì)從主體溶液中擴散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發(fā)生重排，一般認(rèn)為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會發(fā)生由多個分子聚集在一起的現(xiàn)象。在氣液界面形成的蛋白質(zhì)膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質(zhì)的特性、結(jié)構(gòu)和濃度。泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質(zhì)的濃度/最初溶液(rngy)中蛋白質(zhì)濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質(zhì)的提取率/最初的蛋白質(zhì)質(zhì)量），或使多組分混合物中某一組分的分配系

20、數(shù)最大。二、抽提沉淀(chndin)1. 鹽析(yn x)常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價格便宜。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的能力很強，其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來。對酶沒有破壞作用。pH的控制：應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等電點時穩(wěn)定性較差，因此要選擇最佳pH值.一般要求在酶最穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮最適宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦確定最佳pH值后，在添加硫酸銨之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時要注意攪拌，并注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細(xì)粉。溫

21、度的控制：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好，可在常溫下進行鹽析操作，而對于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下操作。酶液的凈置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時間，使酶蛋白完全沉淀下來，酶靜置后，就不要再加以攪拌。2有機溶劑沉淀有機溶劑選擇：可用于酶蛋白沉淀的有機溶劑包括醇類物質(zhì)等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質(zhì)的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。有機溶劑沉淀操作：有機溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性，當(dāng)溫度較高時變性蛋白質(zhì)分子就會變成永久失活。因此用有機溶劑處理時最好在0以下進行。用有機溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。3.聚合物絮凝劑沉淀聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶

22、分子爭奪水分子，具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點是在水溶液中，其濃度可達(dá)到50%，濃度為6%-12%的蛋白質(zhì)大都可以沉淀下來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定還有一定的保護作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。4用金屬離子和絡(luò)合物沉淀酶和其他蛋白質(zhì)都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點是酶與金屬離子相互作用后，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結(jié)合的金屬離子會催化酶變性而失活。5用特殊試劑沉淀法用鏈霉素可選擇性去除核酸，從而使胞內(nèi)酶沉淀(chndin)出來。鏈霉素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質(zhì)）對于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子

23、還要好，酶不易失活。6親和沉淀(chndin)將親和反應(yīng)的高度選擇性、低處理量特性與沉淀操作的大處理量、地選擇性有機結(jié)合形成(xngchng)了親和沉淀技術(shù)。將配基與可溶性載體偶聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物，該復(fù)合物與生物分子結(jié)合后在一定條件下可以沉淀出來。配基-載體復(fù)合物可以選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，溶液中的pH值、離子強度及蛋白質(zhì)濃度等條件對親和結(jié)合的影響力并不大，只有競爭性的配基會降低產(chǎn)物與原配基的親和結(jié)合力，甚至使親和結(jié)合發(fā)生逆轉(zhuǎn)。引導(dǎo)產(chǎn)生沉淀的方法有：離子交聯(lián)；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團；改變pH值，誘導(dǎo)產(chǎn)生疏水沉淀；溫度誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀。親和結(jié)合：將親和配基加入到含有目的

24、物蛋白質(zhì)的溶液中，調(diào)節(jié)好有關(guān)沉淀的條件，使之有利于親和結(jié)合。洗滌：為經(jīng)過處理的粗制液中發(fā)生親和沉淀可能會發(fā)生非特異性結(jié)合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應(yīng)將使其他蛋白質(zhì)共同沉淀，因此在分離目的物之前要洗滌沉淀物。其做法是：加入適當(dāng)?shù)那逑磩┲匦氯芙獬恋?，再沉淀；或在專一性洗脫之前，徹底清洗沉淀。在上述過程中要始終保持目的蛋白質(zhì)與配基處于親和結(jié)合狀態(tài)。配基-載體復(fù)合物與目的蛋白質(zhì)的分離：分離結(jié)束之后，要確保回收目的蛋白質(zhì)和配基-載體復(fù)合物，目的蛋白質(zhì)要達(dá)到一定的純度，回收率要高。酶是蛋白質(zhì)，可以根據(jù)其特點選擇適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)提取純化方法！ 選擇材料及預(yù)處理 以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平

25、上認(rèn)識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、堿、高溫，劇烈機械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預(yù)處理，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分

26、離，提取和純化，濃細(xì)、干燥和保存。 微生物(shngw)、植物和動物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實驗?zāi)康膩泶_定。對于微生物，應(yīng)注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預(yù)處理好的材料，若不立即進行實驗，應(yīng)冷

27、凍保存，對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。 蛋白質(zhì)的分離(fnl)純化一，蛋白質(zhì)（包括(boku)酶）的提取 大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。（一）水溶液提取法 稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基

28、于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。1、pH值 蛋白質(zhì)，酶是具有等電點的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點兩側(cè)的pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。2、鹽濃度 稀濃度可促進蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有(jyu)保護蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中

29、加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。（二）有機溶劑提取(tq)法 一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別(tbi)優(yōu)越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也

30、適用于動植物及微生物材料。二、蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析 中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性

31、鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。 影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。 蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應(yīng)用(yngyng)最多的硫酸銨，它的優(yōu)點是

32、溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和(boh)溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸(li sun)銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。 蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。

33、2、等電點沉淀法 蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結(jié)合用。3、低溫有機溶劑沉淀法 用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進行。（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾 透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。 超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。2、凝膠過濾法 也稱分子

34、排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。1、電泳(din yn)法 各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(din chng)中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時，到達(dá)各自等電點的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋

35、白質(zhì)。2、離子交換(l z jio hun)層析法 離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE=宋體 LANG=ZH-CN纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。（詳見層析技術(shù)章）（四）根據(jù)配體特異性的分離方法親和色譜法 親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純

36、度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結(jié)合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。細(xì)胞的破碎1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組

37、織、植物肉質(zhì)種子等。2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。4、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)(jigu)破碎。5

38、、化學(xué)處理法：有些動物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌(xjn)細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。 無論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是(b shi)全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。濃縮、干燥及保存一、樣品的濃縮 生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品

39、變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮 通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。2、空氣流動蒸發(fā)濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室，用電扇對準(zhǔn)吹風(fēng)，使透過膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。3、冰凍法 生物大分子在低溫結(jié)成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內(nèi)而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點介點的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。4、吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng)，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的體積。5、超濾法