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1、抗腫瘤藥物研究和新藥篩選標(biāo)準(zhǔn)提綱化療藥物的發(fā)展腫瘤的藥物治療抗腫瘤新藥的發(fā)現(xiàn)和治療靶點(diǎn)抗腫瘤藥物篩選及評(píng)價(jià)化療藥物的發(fā)展近代腫瘤化療學(xué)始于20世紀(jì)40年代。50年代通過(guò)動(dòng)物篩選化療藥物發(fā)現(xiàn)了5FU、MTX、CTX等,化療學(xué)有了發(fā)展。60年代認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及化療藥藥代動(dòng)力學(xué)的重要性。大部分目前所用的抗癌藥已發(fā)現(xiàn),有急淋、HD、睪丸癌等可化療治愈。70年代形成腫瘤內(nèi)科學(xué),更多腫瘤有了比較成熟的化療方案。80年代研究以生物反應(yīng)修飾劑等藥物來(lái)提高化療療效,探索抗藥性產(chǎn)生的原因,5%腫瘤患者可治愈。90年代新抗癌藥進(jìn)入臨床,多藥耐藥基因發(fā)現(xiàn),生物治療,基因治療輔助治療改善等,療效進(jìn)一步提高。1、細(xì)
2、胞毒類(lèi)抗腫瘤藥2、以細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物3、腫瘤新生血管生成抑制藥物4、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑5、分化誘導(dǎo)劑6、基因調(diào)節(jié)藥物7、單克隆抗體藥物腫瘤的藥物治療a、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑b、胸苷酸合成酶抑制劑c、鉑類(lèi)抗腫瘤藥物1、細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥原理: 真核細(xì)胞DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topo )是生物體內(nèi)及其重要的細(xì)胞核內(nèi)酶,參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等所有關(guān)鍵的核內(nèi)過(guò)程。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶已成為重要的抗腫瘤藥物研究新靶點(diǎn)。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑已成為高選擇性抗腫瘤藥物研究的一個(gè)主攻方向。 代表藥物:喜樹(shù)堿類(lèi)化合物 對(duì)S期的毒性作用,這一作用需共價(jià)TopoIDNA復(fù)合物的形成和DNA復(fù)制。TopoI抑制劑誘導(dǎo)
3、的細(xì)胞凋亡而非DNA斷裂是引起細(xì)胞最終死亡的原因。a、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑原理: 胸苷酸合成酶(TS)把單磷酸脫氧尿嘧啶(DUMP)轉(zhuǎn)換成單磷酸胸腺嘧啶(TMP),在DNA復(fù)制和細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。是已知抗腫瘤藥物的重要有效靶點(diǎn)之一。胸苷酸合成酶抑制劑導(dǎo)致了DNA斷裂從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 代表藥物:培美曲塞 它是一種結(jié)構(gòu)上含有核心為吡咯嘧啶基團(tuán)的抗葉酸制劑,通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)葉酸依賴(lài)性的正常代謝過(guò)程,抑制細(xì)胞復(fù)制,從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。體外研究顯示,培美曲塞能夠抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶和甘氨酰核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶活性,這些酶都是合成葉酸所必需的酶。一旦培美曲塞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),它就在葉酰多谷氨合成酶
4、的作用下轉(zhuǎn)化為多谷氨酸的形式。多谷氨酸存留于細(xì)胞內(nèi)成為胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。多谷酸化在腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)時(shí)間-濃度性過(guò)程,而在正常組織內(nèi)濃度很底。多谷氨酸化代謝物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的半衰期延長(zhǎng),從而也就延長(zhǎng)了藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的作用時(shí)間。b、胸苷酸合成酶抑制劑原理: 鉑絡(luò)合物產(chǎn)生抗腫瘤活性的原因,是由于其與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合,從而干擾DNA的復(fù)制,抑制腫瘤細(xì)胞的分裂。代表藥物:順鉑和奧沙利鉑c、鉑類(lèi)抗腫瘤藥物a、蛋白酪氨激酶(PTK)抑制劑b、表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑C、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑2、以細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物原理: PTK是一組酶系,能催化ATP上的磷
5、酸基轉(zhuǎn)移到許多重要的蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上,使其殘基磷酸化,從而激活各種底物酶,通過(guò)一系列反應(yīng)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。代表藥物:依馬替尼 依馬替尼一種抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶的蛋白酪氨酸激酶抑制劑,Bcr-Abl酪氨酸激酶是CML中由費(fèi)城異常染色體引起的異常酪氨酸激酶。它能抑制Bcr-Abl陽(yáng)性細(xì)胞系和費(fèi)城染色體陽(yáng)性CML新鮮白血病細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。a、蛋白酪氨激酶(PTK)抑制劑 原理:通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,與 EGFR 的胞內(nèi)段激酶結(jié)合區(qū)結(jié)合,從而抑制 EGFR 受體的磷酸化,阻斷受體下游信號(hào)通路的傳導(dǎo),發(fā)揮抗腫瘤作用。 代表藥物:吉非替尼 研究表明吉非替尼的作用通過(guò)上調(diào) P2
6、7KIP1和 P21CIP/WAF1 的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞 G1 期阻滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 b、表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑原理: 法尼基轉(zhuǎn)移酶是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與Ras蛋白異戊二烯化修飾密切相關(guān)的一種必需酶。抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶活性,阻止Ras蛋白的活化,可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖 代表藥物:替匹法尼c、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑原理: 原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是依賴(lài)于新生血管生成的,開(kāi)發(fā)和研究能夠破壞或抑制血管生成、有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的藥物(稱(chēng)為T(mén)A 抑制劑),是新型抗腫瘤藥物研究的活躍領(lǐng)域之一。 代表藥物:angiostatin和endostatin AvastinEndostatin可直接與血管內(nèi)皮
7、細(xì)胞受體結(jié)合抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增生; 可與肝素樣的硫酸蛋白結(jié)合,抑制血管生成; 可抑制VEGF等血管生長(zhǎng)因子,從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖 與腫瘤的生長(zhǎng); 可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1,促使血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速。3、腫瘤新生血管生成抑制藥物原理: 根據(jù)腫瘤耐藥的特點(diǎn)可分為原藥耐藥(PDR)和多藥耐藥(MDR)兩大類(lèi)。前者只對(duì)誘導(dǎo)藥物產(chǎn)生耐藥性而對(duì)其它藥物不產(chǎn)生交叉耐藥性,如抗代謝藥甲氨蝶呤(MTX),5-氟尿嘧啶(5-Fu)等;后者則是指腫瘤細(xì)胞一旦對(duì)某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性,同時(shí)對(duì)其它結(jié)構(gòu)上無(wú)關(guān)、作用機(jī)制各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性,這是一種獨(dú)特的廣譜耐藥現(xiàn)象。許多天然來(lái)源的抗腫瘤藥物如秋水仙
8、堿、紫杉醇等及蒽環(huán)類(lèi)抗癌抗生素如阿霉素、柔紅霉素都極易發(fā)生MDR。 腫瘤耐藥產(chǎn)生的可能原因是藥物代謝障礙、DNA修復(fù)機(jī)制障礙、DNA多聚酶活性改變等。另外,耐藥是凋亡抑制的表現(xiàn)。一些與凋亡抑制相關(guān)的癌基因(如bcl-2,bcr/abl,NF/KB等)的表達(dá)產(chǎn)物可阻斷或阻礙多種因素(如化療藥物、輻射、激素等)誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡,產(chǎn)生耐藥性。 研究表明MDR的產(chǎn)生是由于細(xì)胞內(nèi)藥物積聚發(fā)生障礙,此后研究證實(shí)細(xì)胞內(nèi)藥物積聚降低的同時(shí),有一分子量約為170 000細(xì)胞膜蛋白過(guò)度表達(dá),稱(chēng)之為P-糖蛋白(Pgp) 代表藥物:鈣拮抗藥(維拉帕米及其衍生物)、鈣調(diào)蛋白拮抗藥(包括氯丙嗪等吩噻嗪類(lèi)衍生物)、環(huán)孢素
9、類(lèi)(環(huán)孢素及其衍生物PSC833,SDZ280-466等)及抗雌激素類(lèi)化合物(他莫昔芬)等。4、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑EXTRACELLULARINTRACELLULARATPPGP170ATPDrugDrugPlasmaMembrane 環(huán)胞菌素A(CsA)是一種從真菌屬中提取的天然藥物,具有選擇性的免疫抑制功能,廣泛用于器官移植后的抗排斥反應(yīng)及治療免疫性疾病。它能競(jìng)爭(zhēng)性的和Pgp結(jié)合,阻斷Pgp泵出藥物的功能,提高胞內(nèi)藥物濃度,從而對(duì)抗MDR,通過(guò)進(jìn)一步研究表明,CsA的作用機(jī)制并非單一,除了通過(guò)結(jié)合Pgp而調(diào)節(jié)藥物濃度外,還可通過(guò)與細(xì)胞內(nèi),靶結(jié)構(gòu)之間的相互作用而增加化學(xué)敏感因子自身的細(xì)胞毒性。C
10、sA在MDR中可調(diào)節(jié)藥物的運(yùn)輸,使抗癌藥在細(xì)胞內(nèi)積累增加,外排減少,從而增加抗腫瘤藥物的敏感性。原理: 通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到腫瘤縮小、消退的目的已成為當(dāng)今腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。促進(jìn)惡性細(xì)胞向成熟分化的抗癌藥物稱(chēng)分化誘導(dǎo)劑。代表藥物:維A酸類(lèi)化合物 咪唑衍生物利阿唑5、分化誘導(dǎo)劑 維A酸類(lèi)化合物維甲酸類(lèi)化合物(Retinoic acids)在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生命活動(dòng)中起重要作用。其在體內(nèi)的生理活性代謝產(chǎn)物包括全反式維甲酸(ATRA)、13-順維甲酸(13-cis-RA)和9-順維甲酸(9-cis-RA),它們可通過(guò)核維甲酸受體(RAR)結(jié)合于DNA應(yīng)答元件,從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。Ri
11、ght now we lump patients together and treat them with the same drugs and then deal with their variable response to treatment. Were essentially treating different diseases with the same medicine.”Richard Klausner, 1997 a、反義藥物b、Decoy核酸C、RNA干擾6、基因治療a、反義藥物 反義藥物又稱(chēng)反義寡核苷酸藥物(AODNs) ,是指人工合成長(zhǎng)度為1030個(gè)堿 基的DNA分子及
12、其類(lèi)似物。根據(jù)核苷酸雜交原理,反義藥物能與特定的 基因雜交,在基因水平上干擾致病蛋白質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)程。 AODNs 可以與其靶RNA鏈互補(bǔ)結(jié)合,形成RNA-DNA雜交雙鏈。形成的雜交雙鏈可以被RNA酶H識(shí)別并消化RNA鏈,由此釋放出的 AODN可以繼續(xù)與靶RNA鏈結(jié)合,最終導(dǎo)致編碼基因沉默。由此可推RNA酶H過(guò)多表達(dá)可增強(qiáng)各種AODNs效應(yīng),反之RNA酶H受抑則降低其作用。有些AODNs 并不能激活RNA酶H,相反與翻譯元件競(jìng)爭(zhēng)空間因此可抑制RNA翻譯。另外,AODNs 如果和mRNA結(jié)合可作用于內(nèi)含子外顯子接合處以中斷其拼接過(guò)程。AODNs還可以占領(lǐng)校正RNA細(xì)胞內(nèi)定位的蛋白R(shí)NA作用序列,從而
13、擾亂RNA運(yùn)輸, 藥物:Vitravenea、反義藥物5-ACGCT-33-TGCGA-5mRNARNAse HAntisense DNA Decoy核酸是與靶轉(zhuǎn)錄因子具有高親和性的雙鏈寡聚核酸 ,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控區(qū)域的結(jié)合 ,調(diào)控轉(zhuǎn)錄來(lái)改變下游基因的異常表達(dá) ,從而抑制腫瘤惡性增殖 . 體外篩選結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子AP2的decoy核酸藥物 ,結(jié)果K102對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的抑制作用 ,在異植人腫瘤細(xì)胞NCIH460的裸鼠模型中 ,靜脈注射高中低三劑量組的decoy核酸K102 ,抑瘤率分別達(dá) 71.8%、64.4 %及 57.3%.通過(guò)凝膠阻抑試驗(yàn) ,驗(yàn)證了K102與轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生
14、特異性結(jié)合 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果為decoy核酸轉(zhuǎn)錄調(diào)控藥物的研究提供了依據(jù)。b、Decoy核酸Design oligos which can specifically bind to the transcription factor JUN/ATF and block downstrean multiple oncogenes expression RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機(jī)制. RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制。由于RNA干擾是針對(duì)轉(zhuǎn)
15、錄后階段的基因沉默,相對(duì)于傳統(tǒng)基因治療對(duì)基因水平上的敲除,整個(gè)流程設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)便,且作用迅速,效果明顯,為基因治療開(kāi)辟了新的途徑。其總體思路是通過(guò)加強(qiáng)關(guān)鍵基因的RNAi機(jī)制,控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進(jìn)程或外源致病核酸的復(fù)制及表達(dá)。c、RNA干擾 單克隆抗體(單抗)藥物就是通過(guò)淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)或基因工程技術(shù)制備的抗體。起初用于診斷劑或檢測(cè)劑,后來(lái)用于治療腫瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病。治療腫瘤的優(yōu)越性: (1)單抗藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用 (2)單抗藥物具有更高的療效 (3)單抗藥物對(duì)腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)的特異性作用 其研究重點(diǎn)主要集中在將抗體與化學(xué)藥物、酶、放射性核素、毒素和生物誘導(dǎo)劑
16、等耦聯(lián)后直接殺傷腫瘤或者利用抗體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等方面。目前,國(guó)際上與腫瘤治療相關(guān)的抗體研究主要集中在將抗體與耦聯(lián)物作用后直接殺傷腫瘤細(xì)胞,利用抗體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等方面。7、單克隆抗體藥物 代表藥物:曲妥珠單抗(trastuzumab, Herceptin ) Trastuzumab為靶向結(jié)合HER2的人IgG1類(lèi)單抗,HER2為酪氨酸激酶受體,在約20%25%的進(jìn)展期乳腺癌患者過(guò)表達(dá)。HER2分子具有以下的特點(diǎn),因此成為乳腺癌治療的靶分子: HER2的表達(dá)水平與乳腺癌的發(fā)病機(jī)理及預(yù)后相關(guān); 腫瘤的HER2表達(dá)水平及基因拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于正常組織,有效的減輕了H
17、ER2靶向治療藥物的毒性; HER2表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞比例很高,而且在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá),因此在患者體內(nèi)可以靶向大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞; HER2在原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移灶均有表達(dá),因此HER2靶向治療對(duì)原發(fā)及轉(zhuǎn)移病灶均有效。曲妥珠單抗(trastuzumab)的作用機(jī)制:抑制受體信號(hào)傳導(dǎo)。HER2可以活化多種信號(hào)傳導(dǎo)通路,包括PI3K、MAPK等。Trastuzumab減少了這些信號(hào)通路的傳導(dǎo),將細(xì)胞阻滯于調(diào)定點(diǎn),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。受體信號(hào)傳導(dǎo)的降低是由于trastuzumab介導(dǎo)的HER2受體內(nèi)化及降解。通過(guò)調(diào)節(jié)p27kipl阻滯細(xì)胞于G1調(diào)定點(diǎn)。Trastuzumab處理的細(xì)胞被阻滯于G1調(diào)定點(diǎn),細(xì)胞增殖
18、減少。細(xì)胞阻滯于G1調(diào)定點(diǎn)與細(xì)胞周期依賴(lài)的激酶抑制蛋白p27kipl相關(guān)。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)研究表明trastuzumab可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡,凋亡的發(fā)生與Ki67的表達(dá)無(wú)關(guān)。抑制血管形成。高表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞新生血管及VEGF的表達(dá)顯著增加。體內(nèi)研究結(jié)果顯示trastuzumab處理后,乳腺癌腫瘤體積減小,微血管密度降低;體外研究表明trastuzumab處理后,內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力下降。 抑制DNA修復(fù)。體外研究顯示可與許多化療藥物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。Trastuzumab或聯(lián)合化療藥物促進(jìn)DNA損傷,并抑制DNA的修復(fù),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡??鼓[瘤新藥發(fā)現(xiàn)Mathematical modelC
19、ell BiologyTarget selectionDrug design(Pre)clinical testingHow many drug targets are there?8,000 targets of pharmacological interest, of which nearly 5,000 could be potentially hit by traditional drug substances, nearly 2,400 by antibodies and 800 by protein pharmaceuticals. Drug Target: EnzymesDrug
20、 Target: Enzymes IIDrug Target: Enzymes IIIDrug Target: Enzymes IIIDrug Target: Receptors IDrug Target: Receptors IIDrug Target: Receptors IIIDrug Target: Receptors IIIDrug Target: Ion channelsDrug Target: Transport proteinsDrug Target: DNA/RNA and the ribosomeDrug Target: Targets of monoclonal anti
21、bodiesDrug Target: Various physicochemical mechanisms抗腫瘤藥物的篩選和評(píng)價(jià)抗腫瘤藥的臨床前藥理研究包括藥效學(xué)和毒性研究?jī)刹糠挚鼓[瘤藥物藥效學(xué)需研究?jī)?nèi)容:體外抗腫瘤試驗(yàn)體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)評(píng)價(jià)藥物的抗癌活性時(shí),以體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為主,同時(shí)參考體外試驗(yàn)結(jié)果以做出正確的結(jié)論。 體外抗腫瘤活性試驗(yàn) 目的:對(duì)候選化合物進(jìn)行初步篩選; 了解候選化合物的抗瘤譜;為隨后進(jìn)行的體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)提供參考,如劑量范圍、腫瘤類(lèi)別等 。 體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法體外試驗(yàn)常用方法有:染料排斥法四氮唑鹽還原法 阿拉馬藍(lán)法磺酰羅丹明染色法 集落形成法生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定法。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)
22、時(shí)間一般為48-72 小時(shí),貼壁細(xì)胞需先貼壁24 小時(shí)后再給藥。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥,陰性對(duì)照為溶媒對(duì)照 體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法染料排斥法(dye exclusion assay)試驗(yàn)原理:活細(xì)胞有排斥某些染料如伊紅、臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑等的能力,而死細(xì)胞由于膜完整性的破壞,可被著色。因此培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中加入這些染料,一定時(shí)間后,對(duì)著色和未著色的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),即可算出被殺死的細(xì)胞比例。方法要點(diǎn):向一定容積的待檢細(xì)胞懸液加入定量的某種染液,最常用的是0.4%臺(tái)盼藍(lán)液,混勻,室溫染色5-15min,將已染色的細(xì)胞懸液滴加至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,直接在光鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)和
23、細(xì)胞總數(shù)。觀測(cè)指標(biāo):按(未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))X100%計(jì)算活細(xì)胞率,對(duì)照組活細(xì)胞率應(yīng)在90%以上。根據(jù)活細(xì)胞率計(jì)算受試樣品的半數(shù)致死劑量(IC50)作為藥物抗腫瘤活性的指標(biāo)。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法阿拉馬藍(lán)法(alamar blue assay)試驗(yàn)原理:非熒光性藍(lán)色底物阿拉馬藍(lán)可被活細(xì)胞中的線(xiàn)粒體內(nèi)的NADPH相關(guān)的脫氫酶類(lèi)還原為強(qiáng)熒光性粉紅色底物,采用微培養(yǎng)板自動(dòng)讀數(shù)儀在激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為530nm和590nm處讀取熒光強(qiáng)度值,與活細(xì)胞數(shù)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。方法要點(diǎn):細(xì)胞經(jīng)受試樣品處理后,加入10-20ul阿拉馬藍(lán)染液,繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間,用微培養(yǎng)板自動(dòng)讀數(shù)儀在激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為53
24、0nm和590nm處讀取熒光強(qiáng)度值。觀測(cè)指標(biāo):根據(jù)熒光強(qiáng)度可以計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率,適當(dāng)時(shí)可進(jìn)一步計(jì)算IC50值。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法集落形成法(clonogenic assay)試驗(yàn)原理:克隆原細(xì)胞具有持續(xù)增殖能力,當(dāng)單個(gè)細(xì)胞分裂6代或6代以上時(shí),其后代所組成的群體(集落)便含50個(gè)以上細(xì)胞。通過(guò)集落計(jì)數(shù)可對(duì)克隆原細(xì)胞作定量分析。它反映了單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力,故能較靈敏地測(cè)定抗癌藥的活性,日前被認(rèn)為是一種較理想的檢測(cè)方法。方法要點(diǎn):將濃度為500個(gè)細(xì)胞/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液2ml種至35ml的培養(yǎng)皿,并加受試樣品適量,培養(yǎng)7d或更長(zhǎng)時(shí)間,姬姆薩染色,解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)含50細(xì)胞以上的集落
25、。觀測(cè)指標(biāo):根據(jù)集落數(shù)計(jì)算集落形成率,對(duì)照組集落形成率不應(yīng)低于40%,再計(jì)算用藥組的集落形成抑制率,根據(jù)情況可進(jìn)一步采用Logit法計(jì)算受試樣品的IC50值。 集落形成率=集落數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)X100% 集落形成抑制率=(1-用藥組集落形成率)/對(duì)照組集落形成率X100%體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定法(growth-curve determination)試驗(yàn)原理:在最適條件下,腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈指數(shù)生長(zhǎng),如取細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間作圖可得一條直線(xiàn),故稱(chēng)此時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨著細(xì)胞密度不斷增高,由于代謝產(chǎn)物的積聚及營(yíng)養(yǎng)物的消耗,細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減慢以致停止,此時(shí)稱(chēng)高坪期或穩(wěn)定期。因此藥物對(duì)
26、細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可通過(guò)生長(zhǎng)曲線(xiàn)反映出來(lái) 。方法要點(diǎn): 將濃度為10000個(gè)細(xì)胞/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液按每瓶5ml種至25ml的培養(yǎng)瓶,或按每孔100微升種至96孔板,并加受試樣品適量,培養(yǎng)后分別于即刻和1、2、3、4、5、6、7d進(jìn)行檢測(cè)。前者可采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞,后者可采用MTT法或SRB法讀取OD值,并據(jù)此進(jìn)行作圖與計(jì)算。 觀測(cè)指標(biāo) 1、倍增時(shí)間(TD),將實(shí)際生在曲線(xiàn)進(jìn)行直線(xiàn)回歸求出0和t時(shí)刻的理論細(xì)胞數(shù)N0和N t,據(jù)此計(jì)算:(log N tlog N0);2 增殖細(xì)胞殺傷率(%)=( N0N0)/ N0100%;3 細(xì)胞生長(zhǎng)飽和密度(N s),代表高坪期每毫升細(xì)胞數(shù)的均數(shù)。
27、體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法磺酰羅丹明染色法(sulforhodamine B assay)試驗(yàn)原理:SRB是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料,粉紅色,可溶于水。 SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合。其在515 nm波長(zhǎng)的OD讀數(shù)與細(xì)胞數(shù)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。故可用作細(xì)胞數(shù)的定量。MTT法的一個(gè)缺點(diǎn)是OD值可隨放置時(shí)間而變,而SRB法無(wú)此現(xiàn)象。因此更適用于進(jìn)行大規(guī)模的試驗(yàn)。 方法要點(diǎn): 用10%冷三氯乙酸與4固定已經(jīng)受試樣品處理的細(xì)胞1h,洗滌,干燥;加入4mg/ml SRB液100微升/孔 染色15min,1%冰醋酸洗滌,干燥;最后加入150微升/孔 的Tris溶液,在酶標(biāo)儀上與515nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。
28、觀測(cè)指標(biāo) 同MTT法。另外,NCI目前采用以下指標(biāo)評(píng)價(jià)化合物的體外抗腫瘤活性。測(cè)定的OD值包括對(duì)照組、加藥組及加藥時(shí)的細(xì)胞的OD值C、T、和T0。據(jù)此計(jì)算: 生長(zhǎng)抑制率(%)=(TT0)/(CT0)100% ;細(xì)胞死亡率(%)=(TT0)/ T0 100% 。 按生長(zhǎng)抑制率或細(xì)胞死亡率對(duì)樣品濃度繪出量效關(guān)系曲線(xiàn)圖,并求出: GI50,即生長(zhǎng)抑制率為50%時(shí)的樣品濃度; TGI,即生長(zhǎng)抑制率為100%時(shí)的樣品濃度: LC50,即細(xì)胞死亡率為50%時(shí)的樣品濃度。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法四氮唑鹽還原法(tetrazolinm salt reduction assay)試驗(yàn)原理:四氮唑MTT,3-(
29、4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide是一種能接受氫原子的染料?;罴?xì)胞線(xiàn)粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲月替 (formazan),而死的細(xì)胞則無(wú)此功能。用二甲基亞諷(DMSO)溶解甲月替后,在一定波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值,即可定量測(cè)出細(xì)胞的存活率。 方法要點(diǎn):受試樣品處理細(xì)胞結(jié)束后,加入5mg/ml MTT液20微升/孔,繼續(xù)培養(yǎng)四小時(shí)。再加三聯(lián)液并培養(yǎng)過(guò)夜。在酶標(biāo)儀上于570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。 觀測(cè)指標(biāo) 直接指標(biāo)為96孔板上各被測(cè)孔的OD值;然后按公式(對(duì)照組OD
30、值-治療組OD值)/對(duì)照組OD值100%計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率;劇情況可進(jìn)一步采用Logit法計(jì)算50%生長(zhǎng)抑制濃度IC50值。 體外抗腫瘤活性試驗(yàn)體外篩選方法的優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單用藥量少取材可直接用于人體腫瘤得出結(jié)果快速Case: Activity of 20 compounds on the growth of three cancer cell linesProvider: C Biotech CompanyHuman NCI-H460 lung cancer cell without treatmentHuman NCI-H460 lung cancer cell With Compo
31、und A treatment體外抗腫瘤活性試驗(yàn) 體外篩選方法的缺陷:1、細(xì)胞毒性易顯陽(yáng)性,有毒物質(zhì)也常常顯陽(yáng)性,故假陽(yáng)性率高2、非直接對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的藥物顯示假陰性3、體外細(xì)胞并不能完全代表體內(nèi)腫瘤的惡性細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn) 1、自發(fā)性腫瘤2、誘發(fā)的腫瘤3、移植性腫瘤 (a)皮下腫瘤模型 (b)腹水瘤模型 (c)原位接種模型 體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)小鼠腫瘤模型 淋巴細(xì)胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宮頸癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、網(wǎng)織細(xì)胞瘤M5076、腸癌26、腸腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤(EAC)、肉瘤-180等,以及各種小鼠腫瘤的
32、亞型和耐藥株等。 人癌裸小鼠移植瘤模型 應(yīng)選用體外試驗(yàn)敏感細(xì)胞株進(jìn)行體內(nèi)抗人癌裸小鼠移植瘤試驗(yàn)。 模型建立和使用應(yīng)注意:(1) 移植瘤一般由相應(yīng)的細(xì)胞株移植而建立,對(duì)細(xì)胞株和移植瘤的化療敏感性應(yīng)予了解。(2) 移植瘤復(fù)蘇后一般應(yīng)傳2-3代后再用于體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。(3) 對(duì)模型生長(zhǎng)情況應(yīng)全面了解,尤其是生長(zhǎng)快的模型(4) 為了保持移植瘤的生物學(xué)特性和遺傳特性,復(fù)蘇后移植瘤體內(nèi)傳代應(yīng)少于 15-20代 體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)接種:腫瘤接種方法主要有皮下接種、腹腔接種和原位接種。 體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)皮下腫瘤模型選擇腫瘤生長(zhǎng)旺盛且無(wú)潰破的荷瘤小鼠,頸椎脫臼處死,在無(wú)菌條件下(超凈臺(tái)或接種罩),用碘酒、酒精
33、或新潔爾滅消毒動(dòng)物皮膚,切開(kāi)皮膚,剝離腫瘤。將瘤組織剪成1.5 mm3左右,用套管針接種于動(dòng)物一側(cè)或雙側(cè)腋窩皮下;或制成細(xì)胞懸液,然后按一定比例加入無(wú)菌生理鹽水,一般每只小鼠接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量為(1-5)106。 Human lung cancer NCI-H460 xenografted in nude mice without treatmentHuman lung cancer NCI-H460 xenografted in nude mice with Compound C treatment體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)腹水瘤模型無(wú)菌條件下,消毒動(dòng)物皮膚,吸取生長(zhǎng)良好的動(dòng)物腹水,以生理鹽水按一定比例稀釋后接種于動(dòng)物腹腔,接種細(xì)胞數(shù)量一般為(1-5)106。體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)原位接種模
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