第酵母基因工程基因工程原理與技術(shù)劉志國(guó)課件

1、第二節(jié) 常見(jiàn)的酵母(jiom)基因表達(dá)系統(tǒng)第八章 酵母(jiom)基因工程 酵母菌表達(dá)載體 酵母基因表達(dá)宿主系統(tǒng)第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系第四節(jié) 酵母基因工程應(yīng)用舉例-利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)第三節(jié) 影響外源基因表達(dá)的因素共五十九頁(yè)酵母菌的分類學(xué)特征(tzhng) 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式(fngsh)進(jìn)行無(wú)性繁殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、半知菌類，共由56個(gè)屬和500多個(gè)種組成。 酵母菌是比較成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。第一節(jié) 酵母基因表達(dá)體系-宿主系統(tǒng)共五十九頁(yè)作為宿主(szh)細(xì)胞的酵母需滿足的基本要求 安全無(wú)毒，沒(méi)有致病性。 遺傳背景

2、清楚，容易進(jìn)行遺傳操作。 外源DNA容易導(dǎo)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率高。 培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易進(jìn)行高密度發(fā)酵。 有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌(fnm)能力。 有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工能力。 共五十九頁(yè)酵母菌表達(dá)外源基因(jyn)的優(yōu)勢(shì)全基因(jyn)組測(cè)序，基因(jyn)表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)酵母菌是最簡(jiǎn)單的真核模式生物共五十九頁(yè)常用(chn yn)的酵母宿主菌目前(mqin)已廣泛用于外

3、源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：釀酒酵母屬 如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克魯維酵亞母屬 如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）畢赤酵母屬 如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母屬 如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。 假絲酵母屬 產(chǎn)朊假絲酵母 (Candida utilis) 共五十九頁(yè)酵母菌表達(dá)(biod)系統(tǒng)的選擇 釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)(xtng)最

4、為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)酶基因ADH所屬的啟動(dòng)子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問(wèn)題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)彌補(bǔ)。共五十九頁(yè) 乳酸克魯維酵母(jiom)的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)(biod)穩(wěn)定性載體，即便在無(wú)選擇壓力的條件下，也乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)能穩(wěn)定遺傳40代以上。 乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系

5、統(tǒng)。共五十九頁(yè) 巴斯德畢赤酵母(jiom)是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌，能在甲醇培養(yǎng)基中生巴斯德畢赤酵母表達(dá)(biod)系統(tǒng)長(zhǎng)，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)。表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)：生長(zhǎng)迅速、強(qiáng)啟動(dòng)子（乙醇氧化酶基因AOX1） 、可誘導(dǎo)表達(dá) 由于巴斯德畢赤酵母沒(méi)有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因序列一般整合入受體的染色體DNA上。其外源基因20余種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有共五十九頁(yè) 多型漢遜酵母(jiom)也是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列多型漢遜酵母(jiom)表達(dá)系統(tǒng)HARS已被克隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體， HAR

6、S質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上（可連續(xù)整合100多 目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該個(gè)拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。共五十九頁(yè)釀酒(nin ji)酵母中的2m環(huán)狀質(zhì)粒同源(tn yun)重組REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá)50至100個(gè)。IRs 反向重復(fù)序列，600 bp，重組FLP 編碼產(chǎn)物驅(qū)動(dòng)IRs的同源重組REP 編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性STB REP的結(jié)合位點(diǎn)接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等均與2m質(zhì)粒類似。第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系-載體共五

7、十九頁(yè)第一節(jié) 酵母基因工程表達(dá)體系(tx)-載體 酵母質(zhì)粒載體既可以在大腸桿菌復(fù)制與擴(kuò)增、又可以在酵母系統(tǒng)中復(fù)制與擴(kuò)增，故此類載體又稱為穿梭載體（shuttle vector）。 酵母菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體是由來(lái)自酵母的部分核酸序列和細(xì)菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列，這兩個(gè)部分主要是作為在大腸桿菌宿主時(shí)增殖(zngzh)和篩選組分。酵母部分包括酵母轉(zhuǎn)化子的篩選組分，主要是與宿主互補(bǔ)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及編碼特定蛋白的基因啟動(dòng)子和終

8、止子序列。 共五十九頁(yè)第一節(jié) 酵母基因工程(jyn gngchng)表達(dá)體系 -載體1酵母載體的基本(jbn)結(jié)構(gòu) DNA復(fù)制起始區(qū)：2質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)及酵母基因組的自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequence，ARS） 篩選標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選或者抗性篩選 整合介導(dǎo)區(qū) 有絲分裂穩(wěn)定區(qū) 表達(dá)盒： 啟動(dòng)子 ，基因（分泌信號(hào)序列 ），終止子共五十九頁(yè)2 酵母(jiom)載體的種類酵母整合型質(zhì)粒YIp： 缺乏酵母的復(fù)制起始(q sh)位點(diǎn)，不能在酵母中自主復(fù)制，含有酵母的篩選標(biāo)記ura3基因。具有整合介導(dǎo)區(qū)， 所以，它只有整合到酵母染色體中才能穩(wěn)定(a)。酵母克隆

9、表達(dá)載體根據(jù)其在酵母中復(fù)制形式來(lái)分類。分為下列五類 ：酵母載體按照用途不同可分為克隆載體和表達(dá)載體兩類共五十九頁(yè)含有酵母菌染色體DNA同源(tn yun)序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建 在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來(lái)的質(zhì)粒稱為YIp。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣(zhyng)目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。共五十九頁(yè)酵母附加體質(zhì)粒YEp：含有釀酒酵母2m質(zhì)粒DNA復(fù)制有關(guān)的序列，該載體在酵母細(xì)胞中穩(wěn)定(wndng)，拷貝數(shù)可達(dá)60-100。轉(zhuǎn)化效率高（b）。 酵母復(fù)制型質(zhì)粒YRp：含有來(lái)源于酵母的DNA復(fù)制起始(q sh)區(qū)

10、(ARS)，能在酵母染色體外自主復(fù)制的一種自主復(fù)制型載體，雖然其轉(zhuǎn)化效率高，在宿主的拷貝數(shù)可以達(dá)上百個(gè)（c）。 共五十九頁(yè) ARS為酵母菌中的自主復(fù)制(fzh)序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40 kb就有一個(gè)(y )ARS元件。 以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp 上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個(gè)， 以2m質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YEp但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。共五十九頁(yè)2 酵母(jiom)載體的種類 酵母著絲粒質(zhì)粒YCp：含有(hn yu)酵母染色體著絲粒的DNA片段，這種載體在細(xì)胞分裂過(guò)程中，在母細(xì)胞和子細(xì)胞

11、之間平均分配，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性(d)。 CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列,將CEN DNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCp .YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1 - 5個(gè)。 共五十九頁(yè) 酵母人工染色體YAC：酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。 YAC具有自主復(fù)制序列（ARS）、著絲粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇(xunz)的標(biāo)記基因。 YAC載體在宿主細(xì)胞中以線性雙鏈DNA存在，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點(diǎn)。

12、可接受100-1000kb的外源DNA片段。 共五十九頁(yè)主要結(jié)構(gòu)： 兩個(gè)可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； 酵母菌著絲粒序列 (centromere4,CEN4)； 一個(gè)自主復(fù)制序列(ARS1)； 兩個(gè)來(lái)自嗜熱四膜蟲(chóng) (Tetrahymenna thermophilp)的末端重復(fù)序列(TEL)，以保持重組YAC為線狀結(jié)構(gòu)； 在兩個(gè)末端序列中間，有一段填充(tinchng)序列(stuff, HIS3)，以便pYAC4在細(xì)菌細(xì)胞中穩(wěn)定擴(kuò)增； Ampr抗性及細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)； 一個(gè)EcoR克隆位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于酵母菌Sup4 tRNA基因內(nèi)。 共五十九頁(yè) 酵母菌的轉(zhuǎn)化

13、(zhunhu)系統(tǒng)酵母菌的轉(zhuǎn)化(zhunhu)方法用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因共五十九頁(yè)酵母菌轉(zhuǎn)化(zhunhu)方法原生質(zhì)球法：酶解酵母(jiom)細(xì)胞壁，產(chǎn)生原生質(zhì)球，原生質(zhì)體在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允許DNA進(jìn)入，然后使原生質(zhì)球再生新的細(xì)胞壁?？梢詫?shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。Li+鹽轉(zhuǎn)化方法 ：釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）處理后，在PEG存在下和熱休克之后可高效吸收質(zhì)粒DNA。醋酸鋰對(duì)釀酒酵母有效，對(duì)畢赤酵母無(wú)效，畢赤酵母轉(zhuǎn)化一般用氯化鋰有效優(yōu)點(diǎn)：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA（相差80倍）共五十九頁(yè)酵母菌轉(zhuǎn)化(zhunhu)方法電

14、擊轉(zhuǎn)化法：原理是通過(guò)利用高壓電脈沖作用，造成細(xì)胞(xbo)膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，形成可逆的瞬間通道，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)胞(xbo)，也有利于外源DNA等大分子進(jìn)入 優(yōu)點(diǎn)：不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件；適用范圍廣；轉(zhuǎn)化率高（達(dá)105 / mg DNA）。PEG轉(zhuǎn)化法：PEG 1000共五十九頁(yè)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化(zhunhu)特點(diǎn)單、雙鏈DNA均可轉(zhuǎn)化(zhunhu)，但單鏈的轉(zhuǎn)化(zhunhu)率是雙鏈的10-30倍單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制（含有復(fù)制子）或同源整合入染色體（不含復(fù)制子）克隆在YIp上的外源基因，會(huì)發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50-80%共五十九

15、頁(yè)用于轉(zhuǎn)化子篩選(shixun)的標(biāo)記基因 營(yíng)養(yǎng)(yngyng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA 等 但對(duì)于多倍體酵母來(lái)說(shuō)，篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的受體非常困難營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因共五十九頁(yè)用于轉(zhuǎn)化子篩選(shixun)的標(biāo)記基因其編碼產(chǎn)物(chnw)只要是毒性物質(zhì)的抗性蛋白顯性標(biāo)記基因 aph 氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶 抗G418 cat 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 抗氯霉素 dhfr 二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 銅離子螯合物 耐受銅離子 suc2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶 耐受高濃度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型共五十

16、九頁(yè)第二節(jié) 常見(jiàn)的酵母(jiom)基因表達(dá)系統(tǒng)一、 釀酒酵母(jiom)表達(dá)系統(tǒng)1，啟動(dòng)子 組成型表達(dá)的啟動(dòng)子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）啟動(dòng)子、甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH或GAPl）啟動(dòng)子 可控性啟動(dòng)子：半乳糖啟動(dòng)子（GAL）、酸性磷酸酶啟動(dòng)子（PHO）、乙醇脫氫酶（ADH2）啟動(dòng)子、Cu2+螯合蛋白啟動(dòng)子（CUPI）以及交配a型阻遏系統(tǒng)（MATa/a） 共五十九頁(yè)酵母菌啟動(dòng)子的可控性pho4TS-PHO5啟動(dòng)子：釀酒酵母PHO5啟動(dòng)子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡(ho jn)時(shí)才能打開(kāi)PHO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動(dòng)子的正調(diào)控(dio kn)因子因此，裝在pho4TS-PHO5啟動(dòng)子下游的

17、外源基因在35時(shí)關(guān)閉23誘導(dǎo)表達(dá)溫度控制型啟動(dòng)子PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產(chǎn)物在35時(shí)失活共五十九頁(yè)酵母菌啟動(dòng)子的可控性a a 型啟動(dòng)子釀酒酵母有a和a兩種單倍體，分別由MATa和MATa兩個(gè)等位基因決定。a1因子決定a細(xì)胞特征表達(dá)a2因子阻遏(z )a細(xì)胞特征表達(dá)a1-a2阻遏a細(xì)胞特征表達(dá)編碼a2因子的基因突變型hmla2-102能產(chǎn)生a2變體，它能滅活a1，同時(shí)阻遏a型溫度控制型啟動(dòng)子a 型啟動(dòng)子hmla2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型啟動(dòng)子 受體細(xì)胞基因組 重組(zhn z)質(zhì)粒a 型啟動(dòng)子hmla2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型啟動(dòng)子a2

18、a12535（）共五十九頁(yè)酵母菌啟動(dòng)子的可控性釀酒(nin ji)酵母超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80基因基底水平(shupng)表達(dá)GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導(dǎo)時(shí)，GAL4高效表達(dá)，GAL1、GAL1、GAL10超高效表達(dá)GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由GAL1 GAL7和 GAL10基因編碼共五十九頁(yè)雜合啟動(dòng)子：將釀酒酵母的乙醇脫氫酶基因（ADH2）所屬啟動(dòng)子的上游調(diào)控區(qū)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）所屬啟動(dòng)子的下游基本(jbn)區(qū)重組在一起，構(gòu)建出ADH2-GADPH型雜合啟動(dòng)子 共五十九頁(yè)釀酒(ni

19、n ji)酵母表達(dá)載體 目前已建立的釀酒酵母表達(dá)(biod)載體有（1）酵母附加體質(zhì)粒(YEp) （見(jiàn)右圖）；（2）酵母復(fù)制型質(zhì)粒(YRp)；（3）酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp) ；（4）酵母整合型質(zhì)粒 (YIp)；（5）酵母人工染色體(YAC)。前三類統(tǒng)稱為游離自主復(fù)制型質(zhì)粒載體。含有來(lái)自酵母基因組的復(fù)制起始區(qū)ARS或者酵母天然質(zhì)粒2m復(fù)制起點(diǎn)序列，能夠自主復(fù)制，通常為多拷貝數(shù)共五十九頁(yè)釀酒酵母(jiom)宿主 有些蛋白酶缺陷有利于重組(zhn z)異源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。如pep4-3突變株中蛋白酶的活性顯著降低，對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的降解作用較小。 共五十九頁(yè)提高(t go)重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿

20、主菌能導(dǎo)致釀酒(nin ji)酵母中重組蛋白產(chǎn)量提高或質(zhì)量改善的突變類型ssc1 改善重組蛋白分泌 鈣離子依賴型的ATP酶ssc2 提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄后加工rgr 1 提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄水平ose1 提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄水平ssc11 改善重組蛋白分泌 羧肽酶Yrho- 提高重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)錄水平突變類型生物效應(yīng)作用位點(diǎn)共五十九頁(yè)釀酒酵母(jiom)宿主 為了減少目的蛋白的過(guò)度糖基化，目前已從野生型的釀酒酵母中分離出許多類型的糖基化途徑突變(tbin)株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突變株、天門(mén)冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷的alg突變株以及外側(cè)糖鏈缺陷型的och突變株等。在這些突變株中，具有

21、重要實(shí)用價(jià)值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因?yàn)樗鼈儾荒茉诋愒吹鞍椎奶扉T(mén)冬酰胺側(cè)鏈上延長(zhǎng)甘露多聚糖長(zhǎng)鏈。 共五十九頁(yè)抑制(yzh)超糖基化作用的突變宿主菌能抑制超糖基化的突變(tbin)類型mnn 甘露糖生物合成缺陷型alg 天冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型och 外側(cè)糖鏈添加缺陷型突變類型生物效應(yīng) 許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個(gè)糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。 酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對(duì)異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。共五十九頁(yè)減少泛素依賴型蛋白降解

22、(jin ji)作用的突變宿主菌泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解(jin ji)作用蛋白酶體LysHOOCUbiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3 Lysubiquitin ligase E3 Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白共五十九頁(yè)減少泛素依賴型蛋白(dnbi)降解作用的突變宿主菌酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼(bin m)基因酵母菌有四個(gè)泛素編碼基因：UBI 1 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 2 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 3 編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表

23、達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 4 編碼泛素五聚體 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期關(guān)閉 穩(wěn)定期表達(dá)酵母菌有七個(gè)泛素連接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7共五十九頁(yè)減少泛素依賴型蛋白(dnbi)降解作用的突變宿主菌泛素降解途徑(tjng)衰減的釀酒酵母釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表達(dá)，UBI 4-突變株能UBI 4缺陷型： 外源基因表達(dá)理想的受體正常生長(zhǎng)，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，UBA 1缺陷型：減少蛋白降解UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解Ubc4 - ubc

24、5 雙突變型： 減少蛋白降解七個(gè)泛素連接酶基因的突變對(duì)衰減蛋白降解作用同樣有效共五十九頁(yè)二、畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)(biod)系統(tǒng) 1. 啟動(dòng)子 （1） AOX1和AOX2啟動(dòng)子（2）三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldeyde 3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH）啟動(dòng)子 （3）甲醛(ji qun)脫氫酶（formaldehyde dehydrogenase, FLD）啟動(dòng)子共五十九頁(yè)2 畢赤酵母(jiom)表達(dá)載體類型胞內(nèi)表達(dá)(biod)載體pPICZ A,B,C 分泌型表達(dá)載體pPICZa A,B,C 共五十九頁(yè)畢赤酵母表達(dá)載體上無(wú)酵

25、母復(fù)制(fzh)起點(diǎn)，它是靠AOX1或HIS4基因的位置同源重組整合入酵母染色體DNA中，并隨酵母的生長(zhǎng)傳代穩(wěn)定地存在。整合的方式可以是單交換插入，亦可雙交換插入，一般來(lái)說(shuō)前一種方式更容易發(fā)生 。3 載體(zit)的整合方式依據(jù)具體整合位點(diǎn)及相應(yīng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子的類型可分為三種情況：共五十九頁(yè)5 AOX1和3 AOX1與染色體發(fā)生同源重組，使受體染色體帶有一個(gè)拷貝的外源基因。這種情況有功能的AOX1基因被替換而丟失后，只能利用弱的AOX2基因啟動(dòng)合成AOX，就產(chǎn)生His+MutS表型(methanol utilization slow)，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢(hunmn)。此時(shí)，甲醇利用率很

26、低，但它表達(dá)外源基因的效率高染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發(fā)生置換，使得一個(gè)或多個(gè)表達(dá)單位(dnwi)插入在his4位點(diǎn)，產(chǎn)生的表型也是His+ Mut+染色體AOX1區(qū)與載體質(zhì)粒的AOX1區(qū)發(fā)生單位點(diǎn)互交換，外源基因的表達(dá)單位插入在基因區(qū)AOX1基因的上游或下游，這一過(guò)程可重復(fù)發(fā)生，使得更多拷貝的表達(dá)單位插入基因組中。這種情況AOX1基因仍然有活性，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)正常，產(chǎn)生的表型是His+Mut+。 共五十九頁(yè) 在畢赤酵母中有3種方法可以得到多拷貝表達(dá)(biod)菌株。 第一種方法直接構(gòu)建含高拷貝外源基因的表達(dá)載體，在體外利用同尾酶向載體中多次插入首尾相連的表達(dá)盒。此法的優(yōu)點(diǎn)

27、是一次整合，即可有多個(gè)表達(dá)盒插入染色體。但體外基因操作較繁瑣。 第二種方法是利用含有kanr基因的載體。細(xì)菌來(lái)源的卡那霉素抗性基因在酵母中賦予宿主抵抗真核抗生素G418。G418的抗性水平大致與載體的拷貝數(shù)相關(guān)。提高抗生素G418的濃度可以得到含高拷貝表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株。 第三種方法是用含有Zeocin抗性標(biāo)記基因Sh ble的載體來(lái)構(gòu)建多拷貝菌株。來(lái)源于細(xì)菌的Sh ble在酵母中賦予宿主對(duì)抗生素zeocin的抵抗能力，通過(guò)提高zeocin濃度可篩選出含高拷貝表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株。然而與G418篩選相似，大多數(shù)能抵抗高水平 zeocin 的轉(zhuǎn)化子并不含有多載體拷貝。 共五十九頁(yè)4 宿 主 常用的

28、畢赤酵母受體菌株有：組氨酸缺陷型GSl15和SMD1168，腺嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16， 其中SMD1168為蛋白酶缺陷型，以其作為宿主表達(dá)蛋白可以降低表達(dá)產(chǎn)物的降解。這些表達(dá)宿主都是由野生品系NRRL-Y11430衍生來(lái)的。最常用的受體菌是Cregg在1985年建立的GS115，它含有一個(gè)組氨醇脫氫酶缺陷型基因His4，可接受含His4 的載體而具有 His+表型來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。 根據(jù)(gnj)對(duì)甲醇利用的情況，畢赤酵母可劃分為三種表型。菌株含有AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率與野生型類似，稱為甲醇利用正表型（Mut+），如GS115；當(dāng)AOX1被其他基因取代，則

29、需依賴AOX2，但其甲醛代謝速度慢，稱為甲醇利用慢表型（Muts），如KM71。當(dāng)AOX基因全部缺失，則不能利用甲醇，稱為甲醇利用負(fù)表型（Mut-），如MC100-3。后兩者胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白質(zhì)有時(shí)優(yōu)于野生株，且需甲醇較少。 此外為增加分泌蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4, prb1)。 共五十九頁(yè)第三節(jié) 影響外源基因(jyn)表達(dá)的因素外源基因(jyn)穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PK

30、G、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個(gè)密碼子編碼的一、轉(zhuǎn)錄水平控制二、表達(dá)載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性三、其他因素共五十九頁(yè)優(yōu)化工程菌發(fā)酵(f jio)工藝 避免表達(dá)產(chǎn)物(chnw)在細(xì)胞內(nèi)的降解，選擇或改造宿主，如：采用二倍體宿主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為宿主第三節(jié) 影響外源基因表達(dá)的因素共五十九頁(yè) 利用(lyng)重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第四節(jié) 酵母基因工程(jyn gngchng)應(yīng)用實(shí)例 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病，每年約有200萬(wàn)病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對(duì)乙型肝炎病毒還沒(méi)有一種

31、有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對(duì)預(yù)防病毒感染具有重大的社會(huì)效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。共五十九頁(yè) 利用重組酵母(jiom)生產(chǎn)乙肝疫苗產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒(nin ji)酵母乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母共五十九頁(yè)乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)(jigu)與性質(zhì) 乙肝病毒是一種蛋白包裹(bogu)型的雙鏈DNA病毒，病毒顆粒呈乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)球面狀，直徑為42 nm，基因組僅為3.2 kb。病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白包括核心抗原（ HBcAg ）

32、、 此外，被乙肝病毒感染的人肝臟還能合成并釋放大量的22病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是各種未裝配的包裝蛋白的1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽。共五十九頁(yè)乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)(jigu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼(bin m)基因ATGATGATGTAA108 aa55 aa226 aapreS1preS2SS 多肽226 aaM 多肽281 aaL 多肽399 aa共五十九頁(yè)乙型肝炎病毒(bngd)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖(fnzh)，因此第一代的傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞膜上提取出來(lái)

33、的。這種來(lái)源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。共五十九頁(yè)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒(nin ji)酵母 20世紀(jì)80年代開(kāi)始選擇釀酒酵母表達(dá)重組(zhn z)HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為 22 nm，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。 目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAg顆粒的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的1%-2%。 進(jìn)一步的研究表明，M多肽和L多肽對(duì)S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗還可

34、以誘導(dǎo)那些對(duì) S抗原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。共五十九頁(yè)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組(zhn z)巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母(jiom)的構(gòu)建PARS2Bgl II5 AOX1HBsAgPHIS43 AOX1Bgl IIpBSAG15111 kbBgl II5 AOX1HBsAgPHIS43 AOX1his+的轉(zhuǎn)化子重組分子轉(zhuǎn)化his-的受體細(xì)胞染色體DNA共五十九頁(yè)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組(zhn z)巴斯德畢赤酵母 由于巴斯德畢赤酵母(jiom)染色體DNA上還擁有第二個(gè)乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。 重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導(dǎo)HBsAg表達(dá)，最終S蛋白的產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白總量的3% 在大規(guī)模的生產(chǎn)過(guò)程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個(gè)240L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬(wàn)份乙肝疫苗。共五十九頁(yè) 小 結(jié) 酵母基因工程，是根據(jù)酵母密碼子偏好從頭設(shè)計(jì)后化學(xué)合成或者P