克倫特羅檢測(cè)（ ELISA檢測(cè)法）

1、濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)報(bào)告科目：食品理化檢驗(yàn)班級(jí):15級(jí)食品本班組另I：11姓名:朱淼淼學(xué)號(hào):20156340044試驗(yàn)項(xiàng)目：克倫特羅檢測(cè)（ELISA檢測(cè)法）日期：2018.4.23一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、通過本次試驗(yàn)同學(xué)們能夠掌握ELISA法檢測(cè)瘦肉精的原理。2、掌握快速檢測(cè)的基本程序及操作，具有獨(dú)立進(jìn)行快速檢測(cè)的基本技能。二、實(shí)驗(yàn)原理：間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法：在酶標(biāo)板孔條上預(yù)包被克倫特羅抗原，加入抗克倫特羅抗體，樣本殘留的克倫特羅和微孔條上預(yù)包被的抗原競(jìng)爭(zhēng)抗克倫特羅抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物（標(biāo)記物為辣根過氧化物酶）顯色。樣本吸光值與其殘留物克倫特羅呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其相對(duì)應(yīng)的稀釋倍

2、數(shù)，即可得出樣品中克倫特羅的含量。三、實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備：儀器：微孔板酶標(biāo)儀450/630nm電子稱（0.01g）、漩渦混合振蕩器、離心機(jī)（15ml管和1.5mlep管）、恒溫培養(yǎng)箱耗材：小號(hào)研缽、15ml離心管、1.5mlep管、（10-50ul、50-250ul）微量移液器及配套槍頭、3ml一次性吸管、酶標(biāo)板架、濾紙、錫箔紙?jiān)噭?.1MHCI、0.1MNaOH6液、乙月青-0.1MHCI溶液；克倫特羅酶標(biāo)物、克倫特羅抗試劑、去離子水、底物A、底物B、終止液；標(biāo)準(zhǔn)品：濃度為0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ppb（10-3ug/ml）四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、組織用剪刀剪碎，研缽內(nèi)研成勻漿，

3、取2g肉/肝臟勻漿放入15ml離心管中；2、加入6ml去離子水，充分震蕩2min,室溫4000r/min以上離心10分鐘（注若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85c水浴10min后再離心）；3、取20ul上層液進(jìn)行分析，樣本稀釋4倍；4、微孔板編號(hào)，1-6號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)品，7/8號(hào)為樣品（每樣品或標(biāo)準(zhǔn)品均做平行對(duì)照即各2孔）；5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品：微孔中加入20ul樣品或標(biāo)準(zhǔn)品+50ul克倫特羅酶標(biāo)物+80ul克倫特羅抗試劑，輕輕振蕩混勻，蓋板膜蓋板后，25c避光30min；6、洗板：孔內(nèi)液體甩干，用去離子水液300ul/孔，充分洗滌5次，每次間隔30s,用吸水紙拍干（若有未拍干的氣泡用槍頭戳破

4、）；7、顯色：每孔加入50ul底物A+50U1底物B,輕輕振蕩混勻，蓋板膜蓋板后，25c避光15-20min（藍(lán)色）;8、測(cè)定：加入50ul終止液（黃色），輕輕振蕩混勻。酶標(biāo)儀450nm/630nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)OD值（可在加入終止液前目測(cè)含量）。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算：通過酶標(biāo)儀檢測(cè)得：表1:標(biāo)準(zhǔn)品與樣品酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果ABCDEFGH1（肉）2.1601.6431.2820.9390.3230.1301.3651.0152（肝）2.2441.5131.2800.9190.2610.1471.1201.112平均值2.2021.5781.2810.9290.2920.139通過計(jì)算可知：1號(hào)（肉）樣品

5、檢測(cè)結(jié)果的平均值為1.1902號(hào)（肝）樣品檢測(cè)結(jié)果的平均值為1.116B百分吸光度值（為=100%一BoB-標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液的平均吸光度值；B0（ppb）-標(biāo)準(zhǔn)品空白的平均吸光度值通過計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)，得：表2:標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的濃度值與百分吸光度值濃度值0.100.300.902.708.10樣品1樣品2他硬光度值71.6658.1742.1913.266.3154.0450.68以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得（因部分?jǐn)?shù)值誤差較大，因此在作圖過程中分別刪除了濃度為0.10和2.70的標(biāo)907060503020100一雪聚餐a-T準(zhǔn)品所對(duì)應(yīng)的

6、的百分吸光度值）：=-15,82Inx）十39.683即-0.9992系列1101標(biāo)準(zhǔn)值標(biāo)準(zhǔn)曲線將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式y(tǒng)=-15.82ln（x）+39.683,即為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出的樣本所對(duì)應(yīng)的濃度：將y=54.04代入方程，求得x的值為0.404,即樣品1（肉）對(duì)應(yīng)濃度為0.404ppb將y=50.68代入方程，求得x的值為0.499,即樣品2（肝）對(duì)應(yīng)濃度為0.499ppb對(duì)應(yīng)濃度再乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本濃度，此次實(shí)驗(yàn)中，樣品的稀釋倍數(shù)為4,即:樣品1（肉）的濃度：0.4044=1.614ppb樣品2（肝）的濃度：0.4994=1.996ppb六、討論：通過實(shí)驗(yàn)可知：樣品肉中的克倫特羅濃度為1.614ng/ml;樣品肝中的克倫特羅濃度為1.996ng/ml。通過查閱國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.192-2003動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定，可知運(yùn)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的線性范圍為0.004ng-0.054ng,而實(shí)驗(yàn)測(cè)得的樣品的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的線性范圍，因此兩樣品中的克倫特羅殘留量均嚴(yán)重超標(biāo)，不符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)中可能存在的問題及影響：1、通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)濃度為0.10和2.70ppb的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)量結(jié)果的誤差較大，可能是在輕輕振蕩混勻過程中用力較大，使液體濺出；2