四環(huán)素土霉素課件

1、第六章第十節(jié) 抗生素類藥物的分析1、掌握內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素、頭孢菌素）的鑒別反應(yīng)及含量測(cè)定的原理、方法。2、掌握氨基糖苷類抗生素（鏈霉素、慶大霉素）的鑒別試驗(yàn)及含量測(cè)定的原理、方法。3、熟悉四環(huán)素類（四環(huán)素、土霉素）、氯霉素類（氯霉素），大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、羅紅霉素、麥迪霉素）抗生素的鑒別試驗(yàn)及含量測(cè)定方法。4、了解磷霉素鈉、林可霉素的鑒別反應(yīng)及含量測(cè)定方法。5、了解青霉素、鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素、紅霉素等藥物中特殊雜質(zhì)的檢查方法。學(xué)習(xí)要點(diǎn) 第一節(jié) 概 述抗生素： 指在低微濃度下可對(duì)某些生物的生命活動(dòng)有特異性抑制作用的化學(xué)物質(zhì)，是目前臨床抗感染治療的重要藥物?？股氐幕钚裕?以效價(jià)單位來

2、表示，即指每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。一般常規(guī)檢查項(xiàng)目：1、鑒別試驗(yàn)2、異常毒性試驗(yàn)3、無菌試驗(yàn)4、熱原試驗(yàn)5、水分測(cè)定6、溶液澄明度檢查7、溶液酸堿度8、降壓試驗(yàn)9、含量測(cè)定或效價(jià)測(cè)定 抗生素的效價(jià)測(cè)定方法主要分為微生物檢定法和化學(xué)或物理化學(xué)測(cè)定法。 a、微生物檢定法 b、化學(xué)或物理化學(xué)測(cè)定法 第二節(jié) - 內(nèi)酰胺類抗生素的分析一、結(jié)構(gòu)：側(cè)鏈：A：-內(nèi)酰胺環(huán) B：氫化噻唑環(huán) 側(cè)鏈：A：-內(nèi)酰胺環(huán)B：氫化噻嗪環(huán)二、性質(zhì)： 1、強(qiáng)酸性 青霉素類和頭孢菌素類藥物其分子中的游離羧基具有相當(dāng)強(qiáng)的酸性能與無機(jī)堿或某些有機(jī)堿作用成鹽，如青霉素鈉（鉀）、氨芐西林鈉、磺芐西林鈉、普魯卡因青霉

3、素等。青霉素的堿金屬鹽水溶液遇酸則析出游離體的白色沉淀。 2、旋光性 青霉素族分子中含有三個(gè)手性碳原子，頭孢菌素族分子中含有兩個(gè)手性碳原子，故都具有旋光性。 3、紫外吸收 青霉素族分子中的母核部分無紫外吸收，但其側(cè)鏈部分由于具有苯環(huán)共軛系統(tǒng)，則有紫外吸收特征。頭孢菌素由于母核部分具有O=C-N-C=C結(jié)構(gòu)，故有紫外吸收。 4、-內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性 干燥純凈的青霉素鹽很穩(wěn)定。在室溫可保存3年以上。青霉素的水溶液很不穩(wěn)定，微量的水分易引起水解。 -內(nèi)酰胺環(huán)是青霉素族結(jié)構(gòu)中最不穩(wěn)定的部分，如與酸、堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子（銅、鉛、汞、銀）等作用時(shí)，易發(fā)生水解和分子重排，導(dǎo)致-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞而

4、失去抗菌活性。青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)破壞和發(fā)生分子重排后，產(chǎn)生一系列的降解產(chǎn)物，如青霉噻唑酸、青霉酸、青霉醛、青霉胺、青霉烯酸等。 三、鑒別試驗(yàn)1、鉀、鈉鹽的火焰反應(yīng) 青霉素族、頭孢菌素族藥物多是制成鉀鹽或鈉鹽供臨床使用，因而可利用其火焰反應(yīng)進(jìn)行鑒別。 2、呈色反應(yīng)羥肟酸鐵反應(yīng) 青霉素及頭孢菌素在堿性中與羥胺作用，-內(nèi)酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸，在稀酸中與高鐵離子呈色。 b硫酸-硝酸呈色反應(yīng) 頭孢菌素能與硫酸-硝酸反應(yīng)后呈色。此反應(yīng)可區(qū)別某些頭孢菌素族抗生素。 c茚三酮反應(yīng) 某些具有-氨基的本類藥物，如氨芐西林遇茚三酮顯藍(lán)紫色。 d與斐林試劑反應(yīng) 本類藥物具有類似肽鍵（-CONH-）結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生雙縮脲反

5、應(yīng)，開環(huán)分解，使堿性酒石酸銅鹽還原紫色。 e變色酸-硫酸呈色反應(yīng) 阿莫西林加變色酸-硫酸試劑混合后，因分解出甲醛與變色酸縮合而呈深褐色。 f與重氮苯磺酸呈色反應(yīng) 頭孢菌素族7位側(cè)鏈含有-C6H5-OH基團(tuán)時(shí)，能與重氮苯磺酸試液產(chǎn)生偶合反應(yīng)，顯橙黃色。 g與銅鹽呈色 頭孢氨芐加醋酸、硫酸銅、氫氧化鈉試液后，生成銅配位鹽，顯橄欖綠色。此反應(yīng)可區(qū)別于其他頭孢菌素族抗生素。a在稀鹽酸中生成白色沉淀 青霉素鉀和青霉素鈉加水溶解后，加稀鹽酸2滴，即析出難溶于水的游離體白色沉淀。此沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、氯仿、乙醚或過量的鹽酸中成鹽。b有機(jī)胺鹽的特殊反應(yīng) （i）重氮化-偶合反應(yīng)：普魯卡因青霉素水溶液酸化后，

6、生成具有芳香第一胺的普魯卡因，可發(fā)生重氮化-偶合反應(yīng)，生成紅色的偶氮化合物沉淀。3、沉淀反應(yīng)： (ii)三硝基苯酚反應(yīng)： 芐星青霉素經(jīng)氫氧化鈉堿化后，用乙醚提取，蒸去乙醚后殘?jiān)卸S基乙二胺，加稀乙醇使殘?jiān)芙?，加三硝基苯酚的飽和溶液，加熱后放冷，即析出二芐基乙二胺苦味酸鹽結(jié)晶。4、光譜法a紫外分光光度法（i）最大吸收波長(zhǎng)鑒別法 （ii）水解產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)鑒別法：先將供試品在一 定條件下水解，測(cè)定水解產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)。如 苯唑西林鈉的鑒別是利用苯唑西林鈉在弱酸性條件 下經(jīng)微量Cu2+的催化，-內(nèi)酰胺環(huán)發(fā)生分子重排， 產(chǎn)生的苯唑青霉烯酸在339nm波長(zhǎng)處有最大吸收。 b紅外光譜法 紅外吸

7、收光譜反映了分子的結(jié)構(gòu)特征。c核磁共振光譜 核磁共振光譜是利用構(gòu)成分子的原子核本身性質(zhì)的差異進(jìn)行分析的，而不是利用核外電子性質(zhì)的差異進(jìn)行的，因而專屬性很高。 5、色譜法： a. TLC b.HPLC四、雜質(zhì)檢查：1、青霉素中高分子的檢查 青霉素在臨床使用的幾十年中，常發(fā)生過敏反應(yīng)，導(dǎo)致某些患者嚴(yán)重休克，甚至死亡。國外文獻(xiàn)報(bào)道，引起青霉素過敏反應(yīng)的過敏原是青霉噻唑蛋白（penicilloyl protein）與青霉素的聚合物。青霉噻唑蛋白是青霉素分子的-內(nèi)酰胺環(huán)中的羰基與機(jī)體蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，使-內(nèi)酰胺環(huán)破裂而形成。青霉素在發(fā)酵過程中形成的青霉噻唑酸也可與蛋白質(zhì)結(jié)合生成青霉噻唑蛋白。青霉素在貯存

8、中或在水溶液中能產(chǎn)生青霉素聚合物。 研究中認(rèn)為，青霉素的過敏原除極微量的青霉噻唑蛋白外，主要是青霉噻唑多肽類雜質(zhì)。用葡聚糖凝膠G-25柱過濾，以0.1mol/L、PH=7.0的磷酸鹽緩沖液為洗脫劑，收集適當(dāng)流分，用Penamaldate法測(cè)定青霉噻唑基的濃度，以相當(dāng)青霉噻唑正丙胺的重量（g）表示每克青霉素供試品中致敏性高分子雜質(zhì)的含量。 Penamaldeta法是基于二氯化汞可與青霉噻唑衍生物形成Penamaldate衍生物，在285nm波長(zhǎng)處有吸收峰。 R 為側(cè)鏈X=OH 為青霉噻唑酸；X=NHR 為青霉噻唑酰胺（R為蛋白、多肽等）；X=OR 為青霉噻唑酯（R為多糖等）。 2、頭孢氨芐中有關(guān)

9、物質(zhì)的檢查 由于在生產(chǎn)過程中，采用a-苯甘氨酸和7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸縮合的工藝，故成品中可能引入上述兩項(xiàng)物質(zhì)和其他雜質(zhì)。中國藥典中，用薄層色譜法控制其限量。由于這些雜質(zhì)具有a-氨基酸的性質(zhì)，故可選用茚三酮為顯色劑。 3、氨芐西林鈉的檢查 本品及其注射用無菌粉末應(yīng)檢查溶液的澄清度與顏色（控制氨芐西林和有色雜質(zhì)的限量）、堿度（每1ml中含本品0.1g的溶液，pH應(yīng)為810，控制游離堿的量）、水分（費(fèi)休氏法測(cè)定，含水分不得過2.0%）、吸碘物質(zhì)（為有毒副作用的雜質(zhì)，不得過5.0%）、熱原及無菌等。五、含量測(cè)定： 青霉素族和頭孢菌素族的理化測(cè)定含量的方法文 獻(xiàn)報(bào)道比較多。中國藥典收載的方法有酸堿

10、滴定法、碘量法、汞量法、紫外分光法、高效液相色譜法等。1、碘量法 青霉素或頭孢菌素分子不消耗碘，其降解產(chǎn)物消耗碘。如青霉素經(jīng)水解生成的青霉噻唑酸可與碘作用，根據(jù)消耗的碘量計(jì)算青霉素的含量。 反應(yīng)分為兩步進(jìn)行：第一步水解反應(yīng)，生成青霉噻唑二鈉，是按化學(xué)計(jì)算量進(jìn)行；第二步青霉噻唑二鈉在酸性條件下被碘氧化，此氧化反應(yīng)受溫度、pH、時(shí)間等因素的影響，故耗碘量沒有固定的量關(guān)系。因此在實(shí)驗(yàn)過程中要嚴(yán)格控制溫度，同時(shí)采用與青霉素標(biāo)準(zhǔn)品平行對(duì)照測(cè)定，則可抵消上述可變因素的影響。 青霉素的降解產(chǎn)物等雜質(zhì)亦可消耗碘而影響測(cè)定結(jié)果，可以用未經(jīng)水解的樣品液作空白試驗(yàn)進(jìn)行校正。 第一步： 第二步：2、汞量法 青霉素不與

11、汞鹽反應(yīng)，而其堿性水解產(chǎn)物青霉噻唑酸及繼續(xù)水解生成的青霉胺都能與汞鹽定量反應(yīng)，根據(jù)消耗的汞鹽量可計(jì)算青霉素的含量。以青霉素鈉為例，青霉素分子中的氫化噻唑環(huán)含有一個(gè)硫原子，開環(huán)后形成巰基（-SH），再用汞鹽滴定巰基化合物。討論：1、本滴定只有一次突躍。但當(dāng)用汞鹽滴定青霉素的水 解液時(shí)，再滴定曲線上出現(xiàn)兩個(gè)指示點(diǎn)，即兩次突 躍。青霉素的含量計(jì)算系以第二次滴定終點(diǎn)為依據(jù)。2、水解必須完全。3、空白試驗(yàn)是為了消除供試品中可能存在的降解產(chǎn)物。4、與碘量法比較，汞量法不需要青霉素標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照。 3、酸堿滴定法： 青霉素或頭孢菌素的-內(nèi)酰胺環(huán)可被稀堿水解，如青霉素水解生成青霉噻唑酸衍生物，此水解反應(yīng)是定量完

12、成的，可用于含量測(cè)定。 苯唑西林鈉的含量測(cè)定曾采用酸堿滴定法，其原理是苯唑西林鈉在水溶液中加過量的氫氧化鈉滴定液水解，產(chǎn)生的青霉噻唑酸被中和，再以鹽酸滴定液滴定剩余的氫氧化鈉液，以氫氧化鈉滴定液的消耗量計(jì)算苯唑西林鈉的含量。四、紫外-可見分光光度法1酸水解法（銅鹽法） 青霉素族分子的-內(nèi)酰胺環(huán)無紫外吸收，而其在弱酸性下的降解產(chǎn)物青霉烯酸在320360nm處有強(qiáng)烈吸收，但此水解產(chǎn)物不穩(wěn)定，可加Cu2+，與青霉烯酸形成較穩(wěn)定的螯合物，在320nm波長(zhǎng)處有最大吸收。2、硫酸汞鹽法 青霉素族抗生素在咪唑的催化下與氯化高汞能定量反應(yīng)生成相應(yīng)的青霉烯酸硫醇汞鹽，在324345nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有最大吸收。如氯

13、唑西林鈉膠囊的含量測(cè)定。 五、高效液相色譜法： 高效液相色譜法能較好地分離供試品中可能存在的降解產(chǎn)物、未除盡的原料及中間體等雜質(zhì)而準(zhǔn)確定量。具有快速、高效、靈敏、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。各國近版藥典應(yīng)用本法測(cè)定的-內(nèi)酰胺類抗生素?cái)?shù)目越來越多。 中國藥典大量應(yīng)用了該法測(cè)定抗生素原料藥和制劑的含量。 第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素的分析 本類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)都是以堿性環(huán)已多元醇為苷元，與氨基糖縮合而成的苷，故稱為氨基糖苷類抗生素。本類抗生素主要有鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、硫酸阿米卡星、新霉素等。 一、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)：1、 鏈霉素： a.結(jié)構(gòu)：鏈霉素（streptomycin）是由鏈霉胍（streptid

14、ine）、鏈霉糖（streptose）和N-甲基-L-葡萄糖胺（N-methyl-L-glucosamine）以糖苷鍵彼此相連結(jié)合而成的苷。 b.性質(zhì)： i)溶解性： ii)水解性： iii)氧化還原性： c.鑒別試驗(yàn)： i)茚三酮反應(yīng) 本類抗生素為氨基糖苷結(jié)構(gòu)，具有羥基胺類和-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮縮合成藍(lán)紫色化合物。中國藥典采用本法鑒別硫酸核糖霉素、硫酸慶大霉素。其反應(yīng)原理如下：ii)、N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)（Elson-Morgan反應(yīng)） 本類藥物經(jīng)水解，產(chǎn)生葡萄糖胺衍生物，例鏈霉素中的N-甲基葡萄糖胺，硫酸新霉素、硫酸巴龍霉素中的D-葡萄糖胺，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物（I

15、），與對(duì)二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液（Ehrlich試劑）反應(yīng)，生成櫻桃紅色縮合物（II）。 IIIiii)、麥芽酚（Maltol）反應(yīng) 此為鏈霉素的特征反應(yīng)，鏈霉素在堿性溶液中，鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴(kuò)大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍生成麥芽酚（-甲基-羥基-吡喃酮），麥芽酚可與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。反應(yīng)原理如下 ：iv).坂口（Sakaguchi）反應(yīng) 此為鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉胍的特有反應(yīng)。本品水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍。鏈霉胍和8-羥基喹啉（或-萘酚）分別同次溴酸鈉反應(yīng)，其各自產(chǎn)物再相互作用生成橙紅色化合物。 v)硫酸鹽反應(yīng)： vi)TLC:C

16、.雜質(zhì)檢查： 鏈霉素中鏈霉素B的檢查（采用TLC) 鏈霉素B是指甘露糖鏈霉素，它是由鏈霉素分子中N-甲基葡萄糖胺的C4位上的羥基連接一個(gè)D-甘露糖組成的。鏈霉素B本身是發(fā)酵中由菌種（球形孢子放線菌）產(chǎn)生的，其生物活性僅為鏈霉素的20%25%，能被甘露糖鏈霉素B苷酶水解成甘露糖和鏈霉素。因此，如果提取、精制不徹底，鏈霉素中很可能殘存活性較低的鏈霉素B。 d.含量測(cè)定： 各國藥典仍采用微生物檢定法。2、慶大霉素：慶大霉素（gentamycin）是由絳紅糖胺 、脫 氧鏈霉胺和加洛糖胺縮合而成的苷。a.結(jié)構(gòu)： b.性質(zhì)： i)水溶性： ii)紫外吸收： c.鑒別試驗(yàn)： i) 茚三酮反應(yīng)具有氨基糖苷結(jié)構(gòu)

17、，具有羥基胺類和- 氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮縮合成藍(lán)紫色縮合物。 ii) N-甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反應(yīng) 慶大霉素經(jīng)水解，均產(chǎn)生N-甲基葡萄糖胺，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，與對(duì)二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液（Ehrlich）反應(yīng)，生成紅色縮合物。iii) UV:無紫外吸收iv)TLC:v)HPLC:vi)IR:vii)硫酸鹽反應(yīng)：d. 雜質(zhì)檢查：硫酸慶大霉素中慶大霉素C組分的測(cè)定 中國藥典采用高效液相色譜法測(cè)定慶大霉素C組分的含量，其原理是利用慶大霉素C組分結(jié)構(gòu)中氨基與鄰苯二醛、巰基醋酸在pH=10.4的硼酸鹽緩沖液中反應(yīng)，生成1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物，在

18、330nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收。 e. 含量測(cè)定： 采用微生物檢定法 第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素 四環(huán)素類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均具有氫化并四苯環(huán)，故稱為四環(huán)素類抗生素。一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)： 1、結(jié)構(gòu)：2、性質(zhì)a性狀 四環(huán)素類抗生素均為黃色結(jié)晶性粉末；無臭，味苦；有引濕性；大多數(shù)遇光色漸變深，在堿性溶液中易破壞失效；在水中溶解，在乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶。b酸堿性 分子中具有酚羥基和烯醇型羥基，顯弱酸性，同時(shí)分子中具有二甲胺基，顯弱堿，故為酸堿兩性化合物，遇酸及堿均能生成相應(yīng)的鹽，臨床多使用其鹽酸鹽。c.不穩(wěn)定性 干燥的四環(huán)素類游離堿及其鹽較穩(wěn)定，但在貯存中遇光氧化顏色變深。在酸性溶液中會(huì)發(fā)生差向異構(gòu)化反

19、應(yīng)及降解反應(yīng)；在堿性溶液中會(huì)發(fā)生降解反應(yīng)。i)差向異構(gòu)化反應(yīng)：四環(huán)素類抗生素在pH為26的溶液中，由于A環(huán)上手性碳原子C4構(gòu)型的改變，發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向異構(gòu)體即4-差向四環(huán)素。 ii)酸性條件下的降解反應(yīng)：四環(huán)素類抗生素如四環(huán)素和金霉素，在pH2的溶液中，特別是在加熱的情況下極易脫水，生成脫水四環(huán)素和脫水金霉素。這是由于C環(huán)C6上叔羥基易脫落與C5a上的氫生成水，而在C5a-C6之間形成雙鍵，導(dǎo)致C11-C11a-C12上雙鍵發(fā)生轉(zhuǎn)移，使C環(huán)發(fā)生芳構(gòu)化，使共軛雙鍵的數(shù)目增加，顏色加深，對(duì)光的吸收程度也增大。iii)堿性條件下的降解反應(yīng)： 四環(huán)素抗生素在堿性溶液中，由于氫氧根離子的作用，C6上的羥基形成氧負(fù)離子，向C11發(fā)生分子內(nèi)親核進(jìn)攻，經(jīng)電子轉(zhuǎn)移，C環(huán)破裂，生成無活性的具內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體。若在強(qiáng)堿性溶液中加熱，幾乎可以定量地轉(zhuǎn)化為異四環(huán)素，其在紫外光照射下，具強(qiáng)烈熒光。d.與金屬離子形成配位化合物 四環(huán)素類抗生素分子中具有酚羥基和烯醇基，能與許多金屬離子形成