中藥復(fù)方抗纖抑癌方和復(fù)方鱉甲軟肝片不同采血時(shí)間點(diǎn)藥物血

1、高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題，課題編號(hào)：20060026010中藥復(fù)方抗纖抑癌方和復(fù)方鱉甲軟肝片不同采血時(shí)間點(diǎn)藥物血清對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖活性的影響#趙志敏，葉永安，楊先照，甘大楠，馬賀成，劉方北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京（100700）E-mail：kilorair摘要 目的 研究人來源不同采血時(shí)間點(diǎn)中藥藥物血清對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響。方法 HepG2人肝癌細(xì)胞體外培養(yǎng)，健康志愿者3名，服用中藥復(fù)方抗纖抑癌方（KX）和中成藥復(fù)方鱉甲軟肝片（BJ）后不同時(shí)間點(diǎn)收集血清，采用MTT法檢測各組藥物血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 1、1小時(shí)、2小時(shí)與MEM對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)

2、組藥物血清對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用（P0.01）；KX1小時(shí)20%濃度抑制效果優(yōu)于KX2小時(shí)同濃度（P0.01）；KX1小時(shí)5%濃度與BJ1小時(shí)同濃度有差異（P0.05）；BJ2小時(shí)20%、10%濃度均較KX2小時(shí)抑制作用強(qiáng)（P0.05）。2、增加0.5小時(shí)抽血時(shí)間點(diǎn)，KX 0.5小時(shí)優(yōu)于KX 2小時(shí)（P0.05）。3、與空白血清組比較，KX0.5小時(shí)40%濃度時(shí)抑制效果明顯（P0.05）。結(jié)論 兩種藥物血清對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞均有增殖抑制作用；在同一采血時(shí)間點(diǎn)和不同時(shí)間點(diǎn)上，兩種藥物血清的抑制效果比較均存在差異。關(guān)鍵詞 藥物血清，采血時(shí)間點(diǎn)，HepG2細(xì)胞 Influe

3、nce of Kangxian yiai decoction and Fufang Biejia Ruangan Tablets on HepG2 cells on different blood sampling spotsZhimin Zhao, Yongan Ye, Xianzhao Yang, Danan Gan, Hecheng Ma, Fang Liu (Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing PRC 100700)AbstractObjective: To explore the inf

4、luence of different kinds of human-derived chinese medicine sera on proliferation of HepG2 cells on different blood sampling spots. Methods: HepG2 cells were cultured in vitro. The sera of 3 volunteers were collected before taking medicine as the control group, twice after taken medicine(Kangxian yi

5、ai decoction and Fufang Biejia Ruangan Tablets) 1 hour later and 2 hours again as the test group, MTT colorimetric assay was used to observe the influence on proliferation of HepG2 cells after incubate with different kinds of drugs containing serum. Results: 1 It showed that The inhibited proliferat

6、ion in test groups were better than that of control group（P0.01）. The inhibited proliferation of the concentration 20% of KX were better after 1hour than that of 2hours, and the difference had statistical significance. Compared with 5% KX group on the 1-hour blood sampling spot, the inhibited prolif

7、eration of the concentration 5% of BJ were better, and the difference had statistical significance(P0.05).While on the 2-hour blood sampling spot, the inhibited proliferation of different concentration of BJ were better than that of KX, the differences in BJ groups of 20% and 10% concentration had s

8、tatistical significance (P0.05). 2 In KX groups, the inhibited proliferation of different concentrations on HepG2 cells were better on the half-an-hour blood sampling spot than 2hour, and the difference had statistical significance (P0.05). 3 The inhibited proliferation of 40% concentration on the h

9、alf-an-hour blood sampling spot in KX group were better than that in control group, and the difference had statistical significance (P0.05).Conclusion: Both the two kinds of chinese herbal compound sera can inhibit the proliferation of HepG2 cells. The inhibited proliferation of different concentrat

10、ions on HepG2 cells were better on the half-an-hour blood sampling spot than 2 hour. It showed the trend that the inhibitory effects of the sera in BJ group on 2-hour blood sampling spot were better than 1 hour. The inhibitory effects of the two kinds of sera on different blood sampling spots or on

11、the same spot were different. Key Words: medicine serum; blood sampling spots; HepG2 cell line.0 引言藥物血清因其方法學(xué)上的特點(diǎn)而使其在中醫(yī)學(xué)的研究中具有一定的優(yōu)勢1，也是中醫(yī)藥研究的重要手段。目前研究采用人來源的藥物血清日益增多，但是中藥多是復(fù)方，成份復(fù)雜多樣，多數(shù)中藥人體藥物代謝動(dòng)力學(xué)不明，在不同時(shí)間點(diǎn)收集到的藥物血清作用效果可能會(huì)存在差異。本實(shí)驗(yàn)我們選取葉永安教授臨床治療原發(fā)性肝癌較為有效的方劑復(fù)方抗纖抑癌方與中成藥復(fù)方鱉甲軟肝片制備人來源藥物血清，采用MTT法檢測不同抽血時(shí)間點(diǎn)、不同藥物的藥

12、物血清對(duì)HepG2細(xì)胞增殖是否存在差異。1 材料和方法1.1 材料人藥物血清取自3名健康志愿者，男性，年齡2532歲之間，了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟⒑炗喼橥鈺?，服藥前后各檢查血尿便常規(guī)、肝腎功、心電圖一次。藥品：復(fù)方抗纖抑癌方：柴胡、黃芪、山藥等。飲片購自東直門醫(yī)院中藥房。復(fù)方鱉甲軟肝片：內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z19991011，0.5g/片，批號(hào)：20090322；細(xì)胞：HepG2人肝癌細(xì)胞，購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，常規(guī)復(fù)蘇、傳代后，在37，5CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)待用。試劑：噻唑蘭（Sigma）購自北京優(yōu)博奧生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購

13、自sigma公司；MEM培養(yǎng)基干粉購自GIBCO公司；胎牛血清購自HyClone公司；胰蛋白酶購自Solarbio。實(shí)驗(yàn)于北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。1.2 方法1.2.1 含藥血清制備志愿者在服藥前空腹抽血一次，制備服藥前空白對(duì)照血清；在服用復(fù)方抗纖抑癌方3天后，第4天晨起空腹服藥后0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)各抽血一次，制備復(fù)方抗纖抑癌方藥物血清；在服用復(fù)方鱉甲軟肝片3天后，第4天晨起空腹服藥后1小時(shí)、2小時(shí)抽血，每次8ml，室溫靜置半小時(shí)，離心分離血清（4000rmp,20min），56，30min滅活，分裝，于-70保存?zhèn)溆?。服用兩種藥物之間間隔1周作為洗脫期。1.2.2 分

14、組 我們先將1小時(shí)、2小時(shí)采集的復(fù)方抗纖抑癌方和復(fù)方鱉甲軟肝片藥物血清用無血清MEM培養(yǎng)基配成20%、10%、5%共3個(gè)濃度，同時(shí)設(shè)無血清MEM組為對(duì)照組，觀察不同抽血時(shí)間點(diǎn)藥物血清作用下的HepG2肝癌細(xì)胞生長狀態(tài)。之后追加0.5小時(shí)采集的復(fù)方抗纖抑癌方藥物血清與其自身1小時(shí)、2小時(shí)采血點(diǎn)比較，藥物血清用無血清MEM培養(yǎng)基配成20%、10%、5%共3個(gè)濃度，同時(shí)設(shè)無血清MEM組為對(duì)照組。最后將0.5小時(shí)采集的復(fù)方抗纖抑癌方藥物血清、2小時(shí)采集的復(fù)方鱉甲軟肝片藥物血清與服藥前空白對(duì)照組血清進(jìn)行比較，三種血清用無血清MEM培養(yǎng)基配成40%、20%、10%共3個(gè)濃度。1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞

15、HepG2培養(yǎng)于10%胎牛血清MEM培養(yǎng)液中，37，5CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，4-5天傳代，待細(xì)胞接近長滿時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代。1.2.4 志愿者藥物血清對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1105ml-，接種于96孔板上，每孔100l。24h后將原培養(yǎng)液吸棄，換無血清MEM培養(yǎng)液，每孔100l，繼續(xù)孵育。24h后將培養(yǎng)液吸棄，復(fù)方鱉甲軟肝片組和抗纖抑癌方組分別加入含不同濃度藥物血清的條件培養(yǎng)基，每孔100l。另設(shè)無血清MEM組（或服藥前空白血清組）為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24h后，將原培養(yǎng)液吸棄，換無血清MEM培養(yǎng)液

16、，每孔100l，再加入5mg/ml MTT每孔20l，孵育4小時(shí)，棄上清，每孔加DMSO 150l，震蕩5min，充分溶解沉淀后，于酶聯(lián)免疫檢測儀492nm處檢測吸光度數(shù)值（OD值）。1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理。數(shù)據(jù)用Xs表示，計(jì)量資料的多組比較采用方差分析。2 結(jié)果2.1 1小時(shí)、2小時(shí)KX對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響（表1） KX各組與MEM組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明無論1小時(shí)還是2小時(shí)抽血，KX各組對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。整體來看，KX 1小時(shí)各血清濃度對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制效果強(qiáng)于2小時(shí)，其中KX1小時(shí)20%濃度時(shí)，抑制

17、效果明顯優(yōu)于KX2小時(shí)20%濃度，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1 不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度KX對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響組別血清濃度（%）OD值MEM00.5100.05 KX 1小時(shí)200.3440.03 *100.2960.02 *50.2530.03*KX 2小時(shí)200.3860.02*100.3210.03*50.2870.04*注：n=6；與MEM組比較，*P0.01；與KX 1小時(shí)20%濃度比較，P0.052.2 1小時(shí)、2小時(shí)復(fù)方鱉甲軟肝片藥物血清（BJ）對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響（表2） BJ各組與MEM組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明無論1小時(shí)還是2小時(shí)抽血，BJ各組對(duì)Hep

18、G2肝癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。從數(shù)值上來看，存在BJ 2小時(shí)各血清濃度對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制效果高于1小時(shí)的趨勢。表2 不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度BJ對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響組別血清濃度（%）OD值MEM00.4540.03BJ 1小時(shí)200.3280.02*100.3180.02*50.3040.03*BJ 2小時(shí)200.2970.03*100.2640.04*50.2590.06*注：n=6；與MEM組比較，*P0.012.3 服藥后1小時(shí)采血，兩種藥物血清對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響（表3） 各治療組與MEM組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩種藥物血清對(duì)HepG2

19、肝癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。服藥后1小時(shí)，KX在10%、5%濃度較BJ抑制作用強(qiáng)，其中5%濃度時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表3 服藥后1小時(shí)KX、BJ對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響組別血清濃度（%）OD值MEM00.4820.05KX 1小時(shí)200.3440.03 *100.2960.02 *50.2530.03 *BJ 1小時(shí)200.3280.02 *100.3180.02 *50.3040.03 *注：n=6；與MEM組比較，*P0.01；與BJ 5%濃度比較，P0.052.4 服藥后2小時(shí)采血，兩種藥物血清對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響（表4） 各治療組與MEM組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

20、，說明兩種藥物血清對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。服藥后2小時(shí)，BJ在3個(gè)濃度點(diǎn)上均較KX抑制作用強(qiáng)，其中20%、10%濃度時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表4 服藥后2小時(shí)KX、BJ對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響組別血清濃度（%）OD值MEM00.4820.05KX 2小時(shí)200.3860.02 *100.3210.03 *50.2870.04 *BJ 2小時(shí)200.2970.03*100.2640.04 *50.2590.06 *注：n=6；與MEM組比較，*P0.01；與同濃度KX比較，P0.052.5 增加0.5小時(shí)抽血時(shí)間點(diǎn)后KX對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響（表5） KX各

21、組與MEM組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明KX各組對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。KX 0.5小時(shí)各濃度對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制效果均明顯高于2小時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表5 不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度KX對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響組別血清濃度（%）OD值MEM00.5460.05KX 0.5小時(shí)200.3240.05*100.2720.03*50.2440.04*KX 1小時(shí)200.3420.03*100.2810.03*50.2580.03*KX 2小時(shí)200.3700.03*100.3070.03*50.2820.03*注：n=9；與MEM組比較，*P0.01；與KX 2小時(shí)相同

22、濃度組比較，P0.052.6 0.5小時(shí)的KX與2小時(shí)的BJ對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響（表6） 整體來看，KX 0.5小時(shí)各血清濃度對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制效果強(qiáng)于BJ2小時(shí)，其中KX0.5小時(shí)40%濃度時(shí)抑制效果明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BJ各組與同濃度服藥前比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表6 0.5小時(shí)的KX與2小時(shí)的BJ對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響（作用48小時(shí)）組別血清濃度（%）OD值服藥前400.7490.16200.6900.13100.6230.13BJ 2小時(shí)400.6430.23200.6320.21100.6070.16KX 0.5小時(shí)400.5270.19*200.

23、5410.17100.5220.17注：n=9；與同濃度服藥前組比較，*P0.05。3 討論藥物血清一直以來都是體外研究的重要手段之一，既往藥物血清主要來源于動(dòng)物，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥物血清的采血時(shí)間點(diǎn)也有專門的研究2。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，研究者逐漸意識(shí)到實(shí)驗(yàn)用材料的種屬問題3，它包括兩個(gè)層面的意義：一、種屬一致 應(yīng)該使用同種動(dòng)物的藥物血清作用于同種動(dòng)物的細(xì)胞，避免與實(shí)驗(yàn)不相關(guān)的因素干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果；二、種屬相近 目前體外實(shí)驗(yàn)多采用人來源的細(xì)胞，即應(yīng)當(dāng)采用最接近人體的實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能夠最大限度的接近實(shí)際。但藥物血清多數(shù)還是來源于動(dòng)物，在人的細(xì)胞上添加動(dòng)物血清作為刺激因素，存在不合理性。也有報(bào)道采集人血清進(jìn)行藥物血清實(shí)驗(yàn)，但也存在一定的問題，多數(shù)中藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)不明，統(tǒng)一的采血時(shí)間點(diǎn)不能