腫瘤血管生成的分子機(jī)制及常用研究方法

1、腫瘤血管生成的分子機(jī)制及常用研究方法 腫瘤血管生成的分子機(jī)制及常用研究方法主要內(nèi)容:第一節(jié) 腫瘤血管生成的基本過(guò)程第二節(jié) 腫瘤微血管形態(tài)和生物學(xué)特性第三節(jié) 腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制第四節(jié) 抗血管生成療法在腫瘤治療中的應(yīng)用第五節(jié) 腫瘤血管生成常用研究方法 人體腫瘤大部分為實(shí)體瘤。實(shí)體瘤瘤組織由瘤細(xì)胞和間質(zhì)構(gòu)成，后者主要包括血管、淋巴管、結(jié)締組織、炎細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等成分。其中血管和結(jié)締組織起營(yíng)養(yǎng)、支持瘤細(xì)胞的作用。 腫瘤內(nèi)的新生血管和淋巴管分別通過(guò)血管生成(angiogenesis)和淋巴管生成(1ymphangiogenesis)實(shí)現(xiàn)的，并在腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散(侵襲和轉(zhuǎn)移)中起重要作用。 已有研究

2、證明，腫瘤血管生成活躍程度對(duì)組織病理分級(jí)、放射治療以及在預(yù)后判斷上都有重要的評(píng)估價(jià)值。 第一節(jié) 腫瘤血管生成的基本過(guò)程一、血管生成現(xiàn)象 1945年Algire提出了“腫瘤血管生成(tumor angiogenesis)”或“血管新生化(neovasclarzation)”概念。對(duì)血管生成重要性的認(rèn)識(shí)，特別是提出“腫瘤生長(zhǎng)依賴于血管生成”觀點(diǎn)，始于1971年Folkman對(duì)腫瘤血管生成的研究報(bào)道。 血管生成是指活體組織在已存在的微血管床上芽生出新的以毛細(xì)血管為主的血管系統(tǒng)的過(guò)程。有別于胚胎時(shí)期由早期內(nèi)皮細(xì)胞分化形成新血管的過(guò)程即血管形成(vasculogenesis) 。二腫瘤血管生成的基本過(guò)程

3、(一)血管生成的基本步驟：血管生成因子的產(chǎn)生過(guò)多使之與抑制因子失衡，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞激活，產(chǎn)生血管生成表型；血管部位細(xì)胞外基質(zhì)改變、基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞芽生、增殖和遷移；新生內(nèi)皮細(xì)胞索形成管狀毛細(xì)血管襻及管腔；新生血管管腔的貫通。(二)腫瘤血管生成的過(guò)程1腫瘤生長(zhǎng)的階段性 無(wú)血管期(avascular phase)或稱(chēng)血管前期(prevascular phase) 腫瘤直徑不超過(guò)12mm 血管期(vascular phase) 腫瘤迅速生長(zhǎng)并發(fā)生轉(zhuǎn)移 2.腫瘤血管的起源 腫瘤中的血管可能有3種來(lái)源：血管生成:以兩種方式發(fā)生,一是腫瘤細(xì)胞團(tuán)先處于無(wú)血管期生長(zhǎng)，后因缺氧而產(chǎn)生大量血管生成因子，從而誘導(dǎo)

4、血管生成；另一種是瘤細(xì)胞先依賴宿主組織已存在的血管生長(zhǎng)，繼而出現(xiàn)瘤內(nèi)血管消退，然后再因缺氧誘導(dǎo)血管生成因子作用而發(fā)生血管生成。 血管套疊性生長(zhǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endot helial progenitor cell ,EPC) EPC 為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,參與胚胎的血管生成,也稱(chēng)為成血管細(xì)胞。EPC 主要來(lái)源于骨髓, 表達(dá)CD133 、CD34和VEGFR2。3腫瘤血管生成的過(guò)程 瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞血管生成因子(VEGF) 等小血管或毛細(xì)血管伸展內(nèi)皮細(xì)胞遷移形成毛細(xì)血管芽新生毛細(xì)血管形成并連通。 第二節(jié) 腫瘤微血管形態(tài)和生物學(xué)特性 腫瘤微血管不僅在形態(tài)上不同于正常血管，而且在生物學(xué)功能上也有其

5、特殊性。一腫瘤微血管形態(tài)表現(xiàn) 腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個(gè)腫瘤組織，但分布上并不均一。血管生成最活躍、微血管密度最高的區(qū)域被稱(chēng)為所謂“血管熱點(diǎn)區(qū)”(hot spots)，這也是進(jìn)行腫瘤微血管密度測(cè)定的選擇區(qū)域。很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長(zhǎng)活躍的邊緣。 腫瘤的新生血管分布上常常無(wú)規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，表現(xiàn)為狹窄、擴(kuò)張或扭曲。新生血管呈血竇狀、條索狀，管壁薄，甚至僅有一層內(nèi)皮細(xì)胞；或管壁很厚，但結(jié)構(gòu)上仍然不完善。內(nèi)皮細(xì)胞比較幼稚，細(xì)胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時(shí)血管外的腫瘤細(xì)胞可直接與血管管腔相連。 腫瘤血管的結(jié)構(gòu)缺陷是這些血管具有高通透性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是腫瘤轉(zhuǎn)移途徑之一。

6、不同類(lèi)型腫瘤間質(zhì)血管沒(méi)有本質(zhì)區(qū)別，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同。 生長(zhǎng)活躍的惡性腫瘤常富于血管。如內(nèi)分泌腫瘤、腎癌、骨肉瘤、絨毛膜癌、破骨細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌等。 不同腫瘤血管的形態(tài)又有一定的差異，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中新生血管不僅豐富，而且內(nèi)皮細(xì)胞呈不同程度的增生、肥大；絨毛膜癌、肝細(xì)胞癌等血管呈壁薄、明顯擴(kuò)張的血竇?？傊?，腫瘤微血管形態(tài)特點(diǎn)是：遍布整個(gè)腫瘤組織，但分布不均一，無(wú)規(guī)律，分支紊亂；管腔不規(guī)則，結(jié)構(gòu)上不完善；內(nèi)皮細(xì)胞比較幼稚，細(xì)胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時(shí)血管外的腫瘤細(xì)胞可直接與血管管腔相連。 腫瘤血管的結(jié)構(gòu)缺陷是其具有高通透性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是腫瘤轉(zhuǎn)移途徑之一。二、腫瘤微血管

7、的生物學(xué)特性 低反應(yīng)性 高通透性 低供氧能力 第三節(jié) 腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制一、血管生成因子 (一)VEGF及其受體家族 (二) 細(xì)胞外基質(zhì)與基質(zhì)金屬蛋白酶 (三) Ets家族成員 (四) 纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族及其受體 (五) 血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF) （六）其它血管生成因子二. 血管生成抑制因子（一）大分子蛋白前體酶解片段 (二)細(xì)胞因子（三）絲氨酸蛋白酶抑制劑（四）組織金屬蛋白酶抑制劑（五）抑癌基因 腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenic factors)和血管生成抑制物(angiogenesis inhibitors)的調(diào)控。腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞

8、和巨噬細(xì)胞受缺氧刺激等使局部微環(huán)境發(fā)生變化的因素作用而合成和釋放大量血管生成因子從不同環(huán)節(jié)促進(jìn)血管生成。組織中同時(shí)也存在內(nèi)源性血管生成抑制因子，對(duì)血管生成起抑制作用。 一、血管生成因子 血管生成的始動(dòng)需要血管生成因子。一系列血管生成因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子及其抑制物，以及代謝性和機(jī)械性因子均參與了血管生成過(guò)程。(一)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其受體家族 1血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）又稱(chēng)血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF)，為分子量34-4

9、5kD的同源二聚體糖蛋白。 VEGF基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平的剪切，可產(chǎn)生5種變異體，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和VEGFl21，分別由206、189、165、145和121個(gè)氨基酸組成。其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均為可溶性分泌蛋白，擴(kuò)散力強(qiáng)，易于到達(dá)靶細(xì)胞。近年又發(fā)現(xiàn)其他一些與VEGF功能相似、結(jié)構(gòu)上有一定同源性的多肽因子，包括胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placentor growth factor，PIGF)，VEGF-B(VEGF相關(guān)因子，VEGF-related factor，VRF)，VEGF-C(VEGF相關(guān)蛋白，VEGF-relat

10、ed protein，VRP)，以及VEGF-DFIGF和VEGF-E等成員，它們共同構(gòu)成VEGF家族。 VEGF主要由血管周?chē)募?xì)胞產(chǎn)生，并通過(guò)旁分泌機(jī)制作用于內(nèi)皮細(xì)胞，在促進(jìn)血管形成、抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及提高血管通透性等方面發(fā)揮重要作用。2VEGF受體類(lèi)型：VEGF只有與其特異性受體結(jié)合后才能發(fā)揮生物學(xué)功能。目前，已鑒定并克隆出3種受體，即VEGF受體l (VEGFR-1，又稱(chēng)flt-1)、VEGF受體2 (VEGFR-2，又稱(chēng)flk-1或KDR)及VEGF受體3 (VEGFR-3又稱(chēng)flt-4), 均屬酪氨酸激酶受體，稱(chēng)為Flt家族。前兩種受體一般只表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，但偶爾在其它類(lèi)

11、型細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)；Flt-4在胎兒早期靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞上呈一過(guò)性表達(dá),胎兒后期和出生后的內(nèi)皮細(xì)胞則不再表達(dá)；在成人Flt-4只在淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。由于Flt家族基因的表達(dá)部位不同，其配體的結(jié)合部位也不同。 早期血管的形成需要VEGF的調(diào)節(jié)，它們與內(nèi)皮細(xì)胞上相應(yīng)的酪氨酸激酶受體結(jié)合，引起內(nèi)皮細(xì)胞分裂和分化，并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。 在胚胎發(fā)育過(guò)程中，VEGF(主要是VEGF-A)通過(guò)其受體VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1KDR)促進(jìn)內(nèi)皮分化、增殖、遷移和原始血管形成。 由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結(jié)構(gòu)需要VEGFR-1的表達(dá)和激活，而VEGFR-3的表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞

12、形成靜脈或淋巴管有關(guān)。 VEGF不僅是內(nèi)皮細(xì)胞特異的強(qiáng)效有絲分裂原，而且能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并調(diào)節(jié)纖溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中發(fā)揮重要作用。 VEGF在幾乎所有的人體腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中皆有過(guò)表達(dá)。VEGF及其受體在腫瘤中的表達(dá)常與腫瘤分化程度密切相關(guān)。大多數(shù)實(shí)體瘤VEGF基因均有過(guò)表達(dá)，VEGF165 、VEGF121兩種VEGF最常見(jiàn)。 在VEGF家族中，VEGF-C和VEG-D既可誘導(dǎo)血管生成，又可誘導(dǎo)淋巴管生成。已有研究報(bào)道，人體多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)VEGF-C。體內(nèi)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)也證實(shí)，腫瘤細(xì)胞VEGF-C的高表達(dá)能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤組織淋巴管生成。 腫瘤組織中

13、的VEGF-C和VEGF-D還來(lái)源于浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞。 缺氧是許多細(xì)胞系產(chǎn)生VEGF的一個(gè)強(qiáng)烈的誘導(dǎo)因子。 離體條件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表達(dá)的誘因。VEGF在腫瘤壞死灶周邊常呈強(qiáng)表達(dá)。 腫瘤中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)水平常與VEGF呈正相關(guān)，NO與VEGF之間具有相互調(diào)節(jié)作用。 多種癌基因的激活通過(guò)上調(diào)VEGF表達(dá)而誘導(dǎo)血管生成，失活的抑癌基因(如突變型p53基因)也參與了VEGF介導(dǎo)的血管生成過(guò)程。 (二) 細(xì)胞外基質(zhì)與基質(zhì)金屬蛋白酶細(xì)胞外基質(zhì)：人體各種組織均由細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)構(gòu)成支架，根據(jù)其分布部位、組成成分及功能的不同可將其分

14、為基膜(BM)和間質(zhì)結(jié)締組織兩大類(lèi)。 ECM成分由4大家族組成：膠原蛋白、蛋白多糖、彈性蛋白、ECM糖蛋白。目前發(fā)現(xiàn)ECM糖蛋白有10余種，如層粘連蛋白、纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等。其中FN主要分布于皮膚、肌腱、血管壁和骨基質(zhì)等組織。 多數(shù)ECM糖蛋白具有粘附功能，這種功能的發(fā)揮與其分子內(nèi)部含有的某些特殊的蛋白片段有關(guān)，通過(guò)這些片段，ECM糖蛋白就可以與細(xì)胞及ECM其它成分結(jié)合，參與細(xì)胞的粘附、遷移、生長(zhǎng)和分化。2. 基質(zhì)金屬蛋白酶的家族成員：隨著現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的飛速發(fā)展，大量的MMPs被發(fā)現(xiàn)、分離、純化及測(cè)序。它們廣泛地分布于動(dòng)植物界，幾乎能降解所有生物體

15、內(nèi)的ECM成分。到目前為止，MMPs家族至少包含20種酶，而且其新成員仍在繼續(xù)增加。3. 基質(zhì)金屬蛋白酶的促新血管形成作用：電鏡觀察顯示，新的毛細(xì)血管?chē)森h(huán)狀及新合成的細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積、鋪墊后，血管環(huán)前端新合成的BM就開(kāi)始了MMPs所介導(dǎo)的蛋白水解過(guò)程，內(nèi)皮細(xì)胞遷移將始于局部水解，形成一個(gè)新的毛細(xì)血管芽，隨后又經(jīng)歷了一系列細(xì)胞外蛋白水解酶的活化與抑制的動(dòng)態(tài)循環(huán)。體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于BM樣物質(zhì)上時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞很快排成直線，圍成管狀，編織成血管網(wǎng)。在不同癌組織中的表達(dá)：人類(lèi)癌組織種類(lèi)繁多，研究癌細(xì)胞所產(chǎn)生的各種MMPs分子的特點(diǎn)及其在各種癌組織中的分布情況，對(duì)了解癌的浸潤(rùn)和

16、轉(zhuǎn)移過(guò)程有重要意義。已有資料表明，不同種類(lèi)的癌細(xì)胞所表達(dá)的MMPs分子種類(lèi)和表達(dá)量也不相同。例如:乳腺癌:MMP-7，-8及-13表達(dá)量明顯高于正常乳腺組織。5. MMPs激活與癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移：多數(shù)癌組織中潛在型MMP-2的激活程度是癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。因此檢測(cè)癌組織內(nèi)MMP-2活化酶MT-MMP對(duì)癌的治療具有重要意義。 (三) Ets家族成員 Ets原癌基因于1983年分別在不同的實(shí)驗(yàn)室中分離成功。迄今發(fā)現(xiàn)至少有Ets-1、Ets-2等11種Ets基因家族成員。Ets-1與新血管形成：血管周?chē)さ姆纸夂蛢?nèi)皮細(xì)胞本身的遷移力是血管生成的兩個(gè)關(guān)鍵因素。前者主要與MMPl有關(guān)，后者則主要與Et

17、s-1有關(guān)。 已發(fā)現(xiàn)的4種典型的血管生長(zhǎng)因子aFGF、bFGF、VEGF及EGF都能調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)、ECV-304細(xì)胞以及人網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的ets-1 mRNA的表達(dá)。上述培養(yǎng)的細(xì)胞當(dāng)受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，2 小時(shí)后其ets-l mRNA的表達(dá)呈最高值，12小時(shí)后又恢復(fù)到原來(lái)水平。 如用VEGF刺激培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，其DNA-Ets復(fù)合物明顯增多；而用VEGF和GGAA(Ets功能域的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，control competior)，同時(shí)刺激培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，DNA-Ets復(fù)合物的量則明顯減少。 血管生長(zhǎng)因子作用于內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞Ets-1 mRNA的表

18、達(dá)，而且其作用受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。(四) 纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族及其受體 目前研究最為深入的是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)，兩者在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的。 bFGF是一種廣泛存在于人體各組織中的生物活性物質(zhì)，被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等生長(zhǎng)的刺激物。 bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生長(zhǎng)因子之一，如腦、心、肝、胎盤(pán)和白細(xì)胞等均有存在。bFGF除分布于細(xì)胞內(nèi)，還分布于許多細(xì)胞的胞膜及胞外基質(zhì)中。它也可在不同腫瘤中表達(dá)，包括膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胃腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌和甲狀腺癌等許多培養(yǎng)的細(xì)胞系都可以合成它。其功能具有多樣性，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的

19、有絲分裂、趨化性和遷移，刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶降解基底膜，誘導(dǎo)來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞的增殖和分化。bFGF也表現(xiàn)出親神經(jīng)性行為，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化。 bFGF和aFGF均與肝素有很強(qiáng)的親和力，研究表明這種高親和力對(duì)于FGF與細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合是非常重要的。 bFGF的生物學(xué)作用是通過(guò)與其特異性的細(xì)胞表面受體FGF受體(FGFreceptors，F(xiàn)GFR)結(jié)合而介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。已經(jīng)識(shí)別4種FGFR，包括FGFR-1(flg)、FGFR-2(bek)、FGFR-3和FGFR-4。FGFR-1在bFGFFGFR系統(tǒng)中的作用最大。正常腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中FGFR-1的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，即組織

20、中有些細(xì)胞呈現(xiàn)FGFR-1陽(yáng)性，有些則顯示陰性；血管內(nèi)皮細(xì)胞亦是如此。 (五) 血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PDGF) 血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的肽類(lèi)生長(zhǎng)因子。由于其在組織修復(fù)、胚胎發(fā)育、免疫及多種常見(jiàn)疾病的愈復(fù)中起著重要作用。 除血小板外，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤(pán)和胚胎細(xì)胞、系膜細(xì)胞及某些腫瘤細(xì)胞均可產(chǎn)生和釋放PDGF。纖維母細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞均存在PDGF受體。PDGF與細(xì)胞膜上的專(zhuān)一受體結(jié)合后可誘發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，主要表現(xiàn)在3方面：促進(jìn)細(xì)胞的有

21、絲分裂：PDGF能刺激多種細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等的分裂、增殖；趨化性：PDGF對(duì)纖維母細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞有趨化性，受體介導(dǎo)趨化反應(yīng)，而受體則抑制趨化反應(yīng)；血管收縮效應(yīng)：PDGF收縮大鼠主動(dòng)脈的作用較經(jīng)典的血管緊張素II更強(qiáng)烈。此外，PDGF通過(guò)影響骨骼肌中細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜的相互作用而致細(xì)胞骨架重排，還參與胚胎的發(fā)育和生長(zhǎng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程。（六）其它血管生成因子舒血管素 (Angiotropin)、血管新生素（Angiogenin）表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等也能刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。 此外，缺氧是腫瘤和非腫瘤性疾病血管生成的重要刺激因素。缺氧誘導(dǎo)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因

22、子包括缺氧誘導(dǎo)因子-1、-2(hypoxia inducing factor-l，-2，HIF-1HIF-2)和NF-B,其中以HIF-l在血管生成中的作用最為重要。 血管生成因子特異性作用因子VEGF家族、血管生成素非特異性作用因子FGF家族、HGF、PDGF、EGF、IL-8、TNF、TGF、HIF-1、癌基因基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、MMP-14二. 血管生成抑制因子 體內(nèi)存在內(nèi)源性的血管生成抑制因子，它們通過(guò)影響血管生成過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮抗血管生成的活性。血管生成抑制因子大致可分為7類(lèi)：大分子蛋白前體酶解片段、細(xì)胞因子、絲氨酸蛋白酶抑制劑、含TSP I型重復(fù)模序的血管生成抑

23、制因子、組織金屬蛋白酶抑制劑、抑癌基因及其它血管生成抑制因子。（一）大分子蛋白前體酶解片段這些大分子蛋白前體分別來(lái)源于血漿(如纖溶酶原、抗凝血酶)和胞外基質(zhì)(如膠原蛋白、基底膜蛋白多糖、纖連蛋白)。1.纖溶酶原酶解片段血管生成抑制素 血管生成抑制素(angiostatin)是最先發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性血管生成抑制因子之一，它是纖溶酶原的蛋白酶解產(chǎn)物，最初在Lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分離得到。 血管生成抑制素特異作用于內(nèi)皮細(xì)胞，它可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，它通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合發(fā)揮作用。 已發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制素受體：ATP合成酶的/、angiomotion和整體聯(lián)蛋白53

24、。2. 抗血管生成性抗凝血酶(antiangiogenic antithrombin ，aaAT) 研究表明aaAT是切除了羧基端環(huán)的抗凝血酶。aaAT可特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而不作用于其它正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。aaAT對(duì)血管生成的抑制作用有劑量依賴性。3. 內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(endostatin) 它可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 內(nèi)皮細(xì)胞抑制素主要的抗血管生成活性是通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)現(xiàn)的：它可與內(nèi)皮細(xì)胞表面的51整聯(lián)蛋白結(jié)合，抑制FAK的激活,進(jìn)一步影響其下游ERKlp38 MAPK的活化，從而抑制細(xì)胞的遷移、影響細(xì)胞的存活。 內(nèi)皮細(xì)胞抑制素還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

25、。(二)細(xì)胞因子 IFN-、IFN-、IFN-和IL-12、IL-18是具有多種功能的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤有直接的抑制作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)它們也可以通過(guò)間接的作用方式抑制血管的生成，來(lái)達(dá)到抗腫瘤的目的。它們可以通過(guò)下調(diào)VEGF和FGF等生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平來(lái)發(fā)揮抑制血管生成的活性。白細(xì)胞介素-12(IL-12)則是通過(guò)提高IFN-的表達(dá)水平，引致IP-10水平增高來(lái)發(fā)揮其抗血管生成的功能。（三）絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine protease inhibitor，Serpin) 絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族是由一系列具同源性的蛋白質(zhì)組成的蛋白質(zhì)家族。某些Serpin家族成員有抑制血管生成的活性

26、，這些成員包括PEDF(pigment epithelium-derived factor)、maspin、血管緊張素原等。 PEDF是眼內(nèi)最重要的血管生成抑制因子。它抑制血管生成的作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，它特異性作用于激活的內(nèi)皮細(xì)胞，而不會(huì)影響靜止的內(nèi)皮細(xì)胞。（四）組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of MMP，TIMP) TIMP是體內(nèi)天然存在的金屬蛋白酶抑制物，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP在兩個(gè)階段對(duì)MMP的活性進(jìn)行抑制。一是在MMP酶原活化階段，TIMP與MMP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制其自我活化；二是在MMP活化

27、之后，與其按照1：1的比例結(jié)合，對(duì)其活性進(jìn)行抑制。（五）抑癌基因(Tumor suppressor gene) p53突變是腫瘤中最常見(jiàn)的基因突變。p53基因編碼的產(chǎn)物P53蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出多種生物學(xué)功能，其中之一是抑制血管生成。P53的靶基因中包括多種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的基因，它通過(guò)激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。P53還通過(guò)影響血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF的水平抑制血管生成。 VHL綜合征(von Hippel-Lindau disease)是一種以多個(gè)器官發(fā)生腫瘤為特征的遺傳性疾病，它的致病原因是VHL抑癌基因的種系

28、突變。與VHL綜合征相關(guān)的腫瘤，如視網(wǎng)膜血管瘤、小腦血管瘤、脊柱血管瘤等都是高度血管化的腫瘤。靶向阻斷小鼠肝臟的VHL基因，會(huì)導(dǎo)致小鼠肝實(shí)質(zhì)血管化程度加強(qiáng)。這些現(xiàn)象提示我們，VHL可能有抑制血管生成的作用。 研究發(fā)現(xiàn)PTEN可以下調(diào)血管生成因子VEGF的表達(dá)，這一結(jié)果說(shuō)明PTEN有抑制血管生成的作用。第四節(jié) 抗血管生成療法在腫瘤治療中的應(yīng)用 血管生成是腫瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性炎癥等血管增生性疾病的重要病理特征，抑制血管的生成對(duì)這些疾病的治療有重要的意義。 Fo1kman在1971年提出血管生成與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以通過(guò)抑制腫瘤的血管生成達(dá)到治療腫瘤的目

29、的。在腫瘤生長(zhǎng)的最初階段，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)擴(kuò)散的方式吸收營(yíng)養(yǎng)。 但腫瘤的體積達(dá)到2-3mm3時(shí)，由于缺乏足夠的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，其生長(zhǎng)受到限制，此時(shí)腫瘤細(xì)胞的增殖和死亡達(dá)到平衡，腫瘤處于休眠狀態(tài)，幾乎不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，這種狀態(tài)可能維持長(zhǎng)達(dá)數(shù)年之久。此后，在某些因素(缺氧、癌基因)的誘導(dǎo)下，血管生成因子處于上調(diào)狀態(tài)，并且(或者)血管生成抑制因子處于下調(diào)狀態(tài)，打破了兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡，使得血管生成機(jī)制處于開(kāi)啟狀態(tài)，開(kāi)始血管生成的過(guò)程。新生血管為腫瘤的繼續(xù)增殖提供了充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使腫瘤得以快速生長(zhǎng)。 絕大多數(shù)實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的生長(zhǎng)都需要有血管的生成。原發(fā)瘤的血管生成過(guò)程也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)人血液循環(huán)，轉(zhuǎn)

30、移到其它器官提供了機(jī)會(huì)，因此血管生成不僅是腫瘤生長(zhǎng)的前提條件，也是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。 與傳統(tǒng)的以腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療方法(放療、化療)相比，血管生成抑制劑以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)，具有低毒、廣譜及不易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點(diǎn)。一、血管生成抑制劑在腫瘤治療中的應(yīng)用 近年來(lái)以血管為靶點(diǎn)治療腫瘤成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，血管生成過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)都可能成為抗血管生成的潛在靶點(diǎn)。腫瘤的血管生成受到多種血管生成因子的調(diào)控，VEGF是其中作用最強(qiáng)、專(zhuān)屬性最高的血管生成因子，這使它成為抗血管生成藥物研究的熱點(diǎn)之一。目前有多種針對(duì)VEGF、VEGFR及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的藥物在研究之中，此外還開(kāi)發(fā)了多種針對(duì)其它生長(zhǎng)因子及

31、MMP的小分子藥物，其中某些已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。二、內(nèi)源性血管生成抑制因子在腫瘤治療中的應(yīng)用目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的內(nèi)源性血管生成抑制因子包括血管生成抑制素、內(nèi)皮細(xì)胞抑制素等。 以內(nèi)皮細(xì)胞抑制素為例:在以Lewis肺癌小鼠為模型的體內(nèi)抑癌實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)皮細(xì)胞抑制素使腫瘤完全消退的劑量是20mgkgd，而血管生成抑制素的用量則高達(dá)100mgkgd。內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的高效抑瘤活性使它成為第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的此類(lèi)血管生成抑制因子。 采用注射重組血管生成抑制因子的方式治療腫瘤存在某些局限性(需長(zhǎng)期用藥、重復(fù)注射、用量高、成本高、蛋白不易獲得)，所以采用血管生成抑制因子進(jìn)行基因治療的方式越來(lái)越受到重視。采用基

32、因療法治療腫瘤，基因可在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)、不需在短期內(nèi)頻繁注射、藥物用量少、成本低，較蛋白療法有更大的應(yīng)用潛力。 有人將帶有內(nèi)皮細(xì)胞抑制素基因的質(zhì)粒載體對(duì)小鼠進(jìn)行肌肉注射，觀察到血清內(nèi)皮細(xì)胞抑制素水平升高，小鼠腦轉(zhuǎn)移腫瘤生長(zhǎng)顯著減慢。三、抗血管生成療法的發(fā)展趨向 雖然已經(jīng)有數(shù)種血管生成抑制劑進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，但它們?cè)谌梭w實(shí)驗(yàn)中所顯示的抑瘤效果并不如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所顯示的結(jié)果理想，這說(shuō)明體內(nèi)特別是腫瘤的血管生成過(guò)程是一個(gè)有多種因素參與、多條信號(hào)通路調(diào)控的極其復(fù)雜的過(guò)程，單獨(dú)使用某種血管生成抑制因子或是阻斷與血管生成相關(guān)的某條信號(hào)通路并不能完全阻斷血管的生成。 如果可以嘗試將幾種作用機(jī)制不同的血管生成抑制

33、因子(如血管生成抑制素與內(nèi)皮細(xì)胞抑制素)聯(lián)合應(yīng)用，應(yīng)該會(huì)取得較單獨(dú)使用一種因子更好的效果。此外，抑制腫瘤的血管生成，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，因此將抗血管生成療法與放化療聯(lián)合應(yīng)用，有望取得更好的治療效果。 Folkman的理論為腫瘤的治療開(kāi)辟了一條嶄新的道路：抑制腫瘤的血管生成，阻斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給，可導(dǎo)致腫瘤的萎縮、退化；同時(shí)，抑制腫瘤新生血管生成，還可以阻斷腫瘤的血道轉(zhuǎn)移，抑制轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。 用血管生成抑制劑治療腫瘤具有高效、低毒的特點(diǎn)，不易產(chǎn)生耐藥性，還可以增強(qiáng)放療、化療的效果，減少放、化療的劑量，降低毒性。因此，抗血管生成療法在腫瘤的治療中有廣闊的應(yīng)用前景。 第五節(jié) 腫瘤血管生成

34、常用研究方法 第一部分 體外實(shí)驗(yàn)第二部分 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)第三部分 整體實(shí)驗(yàn)第一部分 體外實(shí)驗(yàn) 1.血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法 2.內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 3.胎盤(pán)血管培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 4.腫瘤微血管密度計(jì)數(shù) 5.連續(xù)切片三維重建 6.微血管鑄型法 7.掃描共聚焦顯微鏡三維重建 8.血管內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn) 9.小管形成實(shí)驗(yàn) 10.器官培養(yǎng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)第二部分 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)1.雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)2.角膜微囊實(shí)驗(yàn)3.海綿植入實(shí)驗(yàn)4.圓盤(pán)血管生成系統(tǒng)5.基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)6.海綿-基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)第三部分 整體實(shí)驗(yàn)1.斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?.爪蟾蝌蚪實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?.腫瘤模型第一部分 體外實(shí)驗(yàn)1.血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法 微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離方法主要有3種，包括

35、酶消化法、機(jī)械分離法和磁珠分離法，最常用的是酶消化法。 酶消化法的優(yōu)點(diǎn)是分離的細(xì)胞多，純度較高，缺點(diǎn)是酶對(duì)某些表面蛋白有破壞作用；后兩種方法可以避免酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，缺點(diǎn)是其他細(xì)胞的污染可能性較大。（下面以酶消化法為例）第一步 分離 血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離是將剪碎的組織浸泡在消化酶中，因酶的消化一般是由外向里，所以最后被消化下來(lái)的細(xì)胞才是內(nèi)皮細(xì)胞。因此，徹底地消化組織是獲得足夠微血管內(nèi)皮細(xì)胞的前提，且非血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染是不可避免的。為了能分離獲得足夠的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用過(guò)量的酶消化是必要的。第二步 細(xì)胞的純化 血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離過(guò)程中必然伴隨非血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染，因此血管內(nèi)皮細(xì)胞的純化是決定

36、血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵，也是血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)難度所在。 目前已經(jīng)建立了多種微血管內(nèi)皮細(xì)胞純化的方法。 血管內(nèi)皮細(xì)胞純化的方法主要有：1.用尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)篩過(guò)濾細(xì)胞懸液、2.物理刮除法、3.生長(zhǎng)特性選擇法、4.局部消化法、5.差速黏附法、6.免疫磁珠法等， 可以根據(jù)不同細(xì)胞的培養(yǎng)特性或生物特性選擇其中幾種方法進(jìn)行純化。 第三步 內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定 目前為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不同器官組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有共同的特異蛋白或標(biāo)志。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定大多是根據(jù)器官和組織的起源，從形態(tài)、表型、生化和功能等方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。 血管內(nèi)皮細(xì)胞一般呈單層生長(zhǎng)，有接觸抑制現(xiàn)象，呈典型的鋪路石狀，電鏡下可

37、以看到Weibel-Palade小體。其表面可以表達(dá)CD31、CD34、凝血調(diào)節(jié)蛋白和第因子等，可以攝取低密度脂蛋白，產(chǎn)生前列腺素(PGI2和PGE2)，表達(dá)E-選擇素，內(nèi)吞功能，結(jié)合植物血凝素，形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)。 不管利用那種方法，培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞都可根據(jù)某些特征進(jìn)行鑒定。內(nèi)皮細(xì)胞可以利用其表面表達(dá)血管緊張素合成酶、攝取乙?；兔芏戎鞍准暗谝蜃拥谋磉_(dá)進(jìn)行鑒定。 內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)條件下可以形成管形，像原始血管形成或損傷后血管再生，這被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞獨(dú)有的特征。但有報(bào)道說(shuō)培養(yǎng)的上皮也可以形成管形。因此，一般情況下研究者們采用最有利的方法獲得高純度的內(nèi)皮細(xì)胞，并用多種方法進(jìn)行鑒定。 血管內(nèi)皮細(xì)胞的

38、培養(yǎng)要點(diǎn) 根據(jù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，需要采用一些特殊的培養(yǎng)條件，并且這些培養(yǎng)條件可能因?yàn)檠軆?nèi)皮細(xì)胞的起源不同而有所差異。血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)一般選用DMEM、M199等基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加150 mL/L200 mL/L的胎牛血清、1000單位/mL雙抗，20 g/L谷氨酰氨，還需添加內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(一般添加濃度為1%)。根據(jù)其接觸抑制現(xiàn)象需及時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 2.內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖檢測(cè) 血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是血管發(fā)生的重要步驟。目前,已有多種成熟的細(xì)胞增殖測(cè)定方法,如四氮唑鹽還原法和3H -胸腺嘧啶摻入法等細(xì)胞增殖測(cè)定方法。 2.1.1 四氮唑鹽還原法(又稱(chēng)MTT 比色法) 是一種最

39、常用的檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶使外源性MTT 還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。MTT 結(jié)晶形成量與細(xì)胞數(shù)成正比。 該方法已被用于檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,并廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。2.1.2 3H -胸腺嘧啶摻入法 是一種更好的測(cè)定細(xì)胞增殖的方法。將同位素氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)作為DNA 合成的前體摻入到增殖細(xì)胞中,通過(guò)放射自顯影觀察細(xì)胞增殖情況。血管生成調(diào)控因子（生長(zhǎng)/抑制因子）的檢測(cè) 血管生成調(diào)控因子很多，但多數(shù)都是蛋白質(zhì)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和需要可以從核酸水平或蛋

40、白質(zhì)水平進(jìn)行檢測(cè):血管生長(zhǎng)（抑制）因子核酸水平檢測(cè)RT-PCR檢測(cè)血管生長(zhǎng)（抑制）因子的mRNA表達(dá)：是以RNA為起始膜板產(chǎn)生cDNA,再以cDNA為膜板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。（略） 血管生長(zhǎng)（抑制）因子蛋白質(zhì)水平檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）定義：用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原的方法。 用于檢測(cè)體液中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)（抑制）因子。分類(lèi)：間接法（Indirect ELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗檢測(cè)液相中未知抗體雙抗體夾心法（Sandwich ELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測(cè)液相中的可溶性抗原競(jìng)爭(zhēng)法（C

41、ompetitive ELISA) ：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液相中的可溶性抗原或抗體免疫組織化學(xué)/免疫熒光標(biāo)記（定位或半定量）免疫組織化學(xué)（略）免疫熒光組織化學(xué)原理：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來(lái)的低能態(tài)，這時(shí)發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），用熒光顯微鏡可見(jiàn)熒光所在的組織或細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和

42、定位，以及用定量技術(shù)測(cè)定含量。免疫印記（Western blot）基本原理: 免疫印跡又稱(chēng)Western印跡(Western blot)，與DNA的Southern印跡技術(shù)相對(duì)應(yīng)，兩種技術(shù)均把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相載體(通常為NC膜)，然后用探針檢測(cè)特異性組分。不同的是，Western blot所檢測(cè)的是抗原類(lèi)蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)。 該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測(cè)定特異敏感等諸多優(yōu)點(diǎn)，具有從復(fù)雜混合物中對(duì)特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測(cè)，以及從多克隆抗體中檢測(cè)出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免

43、疫分析的水平而無(wú)需對(duì)靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。 Western blot的過(guò)程分四階段:a.蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測(cè)定b. SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDSPAGE） c.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜)d.靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)(雜交)定性和定位免疫組織化學(xué)/免疫熒光標(biāo)記定量 ELISA和Western blot 3.胎盤(pán)血管培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)：該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒恍枰油庠葱陨L(zhǎng)因子，該模型是篩選人類(lèi)血管生成潛在激活增強(qiáng)因子和抑制因子行之有效的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?shí)驗(yàn)步驟：（1）從剖腹產(chǎn)手術(shù)24小時(shí)之內(nèi)的人胎盤(pán)頂端表面截取約長(zhǎng)25cm，直徑為l2mm的表淺血管，洗去血污，浸入Hank平衡鹽溶液中。 （2）將血管培養(yǎng)在4

44、8孔培養(yǎng)板中，可在孔中分別加入各種血管生成因子，再加l99培養(yǎng)基，將血管片段在凝固前迅速加入培養(yǎng)孔中央，理想的是使血管片段懸浮于培養(yǎng)膠中。 （3）然后將培養(yǎng)板置37保濕孵育培養(yǎng)1421天，每周換培養(yǎng)基2次。（4）用減數(shù)成像系統(tǒng)計(jì)算原來(lái)血管條生成的血管索數(shù)量，每隔一天計(jì)數(shù)新生長(zhǎng)形成的微血管條數(shù)，由此描繪微血管生長(zhǎng)曲線。（5）用免疫組化、流式細(xì)胞儀、電鏡等分別檢測(cè)了CD34，Weibel-Palade小體標(biāo)志物等， 證實(shí)新生血管中含有內(nèi)皮細(xì)胞。 4.腫瘤微血管密度計(jì)數(shù)(MVD) 用CD31或CD34等抗體在組織切片上對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記,血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色 。 MVD計(jì)數(shù)：先在低

45、倍視野內(nèi)找到微血管密度最高的區(qū)域，然后在高倍視野內(nèi)計(jì)數(shù)微血管的數(shù)目。分辨不清或染色模糊的細(xì)胞不計(jì)入結(jié)果，單個(gè)的棕黃色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇作一個(gè)血管計(jì)數(shù)，但肌層較厚及血管腔面積8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管不計(jì)數(shù)。計(jì)5個(gè)視野的MVD，取其平均值作為MVD。MVD可以作為腫瘤血管生成的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，提示腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。 5.連續(xù)切片三維重建法 物體切片二維參數(shù)為人們提供了物體某一截面的二維信息。如果將物體不同截面上的二維圖像按照截面的空間關(guān)系依次排列，便可組成物體的三維數(shù)據(jù)。連續(xù)切片的計(jì)算機(jī)三維重建技術(shù)是對(duì)某一結(jié)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)超薄切片，然后把這一系列切片的圖像，通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理，從而得到該結(jié)構(gòu)的立體形態(tài)的

46、一種方法。在利用計(jì)算機(jī)圖像處理理論、圖形生成理論以及視覺(jué)心理學(xué)，在二維平面上形象地顯示物體的三維圖像，這就是計(jì)算機(jī)三維重建過(guò)程。該技術(shù)包括：1.連續(xù)切片技術(shù)2.二維圖像的處理技術(shù)3.三維重建技術(shù) 6.微血管鑄型法原理：將鑄型材料（聚甲基丙烯酸甲酯）灌注到動(dòng)物體內(nèi)（生前經(jīng)左心室插入導(dǎo)管至升主動(dòng)脈），灌注12-24小時(shí)后處死動(dòng)物，10%福爾馬林固定2-3天后，用24%鹽酸腐蝕掉組織（留下血管），離子鍍膜機(jī)鍍金， 掃描電鏡下觀察微血管情況。 微血管鑄型材料采用聚甲基丙烯酸甲酯。 聚甲基丙烯酸甲酯是一種高分子合成樹(shù)酯, 它是由甲基丙烯酸甲酯通過(guò)聚合反應(yīng)生成, 單體是液態(tài), 聚合體是固態(tài)。 聚合反應(yīng)過(guò)程

47、分為引發(fā)、 發(fā)展和終止階段。 單體加入引發(fā)劑后, 產(chǎn)生活化中心, 即為引發(fā)階段放射性骨壞死邊緣的微血管鑄型圖 7.激光掃描共聚焦顯微鏡三維重建法 激光掃描共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，把光學(xué)成像的分辨率提高了30%40%，使用紫外或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca 2+ 、pH值，膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。 激光共聚焦成像系統(tǒng)能夠用于觀察各種染色、非染色和熒光標(biāo)記的組織和細(xì)胞等，能夠進(jìn)行活體細(xì)胞中離子和

48、PH值變化研究，神經(jīng)遞質(zhì)研究，熒光原位雜交研究（FISH），細(xì)胞骨架研究，基因定位研究，原位實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物分析，熒光漂白恢復(fù)研究（FRAP），胞間通訊研究，蛋白質(zhì)間研究，膜電位與膜流動(dòng)性等研究，完成圖像分析和三維重建等分析。 共聚焦顯微鏡的分辨率超過(guò)普通光學(xué)顯微鏡，染色過(guò)程簡(jiǎn)便，可以在活細(xì)胞上進(jìn)行無(wú)創(chuàng)傷性的染色，最大程度地維持細(xì)胞的正常形態(tài)。多種自發(fā)性的熒光染料，已被廣泛地用于諸如RNA、DNA細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)的標(biāo)記。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，將不同波長(zhǎng)的兩三種熒光物質(zhì)標(biāo)記在內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)的相應(yīng)抗體上，以這幾種熒光物質(zhì)特定的光譜特性選擇激發(fā)光和濾光片，則可以觀察到細(xì)胞內(nèi)部各

49、結(jié)構(gòu)間的毗鄰關(guān)系。共聚焦顯微鏡生成厚度小于微米的依次相連的光學(xué)切片，即使較厚的組織的三維數(shù)據(jù)也可被計(jì)算機(jī)獲取，運(yùn)用適當(dāng)?shù)膱D像分析軟件，可以測(cè)量并確定所觀察結(jié)構(gòu)的表面特征，體積等參數(shù)，為相互結(jié)合定量測(cè)量提供了新手段。 激光掃描共聚焦顯微鏡可以將各層面的微血管圖像進(jìn)行三維重建和處理。從而，可以分析微血管的三維立體特征及其空間關(guān)系。 8.血管內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)壳埃瑢?duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響，已經(jīng)有很多有效的測(cè)定方法。其中以改良的Boyden Chamber 或Transwell 法最常用。這些方法均是通過(guò)觀測(cè)穿過(guò)一定孔徑(如8 m) 硝酸纖維素薄膜的細(xì)胞數(shù)量,確定細(xì)胞遷移能力。8.1 Boyden Cha

50、mber 實(shí)驗(yàn):Boyden室由兩層組成,兩層之間為膠原包被的多孔的多聚碳酸鹽濾膜;血管內(nèi)皮細(xì)胞放于上層,同時(shí)加入待測(cè)藥物,共同培養(yǎng)6h后,除去上層的細(xì)胞,下層細(xì)胞用甲醇固定, HE染色,光鏡下計(jì)算下層的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。該方法優(yōu)點(diǎn)在于它對(duì)藥物濃度梯度差異很敏感。但對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高且計(jì)數(shù)方法不同可能會(huì)造成統(tǒng)計(jì)結(jié)果誤差較大。因此有必要建立一個(gè)嚴(yán)格的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)以減少因方法不同產(chǎn)生的誤差。8.2 Transwell實(shí)驗(yàn)：這項(xiàng)技術(shù)的主要材料是 Transwell小室，其外形為一個(gè)可放置在孔板里的小杯子，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，可有不同選擇。其關(guān)鍵部分都是一致的，那就是杯子底層的一張有通透性的膜，而杯子其余部分的材

51、料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有微米，根據(jù)不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜。將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱(chēng)上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱(chēng)下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。 將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。 應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。 劃痕損傷實(shí)驗(yàn)： 在國(guó)外出現(xiàn)較早。用移液器滴頭或刀片在單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)皿上劃痕，為邊緣內(nèi)皮細(xì)胞遷移提

52、供一裸露區(qū)域。經(jīng)過(guò)創(chuàng)傷后邊緣的單層內(nèi)皮細(xì)胞可遷移至創(chuàng)傷區(qū)域，并重新形成新的單層內(nèi)皮細(xì)胞層。在光鏡下計(jì)數(shù)從損傷邊緣遷移出的細(xì)胞數(shù)和遷移的相對(duì)距離，并計(jì)算出細(xì)胞的實(shí)際遷移距離。然而這種方法的定量具有任意性。 9.小管形成實(shí)驗(yàn)小管形成實(shí)驗(yàn)?zāi)苣M人體內(nèi)毛細(xì)血管生成的過(guò)程,包括內(nèi)皮細(xì)胞出芽增殖和毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)形成等步驟,接近人體內(nèi)血管生成的實(shí)際過(guò)程。內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠、纖維蛋白膠、膠原等基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。用電子顯微鏡來(lái)分析小管間的緊密連接,從而定量血管生成情況。 實(shí)驗(yàn)一般采用24孔培養(yǎng)板,但它底面積大，Matrigel 用量多,計(jì)數(shù)區(qū)域大只能隨機(jī)選擇幾個(gè)典型區(qū)域且數(shù)據(jù)分析耗時(shí)長(zhǎng)。 Sanz等采用

53、384孔和536孔培養(yǎng)板培養(yǎng)可節(jié)約膠的用量,借助計(jì)算機(jī)可以計(jì)算整個(gè)孔的小管及小管之間的連接數(shù)及小管的長(zhǎng)度和面積。改進(jìn)方法后減少了原來(lái)分析困難及重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)。10.器官培養(yǎng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)極大地推進(jìn)了對(duì)血管形成的測(cè)定。器官血管形成測(cè)定法包括鼠主動(dòng)脈環(huán)、雞主動(dòng)脈弓、豬頸動(dòng)脈、胎兒鼠骨移植測(cè)定法等。這些測(cè)定法非常相似，其中鼠主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定應(yīng)用最為廣泛。 取下大鼠主動(dòng)脈后,剪成1 mm寬的血管環(huán),再用纖維蛋白膠或膠原蛋白膠包埋,然后以無(wú)血清的MCDB131培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中每天計(jì)算主動(dòng)脈環(huán)產(chǎn)生的新生微血管數(shù)并進(jìn)行定量分析。用不同膠培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈環(huán)新生血管的生長(zhǎng)曲線不同。膠原包埋的主動(dòng)脈環(huán),培

54、養(yǎng)1 周時(shí)血管數(shù)達(dá)到頂峰,第2 周開(kāi)始萎縮。2002年有人將此方法改進(jìn),采用更薄的膠層包埋動(dòng)脈環(huán)使得新生成血管染色更方便;應(yīng)用雙重染色法和共聚焦顯微鏡在同一層面上觀察到內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞及外周細(xì)胞共同存在并證明了新生血管主要由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成。 動(dòng)脈環(huán)取材范圍廣泛,觀察方法簡(jiǎn)單,可從分子水平闡明血管生長(zhǎng)的分子調(diào)控機(jī)制,是一個(gè)較好的體外血管生成模型。第二部分 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)1.雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)2. 角膜微囊實(shí)驗(yàn)3.海綿植入實(shí)驗(yàn)4.圓盤(pán)血管生成系統(tǒng)5.基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)6.海綿-基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)1. 雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)(CAM)特點(diǎn)：1.方法簡(jiǎn)便且成本低，儀器設(shè)備條件要求不高；2.易于操作，便于推廣；3.可用于進(jìn)行

55、大樣本研究，4.可用于影響血管生成因素或藥物的篩選和評(píng)價(jià)。雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)主要步驟：(1)雞胚準(zhǔn)備和接種組織：(2)組織接種： (3)接種組織的收獲與觀察： CAM血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠猛荆簷z測(cè)評(píng)價(jià)接種物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析研究血管生成促進(jìn)因子、抑制因子的活性和作用的檢測(cè)，如腫瘤血管生成的研究等；對(duì)接種物，如腫瘤組織、自身的血管生成進(jìn)行研究，用于分析不同組織的血管生成活性和作用，如腫瘤組織有引發(fā)新生血管生成的作用。對(duì)照抗血管生成藥物作用以后2. 角膜微囊實(shí)驗(yàn)1.動(dòng)物模型：46周齡雄性裸小鼠。在手術(shù)顯微鏡下，裸鼠角膜建立一個(gè)1.5mm0.8 mm大小的微囊。將腫瘤

56、組織切成小塊，然后接種于微囊中，建立裸鼠角膜微囊移植模型。2.實(shí)驗(yàn)分組：分處理組和對(duì)照組。3.角膜新生血管的觀察與定量研究：手術(shù)后第3、5、7、9、12、15、18、21d，應(yīng)用體視顯微鏡，動(dòng)態(tài)觀察角膜微囊內(nèi)腫瘤誘導(dǎo)的血管生成情況，顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)記錄觀察結(jié)果。 根據(jù)新生血管的數(shù)目及生長(zhǎng)速度確定新生血管的活性。按照Z(yǔ)iche法定量計(jì)算角膜新生血管的積分，即新生血管積分=血管密度血管長(zhǎng)度。血管密度指數(shù)1相當(dāng)于025條血管/角膜、2相當(dāng)于2550條血管/角膜、3相當(dāng)于5075條血管/角膜、4相當(dāng)于75100條血管/角膜、5相當(dāng)于100條血管/角膜。將角鞏膜緣到角膜中心（瞳孔）的距離分成5等份，以圓周到圓心的距離為5，計(jì)算新生血管長(zhǎng)度。3.海綿植入實(shí)驗(yàn)1987年有人提出海綿植入實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>