第一章 微生物檢驗(yàn)鑒定技術(shù)001

1、第一章 微生物檢驗(yàn)鑒定技術(shù)001本章提綱第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)與操作第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)第三節(jié) 食品微生物檢驗(yàn)新技術(shù)第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)與操作 包括顯微鏡檢、染色技術(shù)、培養(yǎng)基制備技術(shù)、接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)等。第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)一、接種（inoculation）將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程叫做接種。 . 接種工具 1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀Inoculation is the placement of something to where it will grow or re

2、produce, and is most commonly used in respect of the introduction of a serum, vaccine, or antigenic substance into the body of a human or animal, especially to produce or boost immunity to a specific disease; but also can be used to refer to the communication of a disease to a living organism by tra

3、nsferring its causative agent into the organism, to implant microorganisms or infectious material into a culture medium such as a brewers vat or a petri dish.第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)一、接種2. 常用的接種方法 有以下幾種：）劃線接種 最常用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。）三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀察、

4、研究它們的形態(tài)。）穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常用。用的接種工具是接種針。培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基）傾注接種 該法是將待接種微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，以達(dá)到稀釋菌液的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)一、接種2. 常用的接種方法）涂布接種 先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布，使菌液均勻分布，即可長(zhǎng)出單個(gè)菌落。）液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中；或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，都屬于液體接

5、種。）注射接種 用注射的方法將微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，常見(jiàn)的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種。）活體接種 是專用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式有注射、灌喂、拌料喂養(yǎng)等。第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)一、接種3. 無(wú)菌操作(Aseptic technique) 培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無(wú)菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。 在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作。 Aseptic techniqueAseptic tech

6、nique is a set of specific practices and procedures performed under carefully controlled conditions with the goal of minimizing contamination by pathogens.Purpose:Aseptic technique is employed to maximize and maintain asepsis, the absence of pathogenic organisms in the clinical setting and to preven

7、t the spread of pathogens. Often, practices that clean (remove dirt and other impurities), sanitize (reduce the number of microorganisms to safe levels), or disinfect (remove most microorganisms but not highly resistant ones) are not sufficient to prevent infection.針尖上的細(xì)菌第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化（Isolatio

8、n）含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)（Pure culture）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱為分離純化，方法有許多種。第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化、傾注平板法 ( Pour plate )第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化、涂布平板法, Spread plate 第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化、平板劃線法, Streak plate 常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。 Str

9、eak plate 第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化、富集培養(yǎng)法 富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它微生物。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長(zhǎng)。通過(guò)多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)二、分離純化、厭氧法在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把它放在沸水浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無(wú)菌石蠟于培養(yǎng)基表面，使與空氣隔絕。另一種

10、方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。 第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)三、培養(yǎng) 1、根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)。好氧培養(yǎng)(Aerobic Incubation) ：也稱“好氣培養(yǎng)”。厭氧培養(yǎng)(Anaerobic Incubation)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。第一節(jié) 微生物檢驗(yàn)基本知識(shí)三、培養(yǎng) 、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。固體培養(yǎng)：solid incubation液體培養(yǎng)：liquid incubation

11、 第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察二、生理生化試驗(yàn)三、血清學(xué)試驗(yàn)第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過(guò)染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。 2、微生物培養(yǎng)特性觀察E. Coli (G-)綠膿桿菌單鞭毛S. aureus (G+)梭狀芽孢桿菌曲霉青霉酵母炭疽芽孢革蘭染色法，丹麥病理學(xué)家 創(chuàng)立（1884 ） （1）涂片： （2）晾干： （3）固

12、定（4）結(jié)晶紫色染色：1min。 水洗（5） 媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。 水洗（6） 脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色2025s至流出液無(wú)色，立即水洗。（7） 復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min。水洗（8） 晾干：晾干或者用吸水紙吸干。（9） 鏡檢：先用低倍，再用高倍，最后用油鏡。（10）實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：浸過(guò)油的鏡頭：a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。細(xì)菌染色玻片用廢擦鏡紙將香柏油擦干Grams staining第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察1、微生物的形態(tài)

13、結(jié)構(gòu)觀察2、微生物培養(yǎng)特性觀察微生物培養(yǎng)特性的觀察是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。 ）細(xì)菌的培養(yǎng)特征 包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長(zhǎng)情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。 細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)性狀觀察A.深濁度：觀察是否透明、輕度渾濁、中度渾濁或極度渾濁，還有均勻渾濁、顆粒狀渾濁、絮狀渾濁。B.沉淀：試管底有無(wú)沉淀，沉淀物呈顆粒狀、粘稠狀或絮狀。輕搖時(shí)云霧狀、絮狀或發(fā)辮狀升起。C.表面：有無(wú)菌膜及附著于管壁的菌環(huán)D.色素及氣味細(xì)胞在

14、固體培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)性狀觀察A.大?。壕渲睆皆?mm以下為露滴狀菌落；1-2mm為小菌落；2-4為中等大菌落；4-6mm或更大為大菌落。B.形狀：有圓形，有規(guī)則形、根足形、菌絲狀等C.邊緣：有整齊、鋸齒狀、纖毛狀、卷發(fā)狀等D.表面：有光滑、濕滑、粗糙、顆粒狀、皺絲狀、同心狀、放射狀等E.降起度：有角平、隆起、臍狀、扭扣狀F.顏色：有無(wú)色、白色、灰白色、金黃色、檸檬色、綠色、紅色等G.透明度：有透明、半透明、不透明等一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察2、微生物培養(yǎng)特性觀察 ）細(xì)菌的培養(yǎng)特征 ）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒(méi)有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，

15、只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面形成菌膜。 霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(zhǎng)，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無(wú)限伸長(zhǎng)沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。 第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)二、生理生化試驗(yàn)微生物生化反應(yīng)：指用化學(xué)反應(yīng)來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有： 糖或醇類

16、發(fā)酵試驗(yàn) 淀粉水解試驗(yàn) V-P試驗(yàn) 甲基紅（MR）試驗(yàn) 靛基質(zhì)（Indole）試驗(yàn) 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 硝酸鹽還原試驗(yàn) 明膠液化試驗(yàn) 尿素酶（Urease）試驗(yàn) 氧化酶試驗(yàn) 硫化氫（H2S）試驗(yàn) 三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn) 氨基酸脫羧酶的測(cè)定 耐鹽性試驗(yàn) 卵磷脂酶的測(cè)定 石蕊牛奶反應(yīng) 酪蛋白水解 苯丙氨酸脫氨試驗(yàn) 氰化鉀試驗(yàn) 對(duì)疊氮化鈉的抗性 硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（SIM）瓊脂試驗(yàn) 含碳化合物的利用（檸檬酸鹽或丙酸鹽利用）Biochemical and Metabolic Properties of MicrobesMicroorganisms can be classified, or disti

17、nguished from one another, by the ability to (1) grow on different substrates and/or production of different end products, (2) produce specific enzymes, (3) use oxygen, or (4) be motile. For example, certain microbes can use different carbohydrates as sources of energy and/or carbon.Because such var

18、iability exists in carbohydrate utilization between different microbes, this can aid in the group, genus, or species identification. 第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)三、血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來(lái)鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。 在細(xì)菌的檢測(cè)中，應(yīng)用最多的是凝集試驗(yàn)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。Serological testing Serology is a m

19、edical blood test to detect the presence of antibodies against a microorganism. Certain microorganisms (antigens) stimulate the body to produce antibodies during an active infection. 血清學(xué)試驗(yàn)的一般特點(diǎn)：1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。3)抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。4)血清學(xué)

20、反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無(wú)嚴(yán)格界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見(jiàn)階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長(zhǎng)時(shí)間。而且，在第二階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)三、血清學(xué)試驗(yàn)、凝集反應(yīng)（Agglutination reaction） 顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反應(yīng)中，因?yàn)閱挝惑w積抗

21、體量大，做定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)稀釋抗體。）直接凝集反應(yīng)：a. 玻片凝集法； b. 試管凝集法 ）間接凝集反應(yīng) 第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)三、血清學(xué)試驗(yàn)、凝集反應(yīng)（Agglutination reaction）、沉淀反應(yīng)（Precipitation test） 可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原，抗體為沉淀素。由于在單位體積內(nèi)抗原量大，為了不使抗原過(guò)剩，故應(yīng)稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。）環(huán)狀沉淀反應(yīng) ）絮狀沉淀反應(yīng)）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)三、血清學(xué)試驗(yàn)、凝集反應(yīng)（Agglutina

22、tion reaction）、沉淀反應(yīng)（Precipitation test）、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(Complement fixation reaction) 補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無(wú)特異性，能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而引起反應(yīng)。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象; 如果與細(xì)菌及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此，如果出現(xiàn)溶菌，說(shuō)明抗原抗體是相對(duì)應(yīng)的（試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性）；如果出現(xiàn)溶血，說(shuō)明抗原抗體不相對(duì)應(yīng)（陰性）。此反應(yīng)操作復(fù)雜，敏感性高，特異性強(qiáng)，能測(cè)出少量抗原和抗體，所以應(yīng)用范圍較廣。 第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術(shù)三、血清學(xué)試驗(yàn)、凝集反應(yīng)（Agglutination reaction）、沉淀反應(yīng)（Precipitation test）、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(Complement fixation reaction)其它方法：熒光抗體技術(shù)ELISA免疫組化 。第三節(jié) 食品微生物檢驗(yàn)新技術(shù)微生物檢驗(yàn)新方法1 檢查某些細(xì)菌的專有酶及