葉綠體的提取和希爾反應(yīng)活性檢測

1、青菜與菠菜葉綠體的希爾反應(yīng)活性研究摘要 本實驗研究了青菜和芹菜的希爾反應(yīng)活性。實驗分別測定了青菜葉綠體和菠菜葉綠體的OD620 值。通過OD620值變化反映出了葉綠體的希爾反應(yīng)活性，對青菜的葉綠體和菠菜的葉綠體希爾反應(yīng)活 性進行了比較，通過比較發(fā)現(xiàn)青菜的葉綠體希爾反應(yīng)的活性比菠菜的葉綠體希爾反應(yīng)活性要高一點。 并且還利用顯微鏡測定了葉綠體的大小。關(guān)鍵詞：青菜；菠菜；葉綠體；希爾反應(yīng)活性葉綠體的大小葉綠體是植物細胞光合作用的場所，對植物的生長有著重要的作用。葉綠體的光合作用 活性直接關(guān)系到植物的生長是否良好，對植物的生長等各方面有著很重要的影響。通過本次 實驗我們利用在等滲溶液中運用差速離心法將

2、青菜和芹菜的葉綠體分離出來。并且比較他們 葉綠體活性，對這兩種植物的希爾反應(yīng)活性有了一個比較基本的了解。1材料與方法1.1.1材料青菜，菠菜1.1.2試劑與儀器離心機、分光光度計、光照培養(yǎng)室、冰塊、提取介質(zhì)、0.5mol/L蔗糖、10mmol/L Nacl； 10mmol/L2.6-DCIP（2,6-二氯靛酚）溶液；2% Triton X-100。1.2 方法1.2.1提取葉綠體。兩個小塑料盆中裝上冰塊，一只裝半盆冰，取一個冷凍的研缽放入 小盆中。另一只小塑料盆裝滿冰塊，將離心管插入其中冷卻。稱取5克新鮮青菜葉片或芹菜 葉片，剪成碎片放入研缽中。加10mL預(yù)冷的提取介質(zhì)和少許石英砂，在冰浴中迅

3、速研磨成 勻漿，補加5mL提取介質(zhì)。從冰箱中取出一只預(yù)冷的漏斗和離心管，在漏斗上裝4層紗布， 把勻漿倒在紗布上，讓勻漿過濾到一只預(yù)冷的離心管中，并擠出紗布中的勻漿液，收集10mL 勻漿與離心管中（為了保證葉綠體的活性，各步驟都要在冰浴條件下進行）。室溫下800rpm離心3min，離心后將上清液倒入另一只預(yù)冷的離心管中。沉淀物是細胞 碎片、石英砂和細胞核。上清液在室溫下2000rpm離心8 min，棄上清液，沉淀物主要為葉 綠體。在離心管中，用6mL提取介質(zhì)懸浮沉淀物2,得到葉綠體提取液置冰浴中備用。取 2mL葉綠體提取液于一支預(yù)冷的試管中，加入10mL提取介質(zhì)，即為1： 6稀釋的葉綠體稀 釋液

4、，使葉綠體稀釋液在660nm處的OD值達1.0左右。1.2.2顯微測微尺測量葉綠體的大小。物鏡調(diào)整到40倍下，目鏡測微尺每格長度2.5um。 測量5次，記錄測量結(jié)果（菠菜和青菜的都要測）。1.2.3葉綠體希爾反應(yīng)活性的測定。取5只試管，編號為1、2、3、4、5，按下表進 行預(yù)處理：管號提取介質(zhì)（mL）葉綠體稀釋液（mL）預(yù)處理2，6-DCIP （到分光光度計室加入）12.522.52.5（青菜）1滴32.52.5（青菜）沸水浴5min1滴42.52.5（青菜）5 滴 2%TritonX-1滴100 作用 5min52.52.5 （芹菜）1滴第一管作為分光光度計調(diào)零管。當?shù)?、第3、第4、第5管

5、中加入2, 6-二氯靛酚后立 即搖勻。在分光度計室加入DCIP,加入DCIP后立即測量OD值，迅速測定620nm處的OD值，此即代表作用時間為0min時的OD值。將比色杯置于日光燈下照光，每隔3min快速讀下 OD值，連續(xù)進行光照和度數(shù)，直至OD值變化趨于穩(wěn)定為止。2結(jié)果與分析2.1.由下表可以得出青菜的葉綠體的平均長度為6.5um,平均寬度為2.5um.芹菜的葉 綠體平均長度為5.5um.平均寬度為3.75um.可以看出青菜的葉綠體比較長，而芹菜的葉綠體 則相對比較圓。表1青菜的葉綠體大小表2芹菜的葉綠體大小葉綠體長度(um)寬度(um)葉綠體長度(um)寬度(um)15.02.515.02

6、.527.52.526.253.7537.52.535.03.7545.02.546.25557.52.555.03.75平均值6.52.5平均值5.53.752.2葉綠體的希爾反應(yīng)活性 由于葉綠體是通過光反應(yīng)(希爾反應(yīng))中產(chǎn)生的質(zhì)子 還原DCIP，是原來藍色的DCIP變?yōu)闊o色，并通過OD值的變化來反映。單位時間內(nèi)OD值 的變化(斜率)可以反應(yīng)光合作用產(chǎn)物H的產(chǎn)量高及葉綠體活性的大小。通過OD值的變化 我們可以看出，在06min，青菜的葉綠體希爾反應(yīng)的斜率為一0.11.芹菜的葉綠體希爾反 應(yīng)的斜率一0.03.青菜的斜率的絕對值明顯大于芹菜?？梢缘贸銮嗖吮惹鄄说南柣钚源?。其 中有兩組青菜的葉綠體因為受到破壞而表現(xiàn)出沒有變化，這是由于煮沸、2%TritonX- 100作 用時葉綠體的結(jié)構(gòu)等遭到破壞，使數(shù)據(jù)沒有變化。討論3.1 .由結(jié)果可以看出，青菜的葉綠體希爾反應(yīng)活性大約是芹菜的3倍。但是他們的葉綠 體大小相差不大。是不是葉綠體的含量所造成的差異有待進一步研究。參考文獻張紅鋒，細胞生物學實驗探究M.上海：華東師范大學出版社，2011.程霞英，楊