葉綠素測定分光光度法

1、葉綠體色素含量的測定一一分光光度法葉綠體色素含量的測定一一分光光度法葉綠體色素溶液各組成成分在可見光 譜中具有不同的特征吸收峰。因此，應(yīng)用分光光度計在某一特定波長下所測定的 吸光度，根據(jù)經(jīng)驗公式即可計算出色素溶液中各色素濃度，不同溶劑所提取的色 素吸收光譜有差異，因此，應(yīng)使用不同的計算公式。葉綠體色素的提取常用丙酮和乙醇有機溶劑。葉綠體色素80 %丙酮提取液中 葉綠素a和b及類胡蘿卜素分別在663nm、646nm和470nm波長下有 最大吸收峰，而95 %乙醇提取液中它們則在665nm石49nm和470nm波 長下具有最大吸收峰，據(jù)此所測得的吸光度值代人不同的經(jīng)驗公式（見結(jié)果計 算），計算出葉

2、綠體色素丙酮（或乙醇）提取液中葉綠素a和b的濃度及其 葉綠素總濃度和類胡蘿卜素的總濃度，并依據(jù)所使用的單位植物組織（鮮重、干 重或面積），求算出色素的含量。實驗?zāi)康恼莆辗止夤舛确▽χ参锶~綠體色素提取液中葉綠素a和b的濃度及其葉綠素 總濃度和類胡蘿卜素的總濃度測定與計算方法，以及植物材料中各種色素含量的 求算方法。器材和試劑.植物材料 新鮮（或烘干）植物葉片，如菠菜葉片等。.實驗器材分光光度計、天平、研缽、剪刀、漏斗、濾紙、棕色容量瓶、吸 水紙、擦鏡紙和滴管。.實驗試劑80 %丙酮（或95 %乙醇）、石英砂和碳酸鈣粉。操作步驟.色素的提取稱取新鮮（或干材料）的洗凈擦于的植物葉片0.5g （或一定

3、面積），去中脈、 剪碎后放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及23ml80 %丙酮（或95 %乙 醇），冰浴中研磨至組織變白，再加丙酮10ml，研成勻漿，暗處靜置約10m in。將提取液過濾到50 ml棕色容量瓶中，用丙酮反復(fù)沖洗研體與研棒數(shù)次并用 少量丙酮反復(fù)沖洗濾紙和殘渣，直至無綠色為止，以使色素全部轉(zhuǎn)移入容量瓶。最后用丙酮定容至50 ml ,搖勻，并保存于暗處備用待測。每一材料要做3 5份，重復(fù)提取測定，以期獲得準確的色素含量值。.吸光度的測定將色素提取液重新混勻。取光徑1cm的比色杯，注入上述色素丙酮提取液，以80 %丙酮注入另一同 樣的比色杯內(nèi)作為空白對照，在波長663、646和470

4、nm下測定吸光度（、和）。.結(jié)果計算依據(jù)下列丙酮（或乙醇）提取液中色素濃度計算公式，分別計算出葉綠素a上 的濃度及其葉綠素總濃度和類胡蘿卜素的濃度。80 %丙酮提取液中色素濃度計算公式：12.214-2.81446C20.1346 - 5.034% = 4 + 閂=17.32 編7.18&必= （1000A70-3.27Ca-104CJ/22995 %乙醇提取液中色素濃度計算公式：/ =13.9沮兌-6.8御心烏= 2496編廠7處盛 = + =18.08-6.63= （100070 - 2.05-114.8）/245式中，、和分別為葉綠素a和b的濃度及其葉綠素總濃度，mg L -1 ；為類胡

5、蘿卜素的總濃度，mg L -1 ；&矛 -665 -646 *侮和470為葉綠體色素提取液在波長663nm、665nm、646nm、649nm和470 nm下的吸光度。再按下式求算植物組織中單位鮮重(或十重、面積)各色素的含量(mg g -1或 mg m -2)。葉綠體色素的含量=色素的濃度出 S) X提取液體積(*稀釋倍數(shù)樣品鮮重f或干重、面積.占或狀少注意事項.光對葉綠素有破壞作用，實驗操作應(yīng)在弱光下進行，且應(yīng)盡量在短時間內(nèi)研 磨。.色素提取液若混有其他物質(zhì)而造成渾濁，將影響吸光度的測定，應(yīng)重新過濾 或離心。.色素吸光度測定前，應(yīng)按儀器說明及標準葉綠素a、b對分光光度計的 波長進行校正，否則影印葉綠素含量的測定精度。思考題1葉綠素a和b在紅光和藍光區(qū)都有吸收峰，可否在藍光區(qū)的吸收峰波長下 進行葉綠素a和b的定量分析，原因何在？2解釋用分光光度法測定葉綠素含量時首先標定儀器波長精確度的原因，試比較 儀器標定與未標定的測定結(jié)果的誤差。探索性實驗應(yīng)用已掌握的植物葉綠體色素的提取、分離和含量測定的實驗技術(shù)與方法，取植物和植物（或陰生植物和